이 작품은 DUKE-NUS 대학원 의과 대학 싱가포르, Manvendra K. 싱에 총리 재단, 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-NRFF2016-01)에서 기금에 의해 지원되었다.

모든 실험은 듀크 - NUS 대학원 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 배아 심실 가져 <ol><li> 탄산 가스 공급 장치 또는 다른 승인 안락사 법으로 안락사 챔버를 사용하여 원하는 배아 단계 (E11.5 또는 E12.5)에서 타이밍 임신 마우스를 희생한다. </li><li> 해부 테이블에 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 여성의 복부를 소독. 배꼽을 통해 피부를 들어 올려 블레이드와 작은 절개 (1-2cm)를 확인 후, 두 손으로 피부를 유지하고 복부 벽을 노출 멀리 당기십시오. </li><li> 이제 자궁 경적을 노출하는 복벽을 잘라. 자궁 뿔을 들어 올려 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 자궁에 부착 된 지방 조직과 혈관을 절단. 자궁 경부에서 절단하여 자궁을 검색 할 수 있습니다. </li><li> 멸균 차가운 1X 인산 버프를 포함하는 배양 접시에 자궁 경적을 배치<html> 겹으로 식염수 (PBS) 부드럽게 씻어. 얼음에 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 난황 내부에 여전히 및 태반을 통해 자궁 벽에 부착 된 배아를 노출 (반대 태반이있는 사이트) 자궁 뿔의 중간 선을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 배아를 무료로 배아 난황을 자르면. </li><li> 멸균 차가운 1X PBS를 포함하는 새로운 배양 접시에서 배아를 놓습니다. 배아 목을 벨과 뒷면에 배치합니다. 심장을 노출 가슴 벽을 자르면. </li><li> 마음을 들어 올려 가슴 벽에서 마음을 무료로 주변의 혈관을 절단하기 위해 멸균 집게를 사용합니다. 수술 도구를 사용하여 심장의 심장 외막이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울이십시오. </li><li> 유출 관 모두 심방을 낸다. 차가운 1X PBS와 다른 요리에 심실을 전송합니다. 얼음 접시를 놓습니다. </li><li> 반복 모든 심실이 검색됩니다 때까지 1.6-1.9 단계를 반복합니다. </li></ol>제작 &quot;&gt; 2. 심 외막 이식편 문화 참고 : 문화 유리 챔버 슬라이드 또는 다운 스트림 애플리케이션을위한 콜라겐 겔에 하나이 심 외막 외식. <ol><li> 유리 챔버 슬라이드 <ol><li> 상기 배양 배지를 준비하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 NG / ml의 재조합 섬유 아세포 성장 인자 2 (FGF2)를 추가한다. 층류 후드의 모든 단계를 수행한다. </li><li> 8 잘 챔버의 각 웰에 500 ㎕의 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 잘의 중심에 각 절제 심실를 놓습니다. 웰의 바닥면 아래로 절개면을 유지하는 심실의 방향. </li><li> 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣어. </li><li> 외식을 준수 할 수 있도록 최소한의 방해와 문화를 유지한다. 심 외막 단분자막의 형성은 48 ~ 72 시간 후에 관찰 할 수있다. </li><li> epicard의 차별화평활근 세포 배양을위한 다른 6일 분화 배지에서 단층 세포 외막에 IAL 세포. 상기 분화 배지 DMEM을 준비하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 ng의 / ml의 재조합 변형 성장 인자 베타 1 (TGF-β1)를 추가한다. </li><li> 다른 일에 배양 배지를 변경합니다. </li></ol></li><li> 콜라겐 젤 <ol><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 3D 콜라겐 배양 키트를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 콜라겐 겔을 준비한다. </li><li> 콜라겐 겔의 원하는 부피를 제조 DMEM의 5 배와 피펫 상하로 콜라겐 용액의 적당량을 혼합한다. 이 솔루션은 노란색 설정해야합니다. </li><li> 중화 액의 대응 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 잘 즉시 섞는다. 이 솔루션은 분홍색으로 바뀝니다. </li><li> 피펫 96- 웰 플레이트의 각 웰에이 혼합물을 100 ㎕. 알을 30-60 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 플레이트를 놓고낮은 겔 중합합니다. </li><li> 각 웰에 전술 배양 배지 200 μl를 추가합니다. </li><li> 잘의 중심에 각 절제 심실를 놓습니다. 동양은 심실은 (실험자에 직면해야 심실의 정점) 콜라겐 젤의 절개면을 아래로 유지합니다. 조심스럽게 다시 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣어. </li><li> 삼일 후, 심실를 제거합니다. 또 다른 2 일간 세포 배양 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. </li><li> 다른 일에 배양 배지를 변경합니다. </li></ol></li></ol> 3. 고정 및 시각화 주 : 외막 세포를 유리 슬라이드 챔버 또는 콜라겐 겔 하나에 가시화 될 수있다. <ol><li> 문화 미디어 대기음하고 세포를 씻어 살균 1X PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 세포를 충당하기 위해 충분한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> PFA를 제거하고 1X PBST (와 1X PBS와 함께 외식을 씻어0.1 % 트리톤 X-100) 세포 Permeabilize 하시려면한다. </li><li> 원하는 항체 (예를 들어, 알렉사 플 루어 488 - 팔로이 딘, ZO-1, α-튜 불린과 α - 평활근 액틴)를 발현 사이 7. </li></ol>

