저자는 Xvivo 동봉 된 세포 배양 시스템, 특히 매트 프리먼를 사용하는 학습에서의 도움을 Biospherix에서 직원을 인정하고 싶습니다; 마일즈 &amp; 켈리 건설 회사, 실험실 인프라, 특히 러스 휴즈를 설정에서 자신의 작품에 대한 Inc.의 직원; 실험실 리모델링, 특히 아담 Lukhard와 데빈 Hugie 조정에 업무 시설 및 지원 서비스의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 데이터 관리 인프라 및 원격 액세스, 특히 베트남 트란을 설정하는 그들의 도움에 대한 정보 시스템의 오렌지 카운티 부서의 어린이 병원의 직원; 프로젝트, 특히 박사 마리아 Minon와 브렌트 Dethlefs 자신의 오랜 지원을위한 오렌지 카운티 경영진 팀의 아동 병원. 이 작품은 어린이 오렌지 카운티의 병원 회생 Medicin에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 투자되었다PHS에 부여 TR3-05476을 통해 전자. 모든 저자는이 작품에 동일하게 기여했다.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

그들이 다시 챔버를 현미경하고 챔버를 처리하는 인큐베이터에서 이동할 때 CPF에서 성장 세포는 산소 또는 이산화탄소 농도의 변경을 볼 수 없습니다. 각 실의 조건이 세포 배양기에서 제거되기 전에 세포가 유지되는 특정 인큐베이터에 일치하는 것이 중요합니다. 장치 내의 분위기가 연속적 HEPA 여과하고 산소와 이산화탄소의 농도와 관련하여 정의 할 수 있습니다. 세포 또는 PSC를 NSCs의 5 %는 각각 9 %, 표준 농도에서 성장 될 수있다; 또는 대안 농도는 다른 세포 유형 또는 특정 실험을 위해 선택 될 수있다. 따라서, 상기 장치는 의료용 산소, 이산화탄소 및 질소 (도 4)의 일정한 소스로 공급된다. 이 가스의 세 가지 상수 공급을 위해 가스 관련 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 상기 장치는 또한 교정 가스 혼합물로 이루어진 공급되고산소 10 % (± 0.01 %), 이산화탄소. 상기 매니 폴드 시스템은 셀 생산 설비 밖에 수용하고 가스가 천정 설비에 배관되어있다. 교정 가스 설비 내에 수납된다. 장치는 또한 또한 천장을 통해, 집 진공와 함께 제공됩니다. 송신 장치를 전자 제어 시스템을 사용하여 무선 모든 매니 폴드의 출력 압력을 지속적으로 모니터링한다. 모든 압력 범위를 벗어날 경우, 상기 셀 생산 설비 오퍼레이터는 자동적으로 전화를하고 적절한 조치를 취할 수 있도록 통지한다. 장치의 전력 요건은 천장 내림차순 여섯 120 V 전용 회로에 의해 충족 일정한 공급을 보장하기 위해 병원의 백업 발전기에 접속된다. 장치의 작동은 무정전 전원 공급 장치를 통해 구동되는 PC 기반 컴퓨터 소프트웨어를 통해 제어된다. 이러한 전원과 컴퓨터 준비확인이 계속에도 공용 전력 시스템 장애 발생 시스템 기능. 상기 장치를 제어하는 소프트웨어는 산소 및 이산화탄소 농도의 제어뿐만 아니라, 온도, 습도, 및 챔버 압력을 허용하는 사용자에게 친숙한 그래픽 인터페이스 (도 1)을 갖는다. 모든 이들 파라미터의 값은 연속적으로 모든 장치 파라미터의 주행 기록을 제공하기 위해 기록된다. 이 데이터 무결성을 보호하기 위해 매일 밤마다 원격 서버에 백업됩니다. 컴퓨터 및 소프트웨어 평가 및 / 또는 매개 변수를 변경하려면 관리자 사용자가 원격으로 액세스 할 수 있습니다. 또한, 컴퓨터 소프트웨어는 장치 파라미터 대화식 평가를 허용하고 로컬 사용자와 해결 원격으로 액세스 될 수있다. 부가 경보 전송 장치는 상기 장치에 접속되어 전지의 생산 시설 운영자가 장치의 모든 범위를 벗어난 상태를 통지되도록. 원격 액세스 Capabilities은 로그인하고 범위를 벗어난 조건의 세부 평가 할 수 있습니다. 장치는 모듈 형 시스템으로 모두 매크로와 마이크로 의미로 설계되어 있습니다. 이러한 인큐베이터 및 처리 챔버 등의 개별 세포 배양 모듈은, 서로에 대하여 그들의 크기 및 요구 사항에 관해서뿐만 아니라 레이아웃에 정의 될 수있다. 또한, 각 모듈의 제어 기능의 대부분은 자체 모듈 같은 개별 분위기 가스 컨트롤러, 예를 들어, 용이하게 시스템의 상당한 중단없이 교체 될 수있다. 이러한 미세 시각화 및 세포 배양의 조작 하나로 특수 처리 챔버가 쉽게 시스템에 적합하다. 두 위상차 형광 현미경은 살아있는 세포 염색 할 수 있도록, 시스템 (도 6) 내부에서, 그리고 콜로니 t 내부와 같은 대기 조건에 절개 될 수있다그는 인큐베이터. 처리 챔버의 측벽에 밀봉 고리를 통해 케이블 라우팅 전원 공급 장치 및 시스템은 일반적으로 카트 (도 6)에서, 상기 장치의 외부에 유지되어야하는 등의 장치를 허용한다. 셀 생산 설비의 공정 챔버는 종래의 BSC는 상이한 기류 패턴을 갖는다. 기존의 BSC들에서, 공기 흐름은 중앙 배기구에서 아래로 흐르는 다음 캐비닛의 바닥의 전방 및 후방 부분에 두 개의 서로 다른 흡기구에 의해 흡수되는 두 개의 스트림으로 분할합니다. 대조적으로, CPF 천장의 전방 부에서 단일 배출구를 갖는다. 공기는 하향으로 그리고 그 후 흡기 벤트에 상향 인출되는 챔버의 후방을 향해 유동한다. CPF는 본래 매우 청결하지만,이 독특한 기류 패턴 기술자 약간 오염의 위험을 줄이기 위해 자신의 기술을 조정해야한다는 것을 의미한다. 