This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

hPSCs의 단일 셀 기반이 아닌 식민지 형 단일 층 (NCM) 문화. 1. 준비 <ol><li> 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA)와 보충 DMEM 매체 : 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 배양 배지 500 ㎖로 만든다. </li><li> 마우스 배아 섬유 아세포를 DMEM 배지에서 0.1 % 젤라틴 코팅 6 - 웰 세포 배양 접시에 일상적인 프로토콜 (16)와 문화 MEFs 다음 CF1 균주에서 유래 (MEFs) 세포를 분리. 또한, 상업 자원의 통로 (3)에 MEF의 주식을 구입할 수 있습니다. </li><li> 리겔 플레이트를 준비합니다. <ol><li> -20 ° C의 냉동고에 50 % 씩 분주로 5 (~ 4 ° C에서 냉장) DMEM/F12 배지 ㎖ 및 저장소와 hESC의 자격 리겔 주식의 5 ㎖를 희석. 냉장고 (~ 4 ° C) O / N에서 냉동 마트 리겔 주식을 해동하고 추가 (2.5 % 작업 농도 상승을주는) 차가운 DMEM/F12 배지에서 리겔을 희석. </li><lI&gt; 웰 당 1.5 ml의 2.5 % 리겔과 코트 6 - 웰 세포 배양 플레이트, 냉장고 O / N에 코팅 된 플레이트를 저장하는 (주 : 2 주 안에 리겔 코팅 된 플레이트를 사용한다.) </li><li> 플레이트는 10 ~ 30 분 동안 세포 배양 후드 (참고 : 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 따뜻하게하지 않는다)에 실온에서 따뜻하게 할 수 있도록, 냉장고에서 리겔 플레이트를 제거하고 대기음 DMEM 매체 전에 hPSCs을 도금 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 500 ㎖의 hESC 매체 만들기 : 80 % DMEM/F12 배지, 20 % KSR 2 ㎜의 L-글루타민, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 0.1 ㎜의 β-메르 캅토 에탄올, 4는 FGF-2 / ㎖를 겨. </li><li> , 60 % FBS, 20 % DMSO 및 mTeSR1 배지에서 20 μM Y-27632 여과 살균, 1 주 안에 매체를 사용 2X hPSC 동결 매체의 10 ㎖를 준비합니다. </li></ol> . 2 프로토콜 1 (기본) : 공급기에 hPSC 식민지를 성장 <ol><li> 일관성 resul을 얻기 위해 hPSC 문화에 대해 5 또는 6 (P5 및 P6로 지정)에서 MEF 통로 번호를 사용TS. Mitotically 37 ° C에서 3 시간 동안 10 ㎍ / ㎖의 마이 토마 이신 C와 세포를 치료에 의해 MEFs을 비활성화, 세척 세포는 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)으로 3 배, 다음 0.53 밀리미터에서 0.05 % 트립신 MEFs을 떼어 놓다 EDTA. 대안 적으로, X-선 조사 장치와 8,000 라드의 투여 량으로 MEFs를 조사. </li><li> 현미경 하에서 트립 판 블루 염색 배제 방법을 이용하여 세포 수를 센다. 또한, 자동 세포 계수기를 사용합니다. </li><li> 6 자 폴리스티렌 번호판 플레이트 조사 MEFs 잘 당 1.88 × 10 5 세포 (즉, 1.96 × 10 4 세포 / ㎠)의 밀도로 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C에서 세포를 품어 5 % CO 2 24 시간 동안. </li><li> 파스퇴르 피펫 (이 시간에 필요로 한 세척 단계를 참고 없음)로 흡인하여 MEF 문화 매체를 제거합니다. </li><li> 작은 덩어​​리로 이전의 문화에서 씹다 hPSC 식민지, FR에 이르기까지 자신의 크기를 확인하기 위해 현미경으로 수풀을 검사OM (50) 직경의 100 ㎛, 잘 hPSC 2 ㎖를 포함하는 하나의 MEF 피더 레이어의 상단에 hPSC 덩어리를 접시. </li><li> 어떤 형태 학적으로 변형 된 또는 차별화 된 식민지 (~ 5 %)를 마크, 사진 에의 한 5 일 기록 식민지의 성장을위한 hESC의 매체 일상을 변경하고 수동으로 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 흡인에 의해 표시 식민지를 제거합니다. </li><li> 두 번 MEFs에 남아있는 식민지 (2 분 D-PBS로 각을) 씻어, 2 ㎖를 1 ㎎ / 10 ~ 30 분 hPSC 매체 ㎖의 콜라게나 제 IV)에 식민지를 배양하고,에서 hPSC 식민지의 분리를 검토 MEF 도포면 (주 : 콜로니 단단히 플레이트에 부착되는 경우에만 박리 공정을 돕기 위하여 스크레이퍼를 사용). </li><li> , 15 ML 튜브에 효소 반응, 전송 식민지를 최소화 hPSC 식민지는 실온에서 3 ~ 5 분 동안 침전 할 수 있도록, 그리고 C의 직접적인 시각화에 의해 식민지의 침전을 보장하기 