EMS는 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다 [부여 번호 R01HL120919] 미국 심장 협회 [허가 번호 10SDG4350046] 국립 보건원 [허가 번호 UL1 TR000042]에서 로체스터 CTSA 수상의 대학; 그리고 AAB CVRI에서 시작 기금. MAT는 하워드 휴즈 의학 연구소 메드 - 속 - 대학원 이니셔티브에서 의학 및 치과 로체스터 대학의 대학에 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다; 그리고 NIH [허가 번호 GM068411]에서 기관 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상.

참고 : 마우스 모든 실험은 로체스터 대학 동물 자원에 대학위원회에 의해 승인되었다. 1 심 외막 파생물 문화 분석 (그림 1A) <ol><li> 준비 <ol><li> 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성) 중간 (199) (M199)를 보충하여 주 외막 세포 격리 5 ml의 배지 A를 준비한다. </li><li> 매체 사전 따뜻한 100ml를 37 ° C의 물을 욕조에 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS). </li><li> 콜라겐 - 코팅 된 챔버 슬라이드를 30 분 동안 실온으로 가온하도록 허용. </li><li> 챔버 슬라이드의 각 웰에 100 ㎕의 매체 A를 추가하고 부드럽게 고르게 코트 콜라겐 표면에 회전합니다. 8-12 우물을 반복합니다. 코팅 챔버 후 용지를 제거합니다. </li><li> 분취 액을 50 ㎖의 HBSS를 각각 함유하는 두 개의 10cm 2 플레이트로 HBSS를 예열. </li></ol></li><li> 11.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 댐에서 배아 마음을 격리 할 것.(30) <ol><li> 복강 내 주사를 통해 13 ㎎ / ㎖ 케타민 / 0.88 밀리그램 / 1 배 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 ㎖의 자일 라진 칵테일의 0.5 ml의 마우스를 마취. 발가락 핀치 테스트를 사용하여 적절한 마취를 확인합니다. 부드러운 핀치 마우스가 응답 여부를 결정하기에 충분하다. 모든 이동이나 발 철회은 동물이 충분히 수술을 할 마취되지 않음을 나타냅니다. 자궁 전위에 의해 안락사. </li><li> 최대 복부 측면에 대향하는 마우스를 놓고 머리에 의한 오염을 줄이기 위해 70 % 에탄올로 복부를 스프레이. </li><li> 집게로 피부를 조이고 수술 가위로 복부에 횡 절개를 잘라. 단단히 피부를 누른 다음, 머리와 꼬리를 향해 반대 방향으로 간격을 당깁니다. </li><li> 집게로 복막을 조이고 복강을 노출 가위로 잘라. </li><li> 조심스럽게 mesometrium을 따라 절단하여 탈락을 제거합니다. 하는 해부 탈락 이동 처음에 HBSS를 미리 예열10cm 2 판. </li><li> 배아 사이에 절단하여 탈락을 분리합니다. </li><li> 해부 현미경 미리 예열 HBSS로 두 번째 10cm 2 판에 배아를 전송합니다. 조심스럽게 다음 배아 목을 벨의 배외 (extraembryonic) 조직과 난황 주머니를 제거합니다. </li><li> 집게와 흉부 벽을 조이고 흉강을 노출, 중간 선에서 떨어져 조직을 찢어. </li><li> 심장 뒤 집게를 놓습니다. 유출 관을 잡고 멀리 배아의 마음을 잡아 당깁니다. 아직 장착되어있는 경우, 심장에서 폐 기관과 폐를 분리합니다. </li></ol></li><li> 콜라겐 코팅 슬라이드 하나의 웰에 마음을 전송하고 (그림 1B)를 그 지느러미면을 아래로 놓습니다. 