The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Qu&#233;bec-Sant&#233; (FRQS).

주 : 프로토콜 센다이 바이러스 (SEV) 감염 A549 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 그러나, SDS-PAGE 및 기본 페이지에 대한 프로토콜은 지금까지 테스트 한 모든 인간과 쥐의 세포 유형, 다양한 IRF3-활성화 자극 9,15,19,24,25 자극 특히 골수 세포와 함께 작동합니다. A549 세포의 감염 1. <ol><li> 37 ° C / 5 % CO 2 (20)에 15cm 플레이트에서 배양 A549 세포를 유지 ml의 10 %를 열 불 활성화 소 태아 혈청 (HI-FBS), 1 % L- 글루타민을 함유하는 F12K / 햄 배지 (완전 F12K / 햄 매체). 참고 : 세포 배양 및 치료에 사용되는 모든 솔루션은 멸균해야합니다. </li><li> 감염 전에 24 시간에서 매체를 기음과 증류수 인산염 완충 생리 식염수 실온에서 (D-PBS) 10 mL로 세포를 씻어. </li><li> 세포를 커버하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양하기 위해 각 플레이트에 0.25 % 트립신 EDTA 용액 1ml를 추가합니다. </li><li> 빨리 번째로 부화 중지전자 세포는 부드럽게 한 손으로 판을 눌러 판에서 분리하기 시작. 접시 당 예열 완전한 F12K / 햄 10 ml의 배지를 첨가함으로써 트립신을 불 활성화하고 15ml의 원뿔형 튜브에 세포를 옮긴다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 350 XG에 원심 분리기. 상등액을 제거하고 균일 한 단일 세포 현탁액을 얻었다 완전한 F12K / 햄 매질 8 ml 중에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 예열 완료 F12K / 햄 배지 4 ㎖ 중의 60mm 판 당 1 × 106 세포의 밀도로 세포를 시드. 부화 20 - 37 ℃ / 5 % CO 2에서 24 시간 후에는 20 - 24 시간, 세포는 90 % 컨 플루 언트 단층 (이 1.5 × 106 세포에 상당)을 형성. </li><li> 매체를 제거하고 혈청이없는 F12K / 햄 매체의 2 ㎖ (SFM)로 세포를 씻어. 60mm 판 당 신선한 SFM 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 간단히 얼음과 소용돌이에 (저장 -80 ° C에서 분주) 센다이 바이러스 (SEV)의 나누어지는을 녹여. </li><li> 일을 희석예열 SFM의 E 바이러스 60 HAU / 100 μl를 얻었다. 아래로 부드럽게로 pipetting에 의해 혼합 40 HAU / 10 6 세포에 감염을 수행 할 판 당 희석 바이러스 100 μl를 추가합니다. 감염되지 않은 제어 판에서 바이러스를 추가하지 마십시오. </li><li> 37 ° C / 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 손으로 3 또는 4 회 플레이트를 교반하거나 감염의 최초 시간 동안 인큐베이터에 직접 배치하는 자동 궤도 또는 요동 쉐이커를 사용. </li><li> 2 시간의 감염 후에서 10 % HI-FBS의 최종 농도를 얻기 위해 20 % HI-FBS를 포함하는 F12K / 햄 배지 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 각각 3, 6, 9 hr의 총 감염 시간에 도달하기 위해 추가 1, 4, 7 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 이 시점 각각에서 2.1 단계로 진행합니다. </li></ol> 전 세포 추출물 2. 준비 (WCE) <ol><li> 감염 매체를 제거합니다. 1 ㎖에 의해 긁어 세포 수확빙냉 D-PBS로 미리 냉각 된 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 20 초 동안 4 ℃에서 16,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠릿 신중 D-PBS의 모든 흔적 캔트. 주 :이 단계에서, 세포 펠렛을 직접 단백질 추출 또는 플래시 냉동 액체 질소 나 드라이 아이스 / 에탄올 욕과 용해 될 때까지 -80 ℃에 보관을 실시 할 수있다. </li><li> 의 50 mM HEPES pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 10 % 글리세롤, 1 % Nonidet P-40 탈 이온수를 함유하는 용해 버퍼를 준비한다 (DDH 2 O). 즉석에서 프로테아제 (1 μg의 / ㎖ 류 펩틴 및 2 μg의 / ㎖ 아프로 티닌) 및 포스파타제 억제제를 추가 (5 mM의 불소화 나트륨을 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트 2 mM의 P 니트로 페닐 포스페이트, 10 mM의 β-글리세 산도 7.5 활성화). 주 : 억제제없이 용해 버퍼는 4 ℃에서 저장 될 수있다. 나트륨 오르토 바나 데이트의 활성화를위한 특정 프로토콜은 특정 시약 / 산업 장비의 표에 설명되어 있습니다NT. </li><li> 용해 완충액 70 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 일반적으로 해물 농도 / μL 약 2 μg의 것입니다. </li><li> 얼음에서 20 분 동안 배양한다. 15 초 동안 액체 질소 용기에 배양하여 해물을 플래시 동결. 