위해 각 웰에 hPSC 매체의 5 ML을 추가합니다튜브의 바닥에 ELL 학생 (참고 :이 단계에서 튜브를 원심 분리하지 않음). </li><li> 잔류 MEFs를 함유 상청액을 제거하고 단일 세포를 해리, hESC의 매체 (5 mL)로 콜로니를 재현 탁하고, 두 번 침전 단계를 반복한다. </li><li> 세포의 계대를위한 6 자 접시에 (1 아니라 냉동 바이알 당 합류) 또는 판 냉동 보존을위한 매체 (또는 CryoStore CS10 동결 매체) 냉동 1X hPSC 작은 덩어​​리, 저장소로 매체, 씹다 hPSC 식민지를 제거합니다. </li></ol> 3 프로토콜 2. NCM에 hPSC 식민지를 공급기로 변환 <ol><li> 일단 D-PBS에서 hPSC 펠렛을 씻어 10 분 동안 1X Accutase 1 ㎖로 알약을 배양하고, 단일 셀의 분리를 보장하기 위해 현미경으로 효소 반응을 검사합니다. </li><li> 온화 Y-27632은 5 분 동안 RT에서 200 XG에서 원심 분리 한 다음 10 μM을 함유 mTeSR1 배지 5 ㎖에 세포를 재현 탁하여 효소 반응을 종결(세포 손상의 원인이 과도한 원심 분리의 힘을 사용하지 않는 참조). </li><li> 펠렛에 mTeSR1 매체의 5 ML을 추가, 하나의 세포로 펠렛을 재현 탁하고, 필터는 40 μm의 셀 스트레이너 (잔여 세포 집합체를 제거하는)를 통해 세포를 해리. </li><li> 잘 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 2.5 % hESC의 자격 리겔로 코팅 된 6 - 웰 플레이트의 (1.4-2.1 × 10 5 세포 / ㎠), 2.5 mL로 mTeSR1 매체를 추가하고, 10 μM을 포함 배지에서 Y-27632 (초기 24 시간 단세포 도금을 촉진하기 위해). 1 μM Y-39983 (내가 억제제 ROCK), 1 μM의 phenylbenzodioxane (ROCK II 억제제), 1 μM의 thiazovivin (소설 ROCK 억제제) 또는 강화 단일 셀 도금 10 μM Y-27632을 대체하기 위해 다음과 같은 작은 분자를 이용 , 2 μM의 JAK 억제제 1. </li><li> (24 시간 이내) 다음날 약 자유로운 mTeSR1 매체와 매체를 교체, 추가로 하나의 세포를 떼어 놓다또한, 단일 세포 도금의 효율을 결정하는 세포의 수를 계산합니다 (참고 : 대략,이 단계에서 달성 될 수 단일 셀 도금 효율 50-90%). </li><li> 세포가 mTeSR1 매체의 3 ㎖로 몇 일 동안 단일 세포 형성 단층으로 성장 할 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 경험적으로 세포 밀도에 따라 적응 NCM을 계대 일정을 결정합니다. 세포의 성장은 3 일 또는 4 일에 합류, 또는 세포 간 경계의 소멸 후 4 시간 시점에 도달 통로. 1 ~ 3 분할 비율 (즉, 잘 6 잘 플레이트의 3 우물에서 도금 세포의 1 합류) 세포의 계대 용을 사용 Accutase 1 ㎖의 세포를 떼어 놓다, 5 통로에 적응 NCM을 안정. </li><li> 세포 동결 <ol><li> 하나의 고정 된 유리 병에 대해 하나의 합류도 (~ 5 ~ 6 배 6 셀) 활용 : 음 10 분 Accutase 1 ㎖로 한 융합 세포를 떼어 놓다. </li><li> w를 희석i 번째 5 전술 한 바와 같이 mTeSR1 매질 및 원심 셀 ML. </li><li> mTeSR1 매체의 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 천천히 냉동 보존 유리 병 (20 μM Y-27632 포함)을 2 배 hPSC 동결 매체 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 10 μM Y-27632 또는이 어느 μM의 JAK 억제제 1의 존재하에 2 μM의 JAK 억제제 1 또는 1X CryoStor CS10 매체를 함유하는 1X hPSC 동결 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 얼음 냉각 cryocontainer (isopranol하여 하단 작성)에 냉동 튜브를 삽입하고 즉시 -80 ° C 냉동고에 cryocontainer를 전송합니다. </li><li> 장기간의 냉동 보존에 대한 (다음 날) 액체 질소 탱크에 -80 ° C 냉동고에서 세포를 전송합니다. </li></ol></li><li> 세포의 해동 <ol><li> 6 잘 플레이트의 1도를 도금 한 냉동 보존 유리 병을 사용한다. </li><li> 2 분 동안 동일한 물을 욕조에 10 분, 해동 세포에 대한 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 mTeSR1 매체,적가 10 μM Y-27632을 포함하는 미리 예열 mTeSR1 매체의 5 ML에 셀을 추가하고, 상기 한 바와 같이 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 10 μM Y-27632을 포함 mTeSR1 2 ㎖와 세포 펠렛을 재현 탁 천천히 