각각의 배아에 대한 단계를 반복 1.2.7-1.3. </li><li> 일단 모든 하트 개별 ​​웰에 이전되고, 37 ° C에서 30 분 동안 상기 챔버 슬라이드를 부화, 5 % CO 2는 콜라겐 기질에 충분한 접착을 허용한다. </li><li> 조심스럽게 추가각 심장 주위 예열 이식편 매체 A의 20 내지 50 μL. 중요 : 너무 빨리 또는 심장 위의 레벨에 미디어를 추가하지 마십시오, 그렇지 않으면 마음 콜라겐 기판에서 분리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 문화 약 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 마음 심 외막 가지를 허용합니다. 참고 :의 outgrowths는 문화의 조기 3-4로 시간 (그림 1C)를 관찰 주로 최소한의 중간 엽 세포 오염 (도 1D, E)과 자갈이 깔린 형태를 표시 중피 세포로 구성 될 수있다. 대표적인 결과는 카메라가 장착 된 해부 현미경을 사용하여 획득 하였다. </li></ol> 심 외막의 outgrowths 2. 유전 적 절제 및 EMT의 유도 주의 : 승인 된 바이오 안전성 가이드 라인에 따라주의 아데노 바이러스를 처리합니다. <ol><li> 15 ml의에게 매체 B를 준비 수욕에서 37 ° C로 사전 따뜻하고 (M199은 1 % FBS, 1 % 펜 / 연쇄상 구균 보충). </li><li> 의 절단을 위해floxed 대립 유전자는 Cre 호텔의 재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스 2.5 × 104 PFU / ㎖ (광고 / Cre 호텔) 또는 제어 바이러스에 보충 이식편 매체 B를 준비합니다. 주 : 후보 유전자의 아데노 바이러스 매개 과발현은 또한 기능 표현형의 증가를 평가하기 위해 수행 될 수있다. 바이러스 역가가 최종 사용자에 의해 결정되어야한다. </li><li> 조심스럽게 집게를 사용 부산물 문화의 심장 외막 고갈 마음을 제거합니다. 나중에 RNA 분리 및 유전자 발현 분석을 위해 -80 ° C에서 1.5 ml를 800 ㎕의 트리 졸와 튜브 및 저장소로 전송 마음입니다. </li><li> 혈액 세포와 과잉 세포 파편을 제거하는 DPBS 잘 각을 씻으십시오. </li><li> 각 가지 문화 500 μl를 아데노 바이러스 (들)로 보충 이식편 매체 B를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 24 시간 동안 배양한다. </li><li> EMT 유도를 들어, 미디어를 제거하고 재조합 형질 전환 성장 인자 (TGF)로 보충 37 ° C 이식편 매체 B -β1 [10 NG / ㎖] 또는 차량 (4 MM의 시간과 보충ydrochloric 산 (염산)를 함유하는 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)). 37 ° C에서 추가로 24 시간 동안 배양 외식, 5 % CO 2. 유전자 / 발현 분석 단백질 또는 후속 프로토콜에 설명 된대로 면역 세포를 진행합니다. 참고 : 심 외막 EMT의 유도가 0.5 NG / ㎖에 이르기까지 TGF-β1의 다양한 농도로 자극 한 - 10 NG / ㎖ 26,31-33. 리간드의 높은 농도는 모든 TGF-β 수용체에 결합하는 비 특정 될 수 있습니다. TGF-β1의 농도는 특정 실험의 목표를 반영해야한다. </li></ol> 심 외막의 outgrowths 3. 유전자 발현 분석 <ol><li> 이전에 트리 졸 (2.2)에 저장 해동 심장 외막 고갈 된 마음입니다. </li><li> EPDC 문화에서 대기음 미디어와는 DPBS로 두 번 씻는다. </li><li> 문화를 이식편하는 800 ㎕를 실온 트리 졸을 추가합니다. </li><li> 객실 temperatu에서 5 분 동안 트리 졸의 심장 외막 고갈 마음과 EPDC 문화를 품다<html> 레. 최대 피펫 및 열 배 아래로 용해 샘플을 균질화 할 수 있습니다. 참고 : 마음이 완전히 균질화 더 피펫을 필요로 할 수있다. </li><li> 1.5 ml의 튜브에 해물을 전송하고 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 분리를 진행합니다. RNA 수율을 증가시키기 전에 강수량 10 μg의 글리코겐을 추가합니다. 