기존의 BSC, 실험실 작업자들과 마찬가지로오픈 세포 배양 접시와 미디어 병의 상류에 손을 배치 hould 마십시오. 그러나, 상류 측 방향은 CPF에 변경되었는지 셀 생산 설비 실험실 자체가 상당히 표준이며, -20 ° C의 냉동고가 장착되어, -80 ° C의 냉동고, 4 ° C 냉장고, 원심 분리기, 수욕. 실험실은 편리한 핸즈프리 작동을위한 발 컨트롤 싱크대가 있습니다. 기능성 임상 셀 생산 설비가되는이 실험 위해서는 그러나 여러 추가적인 변형이 여전히 이루어져야한다. 우선, 상기 장치 자체는 휘발성 유기 화합물, 미립자 및 오염 제거에 사용되는 이산화 염소의 농도를 모니터링 할 수있는 능력이 업그레이드되어야한다. 둘째하는 FACS 시스템을 포함하는 처리 챔버를 수용하고 버퍼 모듈을 통해 상기 장치의 나머지 부분에 연결될 수있다. 이것은 셀 정렬 및 TR 정화용 허용적절한 환경 조건 하에서 ansplantable 세포 집단. 마지막으로, 장치 전체 부드러운 벽 클린 룸 내에 보관되어야한다. 이 장치 (5)에 대한 표준화기구 (ISO) 클래스 8 환경에 대한 국제기구를 제공합니다. CPF의 높은 불임 및 컴퓨터 제어 특성은 세포 기반 치료 양호한 제조 공정 미래 애플리케이션에 이상적인 시스템을 만든다. 오염의 위험이 크게 완화되어 있지만, 더 중요한 것은, 전지 팽창 조건을 자동으로 기록하고, 컴퓨터 시스템에 의해 보관된다. 가스 농도, 온도, 습도 및 시스템에 액세스하는 모든 이벤트의 편차는 엄격하게 설명되어 있습니다. 제품 품질 문제를 조사하는 경우에 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 여전히 한계가있다. 일체의 시약 및 소모품의 사용은 (예를 들면, 미디어 구성 요소, 피펫, 플레이트) 별도로 문서화해야합니다. 더하다itionally의 CPF의 모니터링 시스템에 의해 문서화 변수는 전혀 관련이있는 발생할 수있다 (인간의 오류의 다양한 형태 포함) 잠재​​적 인 문제의 다수가 있습니다. 따라서, 고도로 훈련 된 인력과 작업에 대한 자세한 설명서 설명서에 대한 필요성이 장소에 남아 있습니다.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo System</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvivo Software</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>version i.o.2.1.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Manifold</td>
			<td>Amico</td>
			<td>M2H-C3-D-U-CO2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Manifold</td>
			<td>Western Innovator</td>
			<td>CTM75-7-2-2-BM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro hESC Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A100006-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Sodium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Protide</td>
			<td>PP1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s-based Cell dissociation Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13150-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AFL236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIT-9500 Serum Supplement</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Serological pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Serological pipet</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5000.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanimaster 4</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>65332960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>A714239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