잘 리겔으로 미리 코팅에 세포를 전송 (참고 : 공기 방울을 생성하지 않도록). </li><li> 매일 매체를 변경하고 hPSC 성장은 3 일 또는 4에 합류에 도달 할 전망이다. </li></ol></li></ol> 4 프로토콜 3. NCM 문화에 리겔에 hPSC 식민지로 변환 <ol><li> , 냉장고에서 마트 리겔 코팅 된 플레이트를 제거합니다 10 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 배치, 플레이트의 각 우물에서 매체를 제거하고 각 웰에 미리 예열 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 전송 위의 리겔 플레이트에 피더 문화 (기본 프로토콜의 단계 2.10)에서 hPSC 덩어리를 분쇄. 각 웰에 2.5 ㎖의 최종 부피까지 mTeSR1 매체를 추가합니다. </li><li> 3~4일 매일 매체 변경식민지까지의 80 % 내지 90 %의 합류에 도달합니다. </li><li> 세포의 계대의 경우 : 두 번 D-PBS로 식민지를 씻어 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖의 세포를 치료하고, 수풀 등의 침전물과 통로 세포. </li><li> NCM 문화의 경우 : 3.1 ~ 3.9 프로토콜 2에서 설명하는 단계를 반복합니다. </li></ol> 5 프로토콜 4.에 hPSCs의 NCM 문화 LN-521 <ol><li> 사용 하루 전에 4 ° C에서 재조합 LN-521 솔루션을 해동하고 최종 농도에 (칼슘 2 + / 마그네슘 2 +를 포함) 1X D-PBS와 해동 라미닌을 희석하여 라미닌 코팅 용액 (LCS)을 만들 10 ㎍ / ㎖의. </li><li> (: 드라이 아웃 코팅 과정에서 피할 주)도 6 - 웰 플레이트에 하나에 LCS의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 증발을 방지하고 냉장고 (4 ° C) O / N (1 주일 이내에 플레이트를 사용 주)의 플레이트를 저장하는 파라 필름과 코팅 된 플레이트를 밀봉. </li><li> 부드럽게에없이 파스퇴르 피펫 LCS를 제거코팅 된 표면을 uching 잘 하나 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 25 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (D-PBS를 포함하여) 모든 문화 솔루션을 따뜻하게. </li><li> hPSC 식민지 NCM로 변환 <ol><li> 프로토콜 2에 설명 된대로 Accutase으로 하나의 세포에 세포 집합체를 떼어 놓다. </li><li> 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 잘 LN-521-코팅 (1.4-2.1 × 10 / ㎠ 5 셀) ROCK 억제제의 존재없이. </li><li> 3~4일 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 1 내지 3 개의 분할 비를 이용하여 다음 세포 계대 1 일 3 또는 4의 Accutase 1 ml의 세포 해리. </li></ol></li></ol> . 6 프로토콜 5 : NCM 문화 플라스미드 DNA 형질에 대한 <ol><li> 4 프로토콜 2에 설명 된대로 NCM 문화에 hPSC 식민지 적응. </li><li> 플레이트는 10 μM Y-2763의 존재에 mTeSR1 매체에 5 세포 / 웰 × 10 7.5 세포 밀도로 12 - 웰 플레이트에 hPSCs 해리2. </li><li> 세포를 도금 후 4-8 시간 사이에 약 자유로운 mTeSR1 매체와 mTeSR1 매체를 교체합니다. </li><li> 각 형질의 경우 (예를 들어, pmaxGFP) 발현 플라스미드의 2.5 μg을 희석하고 125 ㎕의 옵티-MEM 각 별도의 에펜 도르프 튜브에 리포 펙 타민 2000 년 5 μL 세럼 중간을 감소. </li><li> 5 분 후, 희석 시약을 혼합하고 RT (형질 단지를 형성)에서 20 분 동안 품어. </li><li> 1 ㎖ mTeSR1 매체의 각 잘 포함 hPSCs에 250 ㎕의 형질 단지를 추가하고 24 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 형광 현미경과 실제 형질 전환 효율의 계산을 위해 무작위로 사진에서 형질 전환 효율을 검사합니다. </li></ol> . 7 프로토콜 6 : NCM 문화 마이크로 RNA의 형질에 대한 <ol><li> 6에 잘 당 Accutase 1 ㎖를 추가하여 NCM 조건에서 2 일에 반 합류 hPSCs을 떼어 놓다<html> - 잘 플레이트. </li><li> 5 분 200 XG에서 효소 반응과 원심 분리기를 희석 mTeSR1 매체의 10 ML을 추가합니다. </li><li> , mTeSR1 배지로 세포 펠렛을 재현 탁 10 μM Y-27632를 함유 mTeSR1 배지에서 12 - 웰 플레이트에 웰 당 7.5 × 105 세포의 밀도로 세포를 시드하고, 세포가 4 시간 동안 부착시킨. </li><li> Y27632없는 mTeSR1 매체와 매체를 교체합니다. </li><li> 상업적으로 이용 가능한 마이크로 RNA (예를 들어, Dy547 레이블이 아닌 대상 miRIDIAN miRNA의 형질 컨트롤)를 사용합니다. 