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	<li>Mikawa, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+analysis+of+cardiac+morphogenesis:+discontinuous+formation+of+coronary+vessels.">Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).</li><li>Mikawa, T., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+mesoderm+generates+a+population+of+coronary+smooth+muscle+cells+migrating+into+the+heart+along+with+ingrowth+of+the+epicardial+organ.">Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ.</a> Dev Biol. 174, 221-232 (1996).</li><li>Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+formation+and+developmental+significance+of+the+epicardium:+a+review.">The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review.</a> Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).</li><li>von Gise, A., Pu, W. 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J., Ballard, V. L., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+outgrowth+inhibition+leads+to+compensatory+mesothelial+outflow+tract+collar+and+abnormal+cardiac+septation+and+coronary+formation.">Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation.</a> Circ Res. 87, 969-971 (2000).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Dev Cell. 8, 85-95 (2005).</li><li>Merki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+retinoid+X+receptor+alpha+is+required+for+myocardial+growth+and+coronary+artery+formation.">Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Huang, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+transcription+factors+mediate+epicardial+activation+during+heart+development+and+injury.">C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury.</a> Science. 338, 1599-1603 (2012).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx18+and+the+fate+of+epicardial+progenitors.">Tbx18 and the fate of epicardial progenitors.</a> Nature. 458, 8-9 (2009).</li><li>Rudat, C., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1+and+epicardial+fate+mapping.">Wt1 and epicardial fate mapping.</a> Circ Res. 111, 165-169 (2012).</li><li>Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial+cells+express+Wilms'+tumor-1:+Wt1+expression+in+the+developing,+adult+and+infarcted+heart.">Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).</li><li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+derivation+of+epicardium+and+its+differentiated+smooth+muscle+cell+progeny+from+human+pluripotent+stem+cells.">Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.</a> Development. 142, 1528-1541 (2015).</li><li>Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+the+epicardial+lineage+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

심장 개발과 재생의 심장 외막의 증가 중요성에 부응하기 위해 심장 외막의 연구를 촉진 기술을 개발하는 것이 중요한 것입니다. 심 외막 문화 시스템은 심 외막 연구에 상당한 이점을 포즈. 심 외막 세포를 분리하는 다른 방법은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 것이다. 이 방법은, 다른 계통에서 외막 세포를 분리하는 외막 마커 (또는 형광 단백질의 심장 외막 세포 ...