그것은 완전히 10 초 동안 용융 소용돌이 될 때까지 실온에서 해물을 해동. 동결 / 해동 / 소용돌이 사이클을 3 회 반복합니다. <ol><li> 대안 적으로, 1 분 동안 에탄올 / 드라이 아이스 배스에서 동결 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 4 ℃에서 16,000 XG에 원심 분리기. 새로운 사전 냉장 1.5 ML의 원심 관에 뜨는 (WCE에 해당)를 전송합니다. 항상 얼음에 WCE를 유지합니다. </li><li> 이러한 브래드 포드 단백질 기반 분석 (26) 용해 완충액과 호환 어떤 단백질 정량 방법을 사용하여 단백질을 정량. </li></ol> 높은 해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE 3. 해상도 <ol><li> 세 변성 전기 영동 젤을 준비합니다. <ol><li> 감응(1 37.5), 375 mM 트리스 - 염산 pH를 8.8 (RT), 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS IRF3 형태는 7.5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드로 이루어지는 분리 겔 16cm 길이의 최소 두 겔을 부어 ), 1 %과 황산 암모늄 0.1 % DDH 2 O에 TEMED 및 4 %의 아크릴 아미드로 이루어지는 적층 겔, 62.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT), 0.05 % SDS, 1 %과 황산 암모늄 0.1 %의 DDH 2 TEMED 영형. 주의! 아크릴 아미드, TEMED 및 SDS는 독성 및 / 또는 자극이다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. </li><li> SEV 단백질의 검출을 위해, 분리 겔은 12 % 아크릴 아미드를 포함하는 것을 제외하고, 3.1.1에 기술 된 겔과 유사한 특성을 갖는 8.5 cm 길이의 최소 하나의 겔을 붓는다. </li></ol></li><li> 1 가산함으로써 단계 2.6에서 수득 WCE 변성 : 4 (v / v)의 5 배의 로딩 완충액 (125 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT), 10 % SDS, 20 % (P / V) 글리세롤, 0.0005 % 브로 모 페놀 블루 및 100 ℃에서 가열 하였다 DDH 2 O의 25 % β-머 캅토 에탄올)10 분 동안 C. 빠른 스핀 튜브 캡에 형성 응축을 가지고 있습니다. 주의! β-머 캅토 에탄올 흡입 독성. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. </li><li> 마이그레이션 장치에서 젤을 탑재합니다. 25 mM 트리스 - 자료, 0.1 % SDS 증류수에 192 mM의 글리신 (DH 2 O)를 포함하는 버퍼를 실행하는 상부 및 하부 챔버를 입력합니다. </li><li> 로드 각 16cm 젤 잘 하나에서 분자량 표준의 14 μL와 8.5 cm 젤 잘 하나에서 분자량 표준의 7 μL. IRF3 형태 검출 단계 3.1.1에서 제조 한 두 겔의 웰 당 변성 WCE의 30 μg의 부하 (단계 3.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). 부하 8 - SEV 분석 단계 3.1.2에서 제조 한 겔 변성 WCE 웰 당 10 μg의 (단계 3.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). </li><li> 이주 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 정전류 30mA에서 젤을 실행. 참고 : 마이그레이션은 일반적으로 approxima 지속tely 16cm 젤 3 시간과 8.5 cm 젤 45 분. </li><li> 니트로 셀룰로오스 막 (5 단계) 상에 전송 진행합니다. </li></ol> 기본-PAGE에 의해 IRF3 이합체 4. 분석 참고 :이 방법은 원래 박사 T. 후지타 (27)의 그룹에 의해 설명되었다. <ol><li> (-) 및 하부 (+) 챔버 전기 영동 버퍼 상단을 준비합니다. 상부 챔버 버퍼는 DDH 2 O 25 mM 트리스 - 염산 pH가 8.4 (RT), 192 mM의 글리신과 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 (DOC)로 구성 하부 챔버 버퍼 DDH 2 O. 25 mM 트리스 - 염산 pH를 8.4 (RT) 및 192 mM의 글리신을 포함 주 : 상부 및 하부 챔버 전기 버퍼를 사용할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 그러나,이 전기를 수행하기 전에 실온으로 미리 예열되어 있는지 확인합니다. </li><li> 375 mM 트리스 - 염산 pH를 8.8 (RT), 1 % 탄약 : 7.5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (37.5 1)를 함유하는 8.5 cm 길이의 최소 비 변성 겔을 붓고 해결DDH 2 O.에서 TEMED 천년 황산 0.1 % </li><li> 얼음에 30 분 동안 40mA 정전류에서 젤을 사전 실행합니다. 대략 하부 챔버 영동 버퍼의 레벨을 얼음에 주행 장치를 누른다. 