주어진 이식편은 약 0.5 ~ 1.0 μg의 RNA를 얻을 것입니다. </li><li> DNase의 I와 오염 DNA를 제거하고 제조업체의 지침에 따라 0.5 μg의 mRNA의를 전사 역. </li><li> 녹색 SYBR 및 글리 세르 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH)에 표 1. 표준화 mRNA 수준을 설명 마커를 사용하여 심 외막 외식 및 / 또는 정량적 역전사와 EMT 유도의 순도 (QRT) - PCR (34)를 확인하고 사용 기준 식을 계산 2 - ΔΔCt 방법 35. 전형적인 결과는도 2a에 도시되어있다. </li></ol>심 외막의 outgrowths의 제목 &quot;&gt; 4. 단백질 분석 <ol><li> EPDC 문화에서 대기음 미디어와는 DPBS로 두 번 씻는다. </li><li> 10 μl의 빙냉 단백질을 용해 완충액 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM 염화나트륨, 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 pH를 8.0, 1 % 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일) 각 웰 챔버를 추가의 챔버 슬라이드를 배치 얼음. P200 피펫 팁에 약 하단의 ¼ 잘라 슬라이드 떨어져 세포를 긁어 나머지 조각을 사용합니다. 피펫 위를 Lyse 심 외막 세포와 1.5 ML 튜브로 전송에 이르기까지. </li><li> 30 초 ON과 OFF 사이클 빙수 조에서 5 분 동안 저 (160 W)에 용해 이식편 초음파 처리. </li><li> 10,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리 용 해물. 새로운 튜브로 상청액을 옮기고, 단백질 분석 (36)를 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 참고 : 주어진 이식편은 최대 1.5 μg의 총 단백질을 얻을 것입니다. 우리가 발견 한 두 개의 마음에서 풀링 외식물론 당 D로드 2 μg의 단백질은 평활근 α - 굴지 (ACTA2) 및 GAPDH (9)을 감지하기에 충분하다. 다른 표적 단백질의 검출이 최종 사용자에 의해 결정된 바와 같이 여러 시료 이식편 풀링 요구할 수있다. </li></ol> 심 외막의 outgrowths 5. 면역 세포 화학 <ol><li> 이식편 문화에서 용지를 제거하고 DPBS로 두 번 씻는다. </li><li> 부드럽게 각각 C o를 -20 실온에서 5 분 또는 10 분 동안 외식 편을 각 웰에 4 % (v / v)의 파라 포름 알데히드 또는 빙냉 메탄올 500 μL를 추가하고 수정. 제조업체에서 권장하는 항체 사양에 따라 수정합니다. </li><li> 5 분 동안 세 번 정착액을 제거하고 DPBS 잘 각을 씻어. </li><li> 5 분 동안 0.1 % DPBS 500 μL (v / v) 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 5 분 동안 세 번 permeabilization 솔루션을 제거하고 DPBS 씻어. </li><li> temperatu 방에서 30 분 동안 DPBS 10 % 혈청으로 세포를 차단레. </li><li> 제조업체의 권장 사항 및 최종 사용자에 의해 결정되는 최적의 조건에 따라 일차 항체 염색을 진행합니다. </li><li> 5 분 동안 세 번 항체 용액을 제거하고 DPBS 씻어. </li><li> 적절한 핵 염료 제조업체의 지침과 Counterstain과 당 차 항체를 적용합니다. </li><li> 5 분 동안 세 번 항체 용액을 제거하고 DPBS 씻어. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 챔버 슬라이드 벽을 제거하고 세포에 직접 수성 장착 매체를 추가 할 수 있습니다. 