제공되는 시약을 사용하여 0-160 nm의에 이르기까지 농도를 적정하고 제조 업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 형질 감염 후 24 시간에서 현미경 생균의 Dy547 형광을 영상화함으로써 hPSC 라인의 각 농도에 대한 형질 전환 효율을 최적화. </li><li> 모든 묘화 셀 위에 Dy547 양성 세포의 백분율에 기초하여 형질 전환 효율을 계산한다. </li></ol>. TLE &quot;&gt; 8 프로토콜 7 : 렌티 바이러스 벡터의 형질 도입에 대한 NCM 문화 <ol><li> 반복 프로토콜 6 7.4 7.1 단계를 반복합니다. </li><li> 전달에 사용되는 바이러스 입자의 양을 계산 : 다음 식에 사용 TU를 = TU는 단위 변환의 총 수를 의미하는 반면 (MOI는 CN을 X) / VT, MOI은 잘 (MOI 또는 감염의 원하는 다수의 동일 TU / 셀), CN은 물론 각 세포의 수를 지정하고, VT 재고 바이러스 역가 (TU / ㎖)를 나타냅니다. 예를 들어, SMART-shRNA를 벡터에 대한 스톡 바이러스 역가가 (ML 당 단위 변환) 1 × 10 9 TU / ㎖ 동일 주어진, 7.5 × 10 5 전달시에 웰 당 세포 및 (20)의 예상 MOI는 : 15을 사용 각 웰에 대한 재고 바이러스 입자의 μL가 (주의 :이 조건이 과도 렌티 바이러스 유도하는 것이 좋습니다). </li><li> 30 분 동안 폴리 브렌의 10 ㎎ / ㎖와 mTeSR1 매체의 사전 따뜻한 300 μL. </li><li> 주식 바이러스 입자의 15 μl를 추가로예열 mTeSR1 매체는 폴리 브렌을 함유하는 용액을 부드럽게 혼합한다. </li><li> 바이러스 입자를 포함하는 예비 가온 매체의 300 μL와 세포 배양 배지를 교체합니다. </li><li> 4 시간 배양 한 후, 전달 효율을 결정하는 turboGFP 형광 (shRNA를 발현에 대한 메이커)를 검사합니다. </li><li> 세포가 turboGFP을 표현하기 시작하면 잘 열 변환에 추가 mTeSR1 매체 300 μl를 추가합니다. </li><li> 12 ~ 16 시간 배양 한 후, 터보-GFP 발현을 재검토. </li><li> 72 시간 이내에 형질 세포로 원하는 후속 실험을 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Cherry, A. B., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogrammed+cells+for+disease+modeling+and+regenerative+medicine.">Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine.</a> Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).</li><li>Mallon, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StemCellDB:+The+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Database+at+the+National+Institutes+of+Health.">StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health.</a> Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell+culture:+considerations+for+maintenance,+expansion,+and+therapeutics.">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+and+FGF+cooperatively+establish+the+regulatory+stem+cell+niche+of+pluripotent+human+cells+in+vitro.">IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro.</a> Nature. 448, 1015-1021 (2007).</li><li>Moogk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC+colony+formation+is+dependent+on+interplay+between+self-renewing+hESCs+and+unique+precursors+responsible+for+niche+generation.">Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation.</a> Cytometry A. 77, 321-327 (2010).