이것은 겔이 얼음에없는 것이 중요하다. </li><li> 1 (v / v)의 DDH 2 125 mM 트리스 - 염산 pH가 6.8 (RT), 30 % 글리세롤 및 0.1 % 브로 모 페놀 블루를 포함하는 오 : 사전 실행하는 동안 WCE는 2 배 기본 페이지 로딩 버퍼 1 얼음에 보관 혼합 </li><li> 부하 8 - 즉시 프리 런의 끝에서 (단계 4.4에 기재된 바와 같이 제조)의 10 μg의 WCE. </li><li> 프리 런에 대해 상술 된 바와 같이 이주 전면 겔 (약 40 분)의 바닥에 도달 할 때까지, 얼음에 25mA의 정전류에서 겔을 실행. </li></ol> IRF3 종 5. 면역 블롯 분석 <ol><li> DDH 2 O. 25 mM 트리스 -베이스 및 192 mM의 글리신을 함유하는 전송 버퍼를 준비 냉장 사용하기 전에 4 ° C에서 전송 버퍼. </li><li> 니트로 셀룰로오스 막 습윤 세 조각 전송 버퍼를 포함하는 플라스틱 / 유리 상자 겔보다 약간 큰 크기로 잘랐다. 한 코너를 절단함으로써 막의 배향을 나타낸다. 전송 버퍼는 3 번 재사용 될 수있다. 용도 사이에 4 ° C에서 버퍼를 저장합니다. </li><li> Uncast 겔 (SDS-PAGE 및 기본-PAGE)과 올바른 방향에 대한 각 젤의 한 모서리를 잘라. <ol><li> 네이티브-PAGE를 들어, 전송 버퍼에 전송하기 전에 DOC를 제거하기 위해 SDS-PAGE에서 러닝 버퍼에 적어도 30 분 동안 교반과 함께 RT에서 겔을 부화. </li></ol></li><li> 10 분 - 5 전송 버퍼에서 겔 (SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE)를 배양한다. </li><li> 양극 (폼 패드 / 종이 필터 / 멤브레인 / 젤 / 필터 종이 / 폼 패드)을 향해 막으로 전송 카세트에 젤 당 전송 샌드위치를​​ 탑재합니다. 샌드위치의 층 사이에있는 모든 거품을 제거하기 위해주의해야합니다. </li><li> 추천 B로 전송을 수행Y 사용 전송 장치 제조업체. 참고 : 흔들 또는 궤도 떨고 플랫폼에서 다음 단계의 모든 배양 및 세척을 수행합니다. </li><li> 전송 시간의 끝에서, DDH 2 O. 7 % 아세트산, 40 % 에탄올을 3 % 글리세롤을 함유하는 고정액에 15 분 동안 막을 배양 세포막을 씻어 PBS의 3 배 5 분 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10.2 밀리미터 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4 DH 2 O에서). 주의! 아세트산은 독성, 자극과 가연성이다. 보호 장갑을 착용하고, 흄 후드에서 조작 할 수 있습니다. 주 : 고정 용액은 여러 번 재사용 될 수있다. </li><li> 기본 페이지 막 들어 5.11 단계로 바로 진행합니다. </li><li> DDH 2 O.에서 6.57 mM의 붉은 개양귀비 빛 1 % 아세트산을 함유 개양귀비 빛 적색 용액에 1 분 동안 배양 하였다 그들을 DH 2 O 빠르게 세 SDS-PAGE 막을 린스 주 : 빨간 개양귀비 빛 솔루션은 R 수 있습니다<html> 수회 eused. </li><li> 배경이 빨간색으로 염색 단백질 밴드를 볼 수있을만큼 흰색 때까지 DH 2 O의 세포막을 씻어. 연필로 표시를 참고 단백질 주위 초과 막 잘라. 교반하면서 PBS에서 5 분 동안 인큐베이션 막을 Destain. </li><li> 블로킹 용액에 4 ° C (PBS, 0.05 % 트윈 20, 5 % 비 지방 건조 우유를 함유하는 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 막을 배양한다 (PBS-T-우유). 상기 멤브레인을 3X 5 분간 씻어 PBS-T. 주 : PBS-T 세척 선택적 5 % 소 혈청 알부민 (PBS-T-BSA) 다음 단계에서 (도 1 및 표 1)을 함유하는 PBS-T에 희석 항체를 적용 할 때 엄격하게 요구된다. </li><li> . 그림 1 및 표 1에 설명 된 순서에 따라 차 항체 (SDS-PAGE 및 네이티브 페이지에서) 네 멤브레인을 품어 PBS-T에서 5 배 5 분 세척을 수행합니다. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> 면역 블롯의 분석 그림 1. 순서. 계통도에서는 다양한 IRF3 인산화 및 이량 체 / 단량체 형태를 감지하는 데 필요한 개별 SDS-PAGE 및 기본-PAGE 젤을 설명합니다. 면역 과정의 각 겔로부터 생성 된 막에인가 된 항체의 구체적인 순서를 설명한다. 항 - 액틴 항체는 다른 특이적인 항체를 적용하기 전에 샘플의 동일한 로딩을 위해 사용되는 제 유의. 항 - 액틴 항체 대체 시퀀스는 또한 동작, 항 - 포스 포 IRF3 항체 후에 적용된다. 스트립 안티 굴지 및 안티 SEV 항체 또는 항 - 포스 IRF3 때문에 신호의 크기를 중복 방지 IRF3 항체 사이에 사용된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together부근에 자리 잡고 페이지 = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> 차 항체 </td><td> 노동 희석 </td><td> 희석 버퍼 </td><td> 잠복 </td><td> 차 항체 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 안티 굴지 </td><td> 1 / 10,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> RT에서 15 분 </td><td> 반대로 마우스 </td><td> SDS-PAGE 후 사용 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N 4 ° C에서 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> 기본-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체를 재사용하지 않는 것이 좋습니다 </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N 4 ° C에서 </td><tD&gt; 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체 안티 IRF3-P-396은 또한 세포 신호에서 사용할 수 있습니다 재사용하지 않는 것이 좋습니다. 