세포를 통해 커버 슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉. 반전 공 초점 주사 현미경을 사용하여 2D - 전형적인 결과를도 2b에 나타내었다. </li></ol> 6. 전의 VIVO 문화 분석 (그림 3A) <ol><li> 준비 <ol><li> 준비 12 ml를 사용하여 A 전 배양액 생체 : 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (1 1) 혼합물 : M199 10 % 보충FBS와 1 % 펜 / 패 혈성. </li><li> 37 ° C의 수조에서 미리 따뜻한 체외 배양 배지 100 ㎖의 HBSS. </li><li> 나누어지는 1 ml를 24 웰 플레이트의 8-12 우물에 매체를 따뜻하게 사전. </li><li> 전송은 각각 50 ㎖를 함유하는 두 개의 10cm 2 플레이트로 HBSS를 미리 예열. </li></ol></li><li> 12.5 DPC에서 임신 댐에서 (1.2에서 설명) HBSS에 마우스 배아의 마음을 분리합니다. </li><li> 생체 외 배양 배지를 포함하는 24 웰 플레이트의 한 웰에 각각의 마음을 전송합니다. 37 ° C, 부드러운 수동 흔들 또는 부착을 방지하기 위해 락 플랫폼을 사용하여 5 %의 CO 2의 판을 품어. 즉시 7.1 단계로 진행합니다. </li></ol> 7. 전의 VIVO 문화의 심 외막 라벨링 및 EMT 유도 <ol><li> 상기 외막 라벨 광고 / GFP 3.0 × 106 PFU / ㎖로 보충 된 37 ° C 생체 배지 12 mL로 제조한다. floxed 대립 유전자의 대상 절제, (A)의 전송 6 ml를 들어D / GFP는 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 배양액을 첨가. 광고 / Cre 호텔 추가 또는 1.5 × 106 PFU / ml의 최종 농도를 제어하는 아데노 바이러스. 주 : 함수의 이득은 또한 적절한 아데노 바이러스 매개 된 유전자 전달과 함께 수행 될 수있다 분석한다. </li><li> 조심스럽게 P1,000 피펫 팁을 사용하여 24 웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거한다. </li><li> 부드럽게 잘 각각 아데노 바이러스 (들)이 보충 된 배지를 추가합니다. </li><li> 부드러운 락 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 판을 품어. </li><li> EMT 유도를 들어, 37 ° C 생체 10 NG / ㎖ TGF-β1 20 NG / ㎖, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) -BB 또는 비히클을 함유하는 배지 (4 mM의 HCl을 함유 한 ㎎ / ㎖ BSA 12 ml를 준비 ). </li><li> 조심스럽게 P1,000 피펫 팁을 사용하여 24 웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거합니다. 부드럽게 1 ML의 DPBS과 마음을 씻어. </li><li> DPBS를 제거하고 체외 문화에 마음을 보충 날TGF-β1 및 PDGF-BB 또는 차량을 포함 dium. </li><li> 부드러운 락 37 ° C에서 24 시간, 5 % CO 2 품어. </li></ol> 8. 냉동 보존 및 면역 전의 VIVO 문화의 <ol><li> 냉동 보존을 위해 마음을 준비합니다. <ol><li> 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 DPBS로 두 번 마음을 씻는다. </li><li> 각각의 심장에 4 % (v / v)의 파라 포름 알데히드의 1 ML을 추가하고 부드러운 락 4 ° C에서 2 시간 동안 고정한다. </li><li> 정착액을 제거하고 DPBS로 두 번 마음을 씻는다. 1 ml의 10 % DPBS에서 제조 (w / v)의 크로스 신선한 우물에 마음을 전송합니다. 