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-colony+type+monolayer+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).</li><li>Amit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+undifferentiated+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).</li><li>Dang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Serra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application.">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).</li><li>Steiner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=propagation+and+controlled+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+suspension.">propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension.</a> Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo.">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li><li>Jozefczuk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Kozhich, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Rev. , (2012).</li><li>Kunova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+robust+monolayer+expansion+produces+human+pluripotent+stem+cells+with+improved+viability.">Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability.</a> Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+small+molecule+inhibitor+cocktail+supports+long-term+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells.</a> Nat Commun. 2, 167 (2011).</li><li>Amps, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage.">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).</li><li>Baker, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+oncogenesis+in+vivo.">Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo.</a> Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).</li><li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies.">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li><li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+but+not+-332,+-111,+or+-411+enables+mouse+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+vitro.">Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro.</a> Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).</li><li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+laminins.">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li><li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media.">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

기존의 (피더 또는 세포 외 매트릭스에 세포의) 식민지 형 문화와 지류 6없이 집계로 hPSCs의 현탁 배양 : 체외에서 배양 hPSCs에 두 가지 주요 방법이 있습니다. 식민지 형 서스펜션 모두 배양 방법의 한계는 축적 된 이질성 및 상속 성적인 변경 내용이 포함되어 있습니다. NCM 배양, 단세포 계대 및 고밀도 세포 도금 양에 기초 hPSC 성장 6,18위한 새로운 배양 방법을 나타낸다. 다?...