최적의 희석이 항체에 대한 1 / 1,000로 정의 하였다, 그러나 많은 사이에 차이가있을 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N 4 ° C에서 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체를 재사용하지 않는 것이 좋습니다 </td></tr><tr><td> 안티 IRF3 전체 길이 </td><td> 1 / 7,500 </td><td> PBS-T-우유 </td><td> 실온에서 3 시간 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 안티 IRF3 전체 길이 항체 네이티브-PAGE 후에 사용될 수 있지만, 단량체를 검출에 덜 민감하다. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 된 항체는 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-NE에스 </td><td> 0.5 μg의 / ㎖ </td><td> PBS-T-우유 </td><td> 실온에서 3 시간 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> 기본-PAGE 후 사용하십시오. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td> 안티 SEV </td><td> 1 / 14,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 실온에서 3 시간 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td colspan="6"> 참고 : HRP 결합 된 이차 항체에 사용되는 희석 ​​버퍼는 한 회사에서 다른 변화에 따라 최적화 될 필요가있다. </td></tr></tbody></table> 항체의 표 1. 사양은 면역 블 롯팅 절차에 사용됩니다. <ol start="13"><li> (인사를 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 세포막을 품어P)는 그림 1과 표 1에 설명 된대로 차 항체를 π 공역. 완전히 트윈의 흔적을 제거하기 위해 멤브레인을 PBS에서 2 배 5 분 뒤에 PBS-T에서 5 배 5 분을 씻으십시오. </li><li> 완전히 막을 덮을 향상된 발광 시약의 부피로 1 분 동안 막을 배양한다. 여과지를 사용하여 멤브레인을 건조. </li><li> 면역 밴드를 시각화하기 위해 발광 영상 분석기에서 세포막을 놓습니다. <ol><li> 대안 적으로, 민감한 X 선 필름을 사용하여 면역 반응성 밴드의 검출을 수행. </li></ol></li><li> PBS에서 5 분 3 배 세포막을 씻으십시오. 주 :이 단계에서 멤브레인 건조하게 유지 될 수있다. 상기 스트립이 요구되는 경우, 이는 막 건조 전에 스트리핑을 수행하는 것이 낫다. 막은 또한 PBS 단기 저장 될 수있다. </li><li> 항체와 배양 사이에 제거 필요하지 않은 막 들어 단계로 바로 진행합니다 (그림 1 참조)5.20. </li><li> 스트리핑은 항체, 50 ° C에서 DDH 2 O 2 % SDS, 62.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT) 및 0.7 %의 β 머 캅토 에탄올을 함유하는 예비 가온 스트리핑 용액 막을 배양 (도 1 참조) 사이에 요구되는 경우 일반 교반하면서 20 분. PBS에서 5 분 3 배 세포막을 씻으십시오. 참고 : 제거 절차를 수행하는 동안 교반이 핵심입니다. 스트리핑은 혼성화 오븐에서 수행 될 수있다. 대안 적으로, 수욕 비닐 봉투에 밀봉 침지 멤브레인을 사용하여 수행 될 수있다 스트리핑. 배양 동안 5 회 -이 경우, 멤브레인 (4)을 교반을하는 것이 중요하다. </li><li> PBS-T-우유에서 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 세포막을 품어. </li><li> 반복 그림 1 항에있어서 5.16로 5.12 단계를 반복합니다. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+infection+induces+the+assembly+of+coordinately+activated+transcription+factors+on+the+IFN-beta+enhancer+in+vivo.">Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo.</a> Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).</li><li>Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-3+is+an+in+vivo+target+of+DNA-PK.">Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAK1-JNK+cascade+is+required+for+IRF3+function+in+the+innate+immune+response.">The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response.