부드러운 락 4 ℃에서 하룻밤 접시를 품어. </li><li> 조심스럽게 18 % DPBS에서 제조 (w / v)의 크로스 새로운 우물에 마음을 전송합니다. 부드러운 락 4 ℃에서 하룻밤 접시를 품어. </li><li> 조직 동결 매체를 포함하는 cryomold 각 마​​음을 전송합니다. 즉시 -80 &amp; #에서 액체 질소와 저장소를 사용하여 블록을 동결176; C. </li></ol></li><li> 양으로 대전 된 현미경 슬라이드에 그라 이오 스탯과 장소 조직 섹션을 사용하여 5 μm의에서 제 마음입니다. 스토어 염색 할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드. </li><li> 서브 심 외막 기저막의 검출 부분에 대한 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. <ol><li> 실온에서 적어도 30 분 동안 해동 슬라이드. </li><li> 부드러운 락 5 분 동안 DPBS에 두 번 세척하여 섹션을 재수. </li><li> 실온에서 5 분 동안 PBS에서 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100 Permeabilize 하시려면 부. </li><li> 부드러운 락 5 분 동안 DPBS 두 번 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 초과 DPBS을 가릴 및 소수성 라벨 펜으로 염색 영역을 정의합니다. 실온에서 30 분 동안 DPBS 10 % 혈청으로 차단 부. </li><li> 블록에 희석 : 콜라겐 유형 IV 항체 (200 ColIV 1) 블록을 제거하고 적용 할 수 있습니다. 습도 조절 실에 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 대한 DPBS에 슬라이드를 세 번 씻으부드러운 락 5 분. </li><li> DPBS과 슬라이드에 적용하고 DAPI (5,000 일) : 형광 접합 된 이차 항체 (500 일)을 희석. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. GFP 구별 방출 및 여기 파장 적절한 이차 항체를 선택합니다. </li><li> 부드러운 락 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 마운트 매체를 장착하여 슬라이드. </li></ol></li></ol> 9. 이미징 및 정량화 전의 VIVO 문화의 <ol><li> 맹검 사용자 이미지를 가지고 스테인드 섹션을 정량화. 심장 외막 (심장의 날) 40 배 배율에서 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 함께 4-5 임의의 위치에서 주어진 마음에서 이미지는 적어도 5 비 연속적인 조직 섹션. 전형적인 결과가 반전 된 공 초점 주사 현미경을 사용하여도 3b에 도시된다. </li><li> 수동 지정된 이미지 GFP 양성 세포의 총 수를 계산. GFP 포로 EPDC 마이그레이션 확인내 또는 ColIV subepicardial 기저막 이상있는 sitive 세포. GFP는 주어진 이미지에서 GFP 양성 세포의 총 수를 통해 GFP를 양성 세포 마이그레이션의 수가 셀 마이그레이션의 비율을 결정합니다. 전형적인 결과가 반전 공 초점 주사 현미경을 사용하여도 3C-D에 도시된다. </li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에서 우리는 가지가 기본 심 외막 세포를 분리하고 생체 심장 문화 EPDC 이동을 추적하는 자세한 방법을 설명합니다. 가지 문화를 들면, 심장 외막 고갈 마음을 제거 할 수있는 적절한 시간 실험 사이에 약간 다릅니다. 하룻밤 배양 후 외식의주기적인 모니터링이 심 외막 가지의 정도를 측정하고 섬유 아세포를 표시하기 전에 마음을 추출하는 것이 좋습니다. 순도를 보장하기 위해, 마음...