이 원고 일부 상세 셀 생산 설비 및 폐쇄 시스템 내부의 세포를 배양의 고유 한 특징을 설명한다. 셀 생산 설비의 대부분은 작은 크기를 가지며 쉽게 6 × 7.5 m 2 실 (도 2) 내에 수용 될 수있는 특별 주문품, 묶인 세포 배양 장치를 포함한다. 짧은 시간에 실험실 요원 또는 환경에 노출 장치 내의 세포이다. 이 장치는 여러 모듈로 구성하는 처리 챔버, 층류 후드는 후드와 프로세스 챔버, 두 세포 배양 인큐베이터, 처리 챔버에 인접한 현미경 챔버 사이에서 2 버퍼링 에어 록 챔버 (도 3). 이 시스템은 환경 변수 (도 1)를 제어 및 모니터링 할 수 있도록 소프트웨어에 의해 제어된다. 이 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터가 무정전 전원 공급 장치입니다. 가스 번째에 공급산소, 질소 및 이산화탄소 (도 4)에 대한 매니 폴드의 집합으로 전자 시스템. 액티브 세트 및 예약 설정 - 장치의 가스 탱크 두 세트의 각이 매니 폴드 시스템에 의해 제공됩니다. 활성 세트가 아래로 그릴 때, 매니 폴드는 자동으로 예약 설정 및 직원 위해 교체 탱크로 전환됩니다. 전원 백업 발전기 시스템이다. 능성 및 신경 줄기 세포는 신규 장비에 고유 한 추가 합병증, 이전에 개발 된 프로토콜 (9)를 사용하여이 기능에서 저산소 조건에서 재배 할 수있다. 다 능성 줄기 세포를 분리하고 확장된다 완전히 형질 콜로니를 식별 능성 특이 항체를 사용하여, 센다이 바이러스를 이용하여 유도 될 수있다. (도 5A와 B)이 iPSCs로부터, 신경 줄기 세포와 뉴런 듀얼 SMAD 억제를 유도하여, 그 표현형은 USI를 검증 할 수있다<html> NG NSC 특이 항체 (도 5c 및 D). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> 셀 생산 시설에 대한 그림 1. 그래픽 인터페이스. (A)에 CPF의 그래픽 표현은 기본 화면입니다 (그림 1 층) 그림 3. 버퍼 모듈 1 위에 마우스의 클릭으로 표시되는 CAD 도면과 일치 O 2 값 (도 3, 3) 상기 처리 챔버와 일치하도록 설정되어 그 제어 화면 (B)를 연다. 마찬가지로, 프로세스를 클릭 회의소 또는 인큐베이터 1 값이 적절하게 변경하거나 모니터링 할 수 있습니다 각각의 제어 화면 (각각 C와 D를) 나타납니다.<html> rget = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> 는 셀 생산 설비 2. 그림. (A) 정면 우에서 본 시스템. 오른쪽에있는 현미경 액세서리 및 컴퓨터와 천장의 전력 및 가스 연결 및 카트를합니다. (B) 우측에서 본 상기 버퍼 모듈에 액세스 도어와 층류 후드. 후방에 볼 (C) 두 인큐베이터 (블랙 도어)와 프로세스 챔버. (D) 시스템의 오른쪽 통해보기 현미경을 보여주는 거리에서 볼 버퍼 챔버에 문을 모니터링 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> 셀 생산 설비도 3. CAD 드로잉. 장치 들어가는 모든 항목은 제 층류 후드에서 건조시켜 알코올과 공기 닦여 (1). 항목은 다음 UCPC 모듈에 전달되기 전에 프런트 버퍼 모듈 (2 층)에서 적절한 분위기로 전환하거나하는 공정 챔버 (3). 세포는 두 인큐베이터 (4, 5)에서 배양한다. 라이브 세포 얼룩, 식민지 따기, 일반 세포의 형태 및 마이그레이션 분석의 평가는 UPC 모듈에서 발생, 또는 현미경 회의소 (6). 마지막으로, 폐기물 후면 버퍼 모듈 (2R)를 통해 시스템을 종료합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> 가스 및 전력 그림 4. 소스. (A)는 실험실의 모든 인큐베이터 공급과 같이 CO 2 매니 폴드는 4 × 4 설정입니다. (B)이 O이 매니 폴드는 2 × 2 셋업 및 용품에만 셀 생산 설비가있다. 시스템의 질소는 또한 자동으로 (왼쪽 아래) cryofreezers을 채 웁니다 (오른쪽) 액체 질소 매니 폴드에 부착 (바로 종료 기호 아래에, C) 기화기에서 발생한다. 매니 폴드 (160)는 L 액체 질소 탱크 두 쌍에 의해 제공되는 2 × 2 설치된다. CO 2, O 2, N 2 차단 장치 (D)를 통해 천장에 공급된다. 주택의 진공는이 위치에 공급된다. 시스템에 전원을 공급하는 전원 케이블의 한 쌍의 바로 공급 가스 차단 장치 뒤에 본.F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> 센다이 바이러스에 저산소증에서 파생 된 그림 5. 다 능성 줄기 세포. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (명칭 스토 버 등. 구에 있음), 위상 대비 10 배. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs는 AF-594 표지 트라-1-60, 1 라이브 스테인드 : 미디어 100 희석. 모든 iPSCs 센다이 바이러스, 5 % O 2의 셀 생산 설비에 형질 도입 하였다. 챔버 슬라이드에 5 % O 2에서 성장 SC68.1 - UH0-2I0 - M0S13 - N2G6 IPSC 파생 NSCs의의 (C) 단계의 대비,. 세포를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 항 - 인간 네 스틴 차 항체로 염색 알렉스 488 차 항체 하였다. 모든 규모의 바 (100)에있다1;. m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K 조회수.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

비디오: Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...