</a> Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).</li><li>Solis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+TBK1+and+IKKepsilon+in+lipopolysaccharide-induced+activation+of+the+interferon+response+in+primary+human+macrophages.">Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages.</a> Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).</li><li>Soucy-Faulkner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NOX2+and+reactive+oxygen+species+for+efficient+RIG-I-mediated+antiviral+response+through+regulation+of+MAVS+expression.">Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).</li><li>Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation,+transactivation+potential,+and+proteasome-mediated+degradation.">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li><li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection:+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP/p300.">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li><li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA.">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li><li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+(IRF3).">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li><li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP/p300+without+overall+conformational+change.">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li><li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry.">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li><li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation.">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li><li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+(SOCS1).">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).</li><li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IRF-3/-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection:+common+and+unique+pathways.">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li><li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation.">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li><li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+I{kappa}B+Kinase+(IKK)-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1/IKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation.">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li><li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5.">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 여기 설명 프로토콜 IRF3의 이합체 / 단량체 및 phosphoforms I-IV를 구별하기 위해 여러 포스 포 항체의 용도에 결합 고해상도 SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE의 조합으로 이루어져있다. 이 IRF3 종의 적절한 검출은 완전히 특정 설정에 IRF3 활성화를 특성화하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 활성화 된 대 식세포의 LPS의 자극, 인산화 (II 형)를 전시 이량 체, Ser396 / 398 인산화 ​​IRF3의 형성을 유도하지만, S...