심장 외막은 중피 세포의 단일 층입니다 라인 심장과 영향 심장 개발, 성숙 및 수리. 분비 신호 높은 코디 교환을 통해, 심근과 외막 사이에 친밀한 대화 심장 성장 및 비 - 심장 근세포 계통 (1)의 형성에 필수적이다. 심 외막 유래 세포 (EPDC)의 상피 - 투 - 중간 엽 전이 (EMT) (2)를 통해 심 외막 세포의 일부에서 등장는 subepicardial 공간 및 기본 심근 침입, 크게 관상 동맥 혈관 벽화 세포와 심장 섬유 아 세포로 분화하고,에 조금 적게, 내피 세포 및 심근 3-9. 심 외막 EMT 및 EPDC 침입 조절 메커니즘 분비 리간드 10-13, 세포 표면 수용체 및 부착 분자 (14, 15), 가열 공기 조절기 등 다양한 분자의 조정 동작에 기인 한혀끝 - 기초 극성 16, 17, 작은 GTP 아제 18, 19, 및 전사의 lators은 2,20,21 요인. EPDC 이주의 분자 이펙터 많은 정의되었지만, 전략의 개발을 촉진 할 수있다 배아 EPDC 가동화를 자극하는 생리적 신호의 더 나은 이해를 개선 심장 수리 어른이 공정을 조작한다. EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하기위한 연구는이 세포 인구의 정제 또는 개별 심 외막 세포의 이동을 추적에 의존하고 있습니다. 하나 WT1, Tcf21, Tbx18 및 / 또는 Aldh1a2 포함 마커 유전자의 조합은 일반적으로 태아의 심장 외막 하나를 식별하는 데 사용된다. 그러나, 이들 마커의 사용은 심 외막 세포 transdif을 겪을 때 심 외막 마커의 발현은 심장 개발의 과정 기울면 종종 손실로 EPDC 최적 아니다 마이그레이션 추적중간 엽 세포로 ferentiation. 정속 신장식 /에 loxP 시스템의 응용 프로그램은, 혈통-추적 기자와 함께 영구적으로 심장 개발하는 동안 심장 외막와 그 하위 라벨 및 성인 7,22,23에서 허혈 손상을 다음에 유용합니다. 여러 심 외막 제한 Cre 호텔 라인이 생성되어 널리 EPDC 라벨 및 조건부 유전자 삭제 전략 1하는 데 사용됩니다. 이러한 연구는 다양한 심 외막 계통의 특성 및 EPDC 운동성 및 분화의 중요한 매개체의 식별을 주도했다. 그러나, 축적 증거가 심장 외막이 전구 세포 4,24,25의 이기종 인구 제안합니다. 따라서, 심 외막 세포의 서브 세트 만이 주어진 Cre 호텔 드라이버를 사용하여 타겟팅된다. 에 관계없이 Cre 호텔 특이성의 전체 심장 외막에 레이블을하기 위해, 실험실의 수는 가지 막힌를 활용 한진짜야 시스템 또는 생체 기관 배양 방법은 충실하게 격리 또는 26 ~ 28 마커 유전자 혈통의 표현에 의존하지 않고 심 외막 세포를 레이블을. 생체 마이그레이션 연구의 경우, 배아 마음 심 외막 EMT 이전 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 아데노 바이러스 (광고 / GFP) 9,18 보충 된 배지에서 배양 격리됩니다. 이 접근법은 효​​율적인 전체 심장 외막의 표시보다는 Cre 호텔 매개 재조합에 의해 세포의 부분 집합을 허용한다. 심장의 문화는 이후 EPDC (28, 29)의 동원을 자극하는 EMT의 알려진 유도 물질에 노출되어있다. 예 생체 내 및 생체 내 분석 EPDC 마이그레이션을 운전 자세한 메커니즘을 탐구에 특히 유용한 방법이다 체외 심 외막 이식편 문화에 의해 보완된다. 여기, 우리는 epicardi의 체외 연구에 대한 기본 심 외막 세포를 분리하는 방법을 설명합니다알 EMT뿐만 아니라 생체에 대한 기관 배양 물 시스템은 EPDC 운동성 분석. 우리는 최근 유전자 EPDC 9 굴지 기반 마이그레이션을 조작하는 축 시그널링 myocardin 관련 전사 인자 (MRTF) / 혈청 반응 계수 (SRF)를 변조하여이 방법의 유용성과 견고성을 증명하고있다. 우리의 연구 결과는 EPDC 이동을 규제하기 위해 필요한 하나의 신호 전달 경로를 강조하지만,이 방법은 집합 EPDC 마이그레이션 및 차별화를 조율 메커니즘을 해명하기에 적합하다. 또한, 체외 이식편 및 생체 외 배양 시스템은 심장 재생 치료에 응용 프로그램 EPDC 동원 신규 ​​레귤레이터를 식별하는 기능 화면에서 구현 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone&#160;</td>
			<td style="width:141px;">SH3002201</td>
			<td style="width:203px;">DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3003102</td>
			<td style="width:203px;">HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Medium 199</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3025301</td>
			<td style="width:203px;">M199</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3002802</td>
			<td style="width:203px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gemini&#160;</td>
			<td style="width:141px;">100-106</td>
			<td style="width:203px;">FBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SV30010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">354557</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Multiwell 24-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Falcon</td>
			<td style="width:141px;">08-772-1</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">M50</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with Leica KL300 LED might source</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:244px;">Confocal miscroscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">1X81</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bioruptor</td>
			<td style="width:163px;">Diagenode&#160;</td>
			<td style="width:141px;">UCD-200</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Transforming growth factor beta 1</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">100-B-001</td>
			<td style="width:203px;">TGF-&#946;1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Platelet-derived growth factor BB</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">220-BB-010</td>
			<td style="width:203px;">PDGF-BB</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Trizol Reagent</td>
			<td style="width:163px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:141px;">15596-026</td>