multilineage의 성인 조직으로 분화하는 hPSCs의 용량은 심장, 간, 췌장, 및 신경 시스템 1-4을 포함하는 심각한 질병으로 고통받는 환자를 치료에 새로운 길을 열었습니다. hPSCs에서 파생 된 다양한 종류의 세포는 질병 모델링, 유전 공학, 약물 검사 및 독성 시험 1,4에 대한 강력한 휴대폰 플랫폼을 제공 할 것이다. 미래 임상 약리학 응용 프로그램을 보장하는 중요한 문제는 체외 세포 배양을 통해 임상 수준의 hPSCs 많은 수의 세대입니다. 그러나, 현재의 문화 시스템은 식민지 5,6 등 hPSCs의 다양한 장치와 피더 무료 문화를 포함, 부족하거나 본질적으로 변수 중 하나입니다. hPSCs 공유 초기 포유류 배아의 내부 세포 덩어리 (ICM)의 많은 구조적 특징의 식민지 형 성장. ICM은 세 가지 세균 층으로 분화하는 경향이있다때문에 이종 신호 그라디언트의 존재 다세포 환경에서. 따라서, 초기 배아 발달에 이성의 인수는 차별화를위한 필수 과정으로 간주하지만, hPSC 문화의 원치 않는 기능입니다. hPSC 문화의 이질성은 종종 인해 차선의 성장 조건에 과도한 세포 사멸 신호와 자발적 분화에 의해 유도된다. 따라서, 콜로니 식 배양에서, 이종 세포는 종종 7,8 콜로니의 주위에서 관찰된다. 또한 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)에서 세포는 BMP-4와 같은 구 신호 분자로 전시 차동 응답 콜로니 것으로 밝혀졌다. 또한, 식민지 배양 방법으로 인해 통제 할 수없는 성장 속도와 세포 사멸 신호가 6,9를 경로에 낮은 세포 수율뿐만 아니라 냉동 보존에서 매우 낮은 세포 회수율을 생산하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다양한 서스펜션 문화, 배양 hPSCs에 particul을 개발 한피더 행렬없는 조건 6,10-13에 hPSCs 많은 양의 확장을위한 아 흘리. 물론, 다른 문화 시스템은 자신의 장점과 단점이있다. 일반적으로, hPSCs의 이질적인 성격은 유전 공학 6에 hPSCs에 DNA와 RNA 자료를 제공하기위한 차선이다 식민지 유형 및 집계 문화 방법의 주요 단점 중 하나를 나타냅니다. 명백하게, 현재의 배양 방법의 몇 가지 단점을 회피 새로운 시스템을 개발하는 필수적인 필요가있다. 단일 세포의 생존을 개선 (예 : ROCK 억제제 Y-27632 및 JAK 억제제 1과) 작은 분자 억제제의 발견은 해리 - hPSC 문화 (14, 15)에 대한 방법을 포장. 이러한 작은 분자의 사용으로, 우리는 최근 비 식민지 유형 해리 - hPSCs 9 (NCM)의 성장에 따라 배양 방법을 개발했습니다. 이 신규 한 배양 방법은 단일 세포 계대 고밀도 모두 결합, 도금 방법을 우리가 주요 염색체 이상 9없이 안정적인 성장주기에 따라 균일 한 hPSCs 많은 양을 생산할 수 있도록. 또한, NCM 문화는 다양한 응용 프로그램에 대한 배양 방법을 최적화하기 위해 다른 작은 분자 (예 : 라미닌 등) 정의 행렬로 구현 될 수 있습니다. 여기, 우리는 NCM 문화를 기반으로 몇 가지 상세한 프로토콜을 제시하고 유전 공학에 대한 자세한 절차를 서술. NCM 프로토콜의 다양성을 설명하기 위해, 우리는 또한 다양한 ROCK 억제제와 하나의 라미닌 이소 521 (즉, LN-521)와 NCM 문화를 테스트했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Countess automated cell counter&#160;&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.&#160;</td>
			<td style="width:187px;">C10227</td>
			<td style="width:187px;">Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Faxitron Cabinet X-ray System</td>
			<td style="width:220px;">Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Model RX-650</td>
			<td style="width:187px;">X-ray irradiation of MEFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">MULTIWELL six-well plates&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Becton Dickinson Labware</td>
			<td style="width:187px;">353046</td>
			<td style="width:187px;">Polystyrene plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">11965&#8211;092</td>
			<td style="width:187px;">For MEF medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">mitomycin C</td>
			<td style="width:220px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:187px;">107 409</td>
			<td style="width:187px;">Mitotic inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">25300-054</td>
			<td style="width:187px;">For MEF dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">11330&#8211;032</td>
			<td style="width:187px;">For hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">31985-062</td>
			<td style="width:187px;">For hPSC transfection</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Heat-inactivated FBS</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">16000&#8211;044</td>
			<td style="width:187px;">Component of MEF medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Knockout Serum Replacer&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">10828&#8211;028</td>
			<td style="width:187px;">KSR, Component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">14190-144</td>
			<td style="width:187px;">D-PBS, free of Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11140&#8211;050</td>
			<td style="width:187px;">NEAA, component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:187px;">25030&#8211;081</td>
			<td style="width:187px;">Component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:203px;">mTeSR1 &#38; Supplements</td>
			<td rowspan="2" style="width:220px;">StemCell Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;">5850</td>
			<td style="width:187px;">Animal protein-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">TeSR2 &#38; Supplements</td>