<html> 재하와 구조적으로 표현 전사 인자 인터페론 (IFN) 규제 요인 3 (IRF3)는 주로 IFNβ의 유도를 통해 병원균에 대한 방어의 첫 번째 줄에 중요뿐만 아니라, 케모카인 (CC 모티브)의 유도 리간드 (5) (CCL5 통해 ) 및 tetratricopeptide와 인터페론 유도 단백질 등 여러 가지 바이러스 단백질은 IFIT1 / 2 / 3월 1일부터 3일까지 반복합니다. 또는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 4 : IRF3 활성화 polyinosinic - polycytidylic 산 (C 폴리 I)에 다음과 같은 다수의 바이러스 감염 또는 노출을보고되었다. 중요한 것은, 대부분의 연구 바이러스는 IRF3 매개 응답을 회피하고, 이에 호스트 선천성 면역 방어 5 탈출 메커니즘을 진화했다. 따라서 IRF3 활성화를 모니터링하는 것은 선천성 바이러스 숙주 방어의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 또한 본 반응을 방해하는 바이러스에 의해 사용되는 전략을 식별하는 데 매우 중요하다. ENT &quot;&gt; 많은 출판 리포트 그러나 저해상도 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 IRF3 표적 유전자 도입의 모니터링 (IFNB1 및 IFIT1)에 의해 수행 IRF3 활성화 및 / 또는 루시퍼 라제 리포터 유전자 분석의 제한된 분석을 제공 (SDS- PAGE) IRF3 분석. 그러나, 다수의 생화학 적 연구는 다양한 IRF3 돌연변이 IRF3 결정 구조 6-11의 해명의 행동 분석에서의 인산화에 의해 순차 번역 후 변형의 복잡한 실시된다 IRF3를 확립 기여 여러 사이트. IRF3 활성화에 관여하는 인산화의 집합은 세포 유형의 자극에 따라 가장 가능성이있을 것으로 보인다. 감염되지 않은 세포에서 IRF3 비 인산화 및 인산화되어 종은 1, Thr135 및 Ser173 포함 phosphoresidues을 포함하는 것으로 공존 -198 AA의 N 말단 지역 6,12-14.이 인산화되어 F의 축적IRF3의 ORM은 스트레스 유도, 성장 인자 및 DNA를 손상 에이전트 (6)에 의해 유도된다. 전이 활성화 영역을 포함 IRF3의 C 말단 영역에서 빼앗아 /의 Thr 잔기의 인산화에 의해 활성화 바이러스는 다음의 트리거됩니다 폴리 I : 셀형 의존적 15-17에서 C 또는 LPS. IRF3의 C- 말단 인산화는 각각 이합체를 통해 IRF3 활성화, 핵 축적, CREB와 관련에 기여, 두 가지 주요 클러스터, Ser385 / Ser386 및 Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 구성에는보다 7 별개의 phosphoacceptor 사이트를 포함하지 - 결합 단백질 (CBP) / P300의 공동 활성화 인자, 민감한 반응 요소 (ISRE) 합의 시퀀스 및 표적 유전자 9,10,17-19의 전이 활성화를 IFN하는 DNA 결합. Thr390의 인산화는 또한 바이러스 - 유도 IRF3 활성화 (20)에 기여하는 것으로 생각된다. 질량 분석은 IRF3 분석 Ser386, Thr390, Ser396 및 Ser402 잔류 물이 직접 phosphorylat 것을 증명하고있다κB 키나제 ε의 억제제 (IKKε)에 의해 에드 / 탱크 결합 키나제 1 (TBK1)는 9,10 키나아제. C- 말단 잔기의 인산화는 polyubiquitination 및 프로 테아 매개 저하 (10)를 통해 IRF3 활성화의 종료가 필요합니다. 이 과정은 또한 프로필 이성화 핀 1 10, 11의 채용에 필요한 Ser339의 인산화에 따라 달라집니다. 적어도 포스 Ser339 / 396분의 386 잔류 물을 포함 IRF3 종은 hyperphosphorylated 형태로 간주됩니다. 각 사이트의 정확한 순서와 기능은 토론 10,21의 문제가 남아있다. 그것은 활성화 IRF3가 균일 한 상태를 나타내지 않는,하지만 별개의 인산화 또는 이량 특성을 나타내는 서로 다른 활성 종 10,22 존재 이니까 분명하다. 특정 병원체에 응답 IRF3 활성화의 완전한 이해를 제공하기 위해, 그것은으로 Ch 필요가있다유도 활성 종의 어느 aracterize. IRF3 대상 유전자, IFNB1 및 IFIT1의 유도는 IRF3 활성화를위한 신뢰할 수있는 판독을 제공하기 위해 입증되었습니다. 그러나, 이들 유전자의 발현을 모니터링 IRF3의 다른 활성화 상태를 구분하지 않습니다. 특정 설정에서 IRF3 활성화 상태의 포괄적 인 분석은 인산화 및 이량 상태 (10)의 상세한 특성에 의존한다. Unphosphorylated (폼 나는), (II 형) 및 hyperphosphorylated, 인산화 (형태 III 및 IV) IRF3 양식 6,18,23이 성공적으로 고해상도의 SDS-PAGE 분석 감소 이동성을 해결할 수 있습니다. 단량체 및 이량 IRF3 종 효율적 네이티브-PAGE 분석에 의해 식별 될 수있다. 별개의 IRF3 phosphoacceptor 부위에 대해 지시 한 포스 포 항체와 조합하여 사용할 때 이러한 방법이 크게 개선된다. 표준 프로토콜의 가난한 해상도를 허용별개의 IRF3 인산화 된 형태의 효율적인 분리를 허용하지 않습니다 단백질. 여기서는 총 및 포스 포 - 항체를 사용하여 면역 블롯과 조합 네이티브-PAGE에 결합 SDS-PAGE를 이용하여 고유 바이러스 활성 IRF3 종의 유도를 모니터링하기 위해 높은 해상도를 얻기 위해 상세 절차를 설명한다. 