			<td style="width:203px;">Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">AM1907</td>
			<td style="width:203px;">DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">1708891</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10814-010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">170-8880</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protease inhibtor cocktail tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:141px;">11836170001</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat-anti-rabbit 488</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A11008</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-rabbit 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11012</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-mouse 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11005</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">C6198</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>MA1-46028</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 6F-H2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-ZO1</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>40-2200</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-Collagen Type 4</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB756P</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">D1306</td>
			<td style="width:203px;">DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S3023</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">16% Paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:163px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">15710</td>
			<td style="width:203px;">PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:163px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:141px;">TFM-B</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Pap pen</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S2002</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable mictrotome blades&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:141px;">4689</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:163px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:141px;">1358W</td>
			<td style="width:203px;">positively charged, 25 x 75 x 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">CM1950</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Forceps</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">11295-00</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable base molds</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">22-363-553</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ketamine</td>
			<td style="width:163px;">Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Xylazine</td>
			<td style="width:163px;">Akorn</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

심 외막 세포 선 단층 심장, 심근 세포의 증식을 자극 분비 인자를 제공하고 직접 개발 및 심혈관 질환 중에 조상 기여. 다수의 인자가 심장 외막 유래 세포 (EPDC) 동원에 연루되어 있지만, 그 이후의 이동과 분화를 지배하는 메커니즘이 제대로 이해된다. 여기, 우리는 EPDC 운동성 및 분화를 연구하는 생체 외 및 생체 전략을 제시한다. 먼저, 마우스 배아 심장에서 생장 배양 주 외막 세포를 얻는 방법을 설명한다. 또한 장기 배양 시스템에서 표지 EPDC 입체 마이그레이션을 평가하기 상세한 프로토콜을 소개한다. 우리는 심장 외막에 myocardin 관련 전사 인자의 유전 삭제 EPDC 마이그레이션을 감쇠 이러한 기술을 사용하여 증거를 제공합니다. 이 방법은 EPDC의 후보 수식을 평가하기위한 플랫폼 역할생물학은 심장 수리를 위해 유용 할 수 있습니다 EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하는 유전 물질 또는 화학 물질 화면을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

심장 외막이 효율적으로 외부 위치를 활용하고 개발 소성 및 EPDC의 고유 철새 동작을 이용하여 부산물 문화 분석을 이용하여 분리 할 수​​ 있습니다. 쥐의 배아 마음 전에 아래 콜라겐 코팅 챔버 슬라이드에 심 외막 EMT 배양 등의 측에 E11.5에서 분리되어 26 (그림 1A, B). 외식 마음은 계약을 계속; 그러나, 심장 외막은 콜라겐 매트릭스 준수와 문화의 24...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K 조회수.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

비디오: Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

연구

발생학

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

임상 적으로 구축<em&gt; 전의 VIVO</em기본 미세 환경에서 상피 상처 복구 조사를위한&gt; 모의 백내장 수술 모델

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

설치류 태 반의 전 생체 관류

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...