			<td style="width:220px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:187px;">5860</td>
			<td style="width:187px;">Xeno-free medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:187px;">7522</td>
			<td style="width:187px;">Component of hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;"> 
			MEF (CF-1) ATCC</td>
			<td style="width:220px;">American Type Culture Collection (ATCC)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">SCRC-1040</td>
			<td style="width:187px;">For feeder culture of hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:220px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:187px;">354277</td>
			<td style="width:187px;">For feeder-free culture of hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Laminin-521</td>
			<td style="width:220px;">BioLamina</td>
			<td style="width:187px;">LN521-02</td>
			<td style="width:187px;">Human recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">FGF-2 (recombinant FGF, basic)</td>
			<td style="width:220px;">R&#38;D Systems, MN</td>
			<td style="width:187px;">223-FB</td>
			<td style="width:187px;">Growth factor in hPSC medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CryoStor CA10&#160;</td>
			<td style="width:220px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:187px;">7930</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Accutase</td>
			<td style="width:220px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:187px;">AT-104</td>
			<td style="width:187px;">1X mixed enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">JAK inhibitor I</td>
			<td style="width:220px;">EMD4 Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">420099</td>
			<td style="width:187px;">An inhibitor of Janus kinase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Y-27632</td>
			<td style="width:220px;">EMD4 Biosciences</td>
			<td style="width:187px;">688000</td>
			<td style="width:187px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Y-27632</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0012</td>
			<td style="width:187px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Y-39983</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0029</td>
			<td style="width:187px;">ROCK I inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Phenylbenzodioxane&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0030</td>
			<td style="width:187px;">ROCK II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Thiazovivin</td>
			<td style="width:220px;">Stemgent</td>
			<td style="width:187px;">04-0017</td>
			<td style="width:187px;">A novel ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">BD Falcon Cell Strainer&#160;</td>
			<td style="width:220px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:187px;">352340</td>
			<td style="width:187px;">40-&#181;m cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Nalgene 5100-0001 Cryo 1&#176;C</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:187px;">C6516F-1</td>
			<td style="width:187px;">&#8220;Mr. Frosty&#8221; Freezing Container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:187px;">Transfection reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DharmaFECT Duo&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">T-2010-02</td>
			<td style="width:187px;">Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">IP-004500-01-05</td>
			<td style="width:187px;">Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">SMART-shRNA</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:187px;">To be determined</td>
			<td style="width:187px;">Lentiviral vector</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">pmaxGFP</td>
			<td>amaxa Inc (Lonza)</td>
			<td>Included in every transfection kit</td>