실험 데이터의 재산은 심장 외막은 심장 개발에 중요한 단계에 영향을 미치는 것을 설명했다. 개발하는 동안, 격벽 transversum는 proepicardium 1-4라고도 중피 세포 덩어리를 일으킨다. proepicardium의 세포는 마이그레이션 및 심장 외막을 형성 심근 봉투. 이 후, 심 외막 세포의 일부는 이후 심근을 침범 심장 외막 유래 세포 (EPDCs)의 철새 인구 EMT주는 상승을 받다. 실험 추적 유전자뿐만 아니라 레트로 바이러스 계보 EPDCs가 평활근 세포, 섬유 아세포, 내피 세포 및 심근 (있는 경우)를 포함한 다양한 계통으로 분화 것을 증명했다. 따라서 EPDCs는 관상 동맥 혈관과 심근 아키텍처 1,2,4-9의 발전에 크게 기여하고 있습니다. 또한, 상기 외막은 심실 컴팩트 10-12 층의 개발이 필수적이다. 전자의 경우xample Gittenberger - 드 그루 등. proepicardium의 생장을 억제하는 등의 얇은 심근, 심장과 비정상적인 심실 중격 형성의 부족 루프로 그 결과, 배아 치사 (13) 결함의 배열에 이르게 것을 보여 주었다. 배아 심장 외막에서 분비 분비 인자는 심근 세포의 증식과 분화를 조절한다. 이과 일치, 같은 레티노 산 (RA), 섬유 아세포 성장 인자 (FGFs)과의 Wnt / β-catenin이 같은 신호 전달 경로의 심장 외막 특정 삭제에 결함이 심근 성장과 배아 치사 14-16의 결과. 심장 외막이 성인의 마음에 대기 것으로 생각되었지만, 최근의 연구는 발달 프로그램은 심장 부상 17, 18 다음 심장 외막에 활성화되는 것으로 나타났습니다. 활성화되면, 세포 EPDC 형성 될 급속한 증식과 EMT를 겪는다. 이러한 세포는 capacit 전시Y는 섬유 아세포 및 평활근 세포가 아니라 심근 세포 또는 혈관 내피 세포 (18)로 분화한다. 또한 EPDCs는 손상된 영역의 혈관에서 지원하므로이 경색 크기를 감소시킴으로써 개선 된 심장 기능을 촉진한다는 proangiogenic 인자를 분비한다. 때문에 이러한 결과로, 심장 외막은 심장 혈관 개발, 질병 및 재생 연구에 대한 관심을 얻고있다. 형질 전환 기술은 21 세기 의학 연구에 혁명을했다. 형질 전환 기술의 도움으로 대사 및 pathophysiologically 인간 조건을 모방 질환 마우스 모델이 성공적으로 개발되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 체의 심 외막 세포의 행동을 연구하는 것은 초기 배아 치사에 주로 도전하고있다. 심장 외막은 심장 개발 및 재생에서 활약하는 중요한 역할을 고려할 때, 우리는 마우스 epicardia에 대한 체외 배양 시스템을 확립리터 세포. 이 방법은 심 외막 세포의 장기 배양이 가능하고 외막의 두 가지 중요한 특성의 상세한 연구를 용이하게한다 : 이동 및 분화하는 능력. 마우스에서 적출 심실은 마이그레이션 분석을 수행하는 데 사용할 수있는 콜라겐 겔상에서 배양 될 수있다. 더 subepicardial 층의 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질을 복제하는 생체 세포 생리학을 되풀이되었습니다 차원 매트릭스에서 배양된다. 대안들은 다음 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 외막 단층을 설정하기 위해 챔버 슬라이드상에서 배양 될 수있다. 이 단분자막은 마이그레이션 중요 EMT를 받아야하는 심장 외막의 능력에 대한 통찰력을 제공한다 꽉 접합 단백질 염색하기 위해 사용될 수있다. 또한, 분화 실험은 이러한 세포상에서 수행 될 수있다. 또한, 유전자 발현 프로파일을 세포로부터 RNA를 추출하여 분석 할 수 있고,정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)을 수행. 마지막으로, 단일 층은 잠재적 인 치료제를 테스트하는 분자 분석 하였다 제로 처리 될 수있다. 함께 넣어,이 심 외막 문화 시스템은 시각화 및 심 외막 개발에 대한 우리의 이해를 발전한다 분자 데이터를 수집 할 수있는 기회를 우리에게 제공한다. 이 방법의 또 다른 바람직한 특징은 간단하고 더 복잡한 설정이 필요하지 않다는 것이다. 간단히, 배아는 심장이 절제되어 E11.5 또는 E12.5 다음에 수확된다. 심실은 콜라겐 젤 또는 챔버 슬라이드 중 하나에 배양. 이어서, 이들 세포는 하류 실험을 수행 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin solution</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T 6074</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-smooth muscle actin (SMA) antibody</td><td>Sigma</td><td>A 2547</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>3D Collagen Culture kit&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>ECM 675</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>NNU 154534-PK</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis kit</td><td>Life Technologies</td><td>11904-018</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

이 배양 프로토콜을 사용하여, 주 외막 세포 하류 애플리케이션 고순도로 분리 할 수​​있다. 배양 된 세포는 EMT를 받아야 마이그레이션 및 심 외막 세포가 생체 내에서와 마찬가지로 구별 할 수 있습니다. 우리의 기본 심 외막 세포 배양의 순도를 결정하기 위해, 우리는 Sema3d GFPCre / +에서 발생하...

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In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

7.4K 조회수.  Duke-NUS Graduate Medical School. The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells. 

비디오: In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

연구

발생학

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Electroporation-based transgenesis of Cardiac cells in mouse hearts(생쥐 심장의 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환)

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

저자 스포트라이트: 신속한 유전자 스크리닝을 위한 심장 세포 형질전환(Cardiac Cell Transgenesis)

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

생물학

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서

요약

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심 외막 파생물 문화 분석 및

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

소설

배아 심실 내피 세포의 분리