활성화 된 다른 간의 생체 차별 IRF3 형태의 SDS-PAGE상에서 관찰 그들의 이동성 변화에 기초하여 수행된다. 또한 IRF3 단량체 및 이량 체는 비 변성 전기 영동으로 구별 될 수있다. 면역 이들 두 기법의 상보 결합 IRF3의 인산화 - 매개 활성의 완전한 분석에 필요한 모든 정보를 획득하기위한 저렴하고 민감한 방식으로 증명한다.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C bath before use.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>For cell culture.</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus Cantell Strain</td><td>Charles River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Reagent&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&amp;nbsp;</td><td>Cytotoxic</td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&amp;nbsp;</td><td>Cytotoxic</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&amp;nbsp;</td><td>Work under fume hood. Toxic and irritant.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&amp;nbsp;</td><td>Irritant.</td></tr><tr><td>Amonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Toxic and irritant.</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&amp;nbsp;</td><td>Irritant.</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane (0.45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable.</td></tr><tr><td>Red ponceau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&amp;nbsp;</td><td>For PBS composition for immunoblot.</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>For PBS composition for immunoblot.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&amp;nbsp;</td><td>For PBS composition for immunoblot.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>For PBS-T-BSA composition for immunoblot.</td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly sorbate 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Store aliquoted at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C. Avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Home made&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td><td></td><td>Store aliquoted at -80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C. Avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4947s</td><td>Store at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Home made&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;</td><td></td><td>Store aliquoted at -80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C. Avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-full length</td><td>Actif motif</td><td>39033</td><td>Store aliquoted at -80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C. Avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Store aliquoted at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini CCD camera apparatus</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Store aliquoted at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr></tbody></table>