			<td style="width:187px;">Expression plasmid for transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">4-Oct</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-5279</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG2b, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">SSEA-1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21702</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgM, differentiation marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">SSEA-4</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21704</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG3, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Tra-1-60</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21705&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgM, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Tra-1-81</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-21706</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgM, pluripotent marker</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">CK8 (C51)</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-8020</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG1, against cytokeratin 8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">&#945;-fetoprotein</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-8399</td>
			<td style="width:187px;">AFP, mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">HNF-3&#946; (P-19)</td>
			<td style="width:220px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:187px;">sc-9187</td>
			<td style="width:187px;">FOXA2, goat polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Troponin T (Av-1)</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">MS-295-P0</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Desmin&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;">RB-9014-P1</td>
			<td style="width:187px;">Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Anti-NANOG</td>
			<td style="width:220px;">ReproCELL Inc, Japan</td>
			<td style="width:187px;">RCAB0004P-F</td>
			<td style="width:187px;">Polyclonal antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Rat anti-GFAP</td>
			<td style="width:220px;">Zymed</td>
			<td style="width:187px;">13-0300</td>
			<td style="width:187px;">Glial fibrillary acidic protein</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Albumin (clone HSA1/25.1.3)</td>
			<td style="width:220px;">Cedarlane Laboratories Ltd. (</td>
			<td style="width:187px;">CL2513A</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG1,</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Smooth muscle actin (clone 1A4)</td>
			<td style="width:220px;">DakoCytomation Inc</td>
			<td style="width:187px;">IR611/IS611</td>
			<td style="width:187px;">Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Nestin</td>
			<td style="width:220px;">Chemicon International</td>
			<td style="width:187px;">MAB5326</td>
			<td style="width:187px;">Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">TUBB3</td>
			<td style="width:220px;">Convance Inc</td>
			<td style="width:187px;">MMS-435P</td>
			<td style="width:187px;">Tuj1, mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">HNF4&#945; (C11F12)</td>
			<td style="width:220px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:187px;">3113</td>
			<td style="width:187px;">Rabbit monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Paraformaldehyde (solution)</td>
			<td style="width:220px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:187px;">15710</td>
			<td style="width:187px;">PFA, fixative, diluted in D-PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alternative cultures for human pluripotent stem cell production, maintenance, and genetic analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

NCM 문화의 일반적인 스키마 그림 1은 ROCK 억제제 Y-27632의 존재 고밀도 단일 셀 도금 후 hPSCs의 역동적 인 변화를 보여주는 전형적인 NCM 문화 스키마를 나타냅니다. 이러한 형태 변화는 세포의 클러스터 형성을 도금, 세포 응축 다음에 지수 세포 성장 (그림 1A) 후 세포 간 연결이 (가) 있습니다. 대표적인 실험이 1 일에서 10 μM Y-27632의 존재 /...

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Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis | Biology | Video

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

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12.2K 조회수.  National Institutes of Health. Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

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Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

연구

생물학

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.