a high resolution method to monitor phosphorylation-dependent activation of irf3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

그림 2는 고해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE의 해상도 후 Ser396 및 Ser398에 대한 IRF3 총 항체 및 IRF3 - 포스 포 - 항체 검출 IRF3의 전형적인 면역 이미지를 보여줍니다. 자극되지 않은 A549 세포에서, IRF3은 50 개의 대역과 비 - 인산화 (형태 I)에 대응하는 SDS-PAGE의 53 kDa 이상, 인산화 결정 (II)의 IRF3 종으로서 검출된다. 시간에 따른 변화에 9 시간 결과 천천히 나는를 양식에서 ...

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A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

a-high-resolution-method-to-monitor-phosphorylation-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K 조회수.  Université de Montréal. Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

비디오: A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

연구

생화학

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

생물학

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like receptor myeloid differentiation primary response gene 88 (TLR-MyD88) signaling pathway. IRF5 activation involves phosphorylation, dimerization, and subsequent translocation from the cytoplasm into the nucleus, which in turn induces the gene expression of various pro-inflammatory cytokines. A detection assay for IRF5 activation is essential to studying IRF5 functions and its relevant pathways. This article describes a robust assay to detect endogenous IRF5 activation in the CAL-1 human plasmacytoid dendritic cell (pDC) line. The protocol consists of a modified nondenaturing electrophoresis assay that can distinguish IRF5 in its monomer and dimer forms, thus providing an affordable and sensitive approach to analyze IRF5 activation.

A native Western blot method for analyzing endogenous interferon regulatory factor 5 dimerization in the CAL-1 plasmacytoid dendritic cell line is described. This protocol can be applied to other cell lines as well.

내인성 IRF5 이분화의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동동면역블롯 분석

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

면역학 및 감염병학

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical regulators of necroptosis, an inflammatory form of cell death with important antiviral functions. Autophosphorylation of RIPK3 induces phosphorylation and activation of the pore-forming executioner protein of necroptosis MLKL. Trafficking and oligomerization of phosphorylated MLKL at the cell membrane results in cell lysis, characteristic of necroptotic cell death. The nucleic acid sensor ZBP1 is activated by binding to left-handed Z-form double-stranded RNA (Z-RNA) after infection with RNA and DNA viruses. ZBP1 activation restricts virus infection by inducing regulated cell death, including necroptosis, of infected host cells. Immunofluorescence microscopy permits the visualization of different signaling steps downstream of ZBP1-mediated necroptosis on a per-cell basis. However, the sensitivity of standard fluorescence microscopy, using current commercially available phospho-specific antibodies against human RIPK3 and MLKL, precludes reproducible imaging of these markers. Here, we describe an optimized staining procedure for serine (S) phosphorylated RIPK3 (S227) and MLKL (S358) in human HT-29 cells infected with herpes simplex virus 1 (HSV-1). The inclusion of a tyramide signal amplification (TSA) step in the immunofluorescent staining protocol allows the specific detection of S227 phosphorylated RIPK3. Moreover, TSA greatly increases the sensitivity of the detection of S358 phosphorylated MLKL. Together, this method enables the visualization of these two critical signaling events during the induction of ZBP1-induced necroptosis.

Tyramide signal amplification during immunofluorescent staining enables the sensitive detection of phosphorylated RIPK3 and MLKL during ZBP1-induced necroptosis after HSV-1 infection.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Single-Molecule Pull-Down Assay for Protein Phosphorylation Analysis: A High Throughput Technique to Quantify Protein Phosphorylation in Cell Lysate

Source: Bailey, E. M. et al., <a href="https://www.jove.com/v/63665">An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a sensitive quantification technique of protein phosphorylation using a single-molecule pull-down assay. The functionalization of polyethylene glycol-biotin and the use of labeled antibodies increases the detection of phosphorylated tyrosine with specificity.

단백질 인산화 분석을 위한 Single-molecule pull-down assay: 세포 용해물에서 단백질 인산화를 정량화하기 위한 고처리량 기법

Source: Bailey, E. M. et al., An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (2022)
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