Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

이 연구의 동물 부분은 알버타 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 모든 동물 실험 절차 승인 (프로토콜 # AUP00000131)와, 앨버타, 에드먼턴, 캐나다 대학의 대사 연구 단위에서 실시하고, 동물에 따라 마음에 든다고했다 동물 보호 가이드 라인의 캐나다 협의회 (1993)이다. 1. 배아 생산, 총 RNA와 DNase의 치료의 분리 <ol><li> 동물 실험 프로토콜 및 배아 컬렉션에 대한 이전 간행물 17, 18을 참조하십시오. </li><li> 수영장 및 액체 질소의 각 소에서 비슷한 단계의 배아를 동결 스냅 다음 RNA 추출 할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> (키트 정보 자료 목록에서 사용할 수 있습니다) 피코 규모의 샘플에서 RNA를 추출 할 수있는 컬럼 기반의 RNA 추출 키트를 통해 총 RNA를 추출합니다. 참고 : 권장 키트에는 다음이 포함 컨디셔닝 버퍼, 추출를 버퍼를선봉, 70 % 에탄올, 워시 버퍼 1, 세척 버퍼 2, 용출 버퍼, 수집 튜브 및 마이크로 원심 튜브와 RNA 정화 열입니다. </li><li> 튜브 포함 배아에 10 μL 추출 버퍼를 추가하고 42 ° C에서 30 분 동안 품어. 2 분 동안 800 XG에 원심 분리기 튜브는 microcentrifuge 관에 세포 추출물을 수집합니다. </li><li> 정제 컬럼 여과막에 250 μL 냉방 버퍼 피펫. 실온에서 5 분 컨디셔닝 버퍼와 RNA 정제 컬럼 인큐베이션. 1 분 동안 16,000 XG에서 수집 튜브의 정제 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 피펫 RNA 추출 버퍼 및 배아의 혼합물에 70 % 에탄올 10 μL. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 컨디셔닝 정제 칼럼에 피펫 혼합물. </li><li> 100 XG에서 2 분 동안 RNA, 원심 분리기 정화 열을 결합하고 즉시 통해 흐름을 제거하기 위해 30 초 동안 16,000 XG에서 원심 분리하여 수행하십시오. </li><li> 피펫 (100)81, 8,000 X g에서 1 분 동안 정화 열 및 원심 분리기로 세척 버퍼 1의 L. 참고 : DNase를 처리 RNA 분리 한 후 역전사 또는 증폭을 수행하는 경우 권장합니다. </li><li> 바로 단계 1.8 이후 게놈 DNA를 소화. 참고 : 권장 DNase의 키트는 재질 목록에서 사용할 수 있습니다. 추천 키트에는 다음이 포함 DNase의 I 원액 및 버퍼. </li><li> 35 μL 버퍼 5 μL의 DNase I 원액을 혼합하여 DNase의 배양 혼합물을 준비합니다. 부드럽게 반전 섞는다. </li><li> 정화 열 막에 직접 40 μL DNase의 배양 혼합물을 피펫. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. </li><li> 피펫 40 μL 세척 정화 열 막에 버퍼 1과는 15 초 동안 8,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 8,000 X g에서 1 분 동안 정화 열 및 원심 분리기로 피펫 100 μL 세척 버퍼 2. </li><li> 정화 열 및 원심 분리기로 또 다른 100 μL 세척 버퍼 (2) 피펫16,000 × g으로에서 2 분. </li><li> 새로운 0.5 ML의 microcentrifuge 관에 정제 열을 전송합니다. 직접 정제 컬럼의 막 상에 용출 버퍼의 피펫 11 μL. 용출 완충제를 분배하는 동안 막에 용출 버퍼의 최대 흡수를 보장하기 위해 부드럽게 막 표면에 피펫의 끝을 터치. </li><li> 실온에서 1 분 동안 열을 품어. 컬럼에서 용출 버퍼를 배포하는 1,000 XG에서 1 분 동안 열을 원심 분리 한 후 RNA를 용출 16,000 XG에서 1 분 동안 회전. </li><li> RNA의 질과 양 (19)을 평가하기 위해 제조자의 지시에 따라 bioanalyzer 수단을 사용한다. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 RNA 샘플을 저장합니다. </li></ol> 2. 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 증폭 및 라벨링 참고 : RNA 증폭 및 라벨 절차 작업 처음 사용자의 경우, RNA ALO에서 스파이크의 다섯 NG를 사용실제 아르나 샘플을 ng를하면 RNA 증폭 및 혼성화의 품질 제어 측정을 모니터링한다. 스파이크-에서 RNA 믹스는 소정의 비율로 열 체외 합성, 폴리아 데 닐화 성적 증명서가 포함되어 있습니다. 절차가 적절히 수행되면, 표지 사체 구체적 배열 상보 제어 프로브에만 혼성화하고 데이터는 최소한 자기 또는 교차 혼성화와 품질 관리 보증 추적 검사 할 수있다. 배열 및 데이터 분석을 스캔 한 후 제어 세기에 아군과 정상화 절차에 관한 더 자세한 설명은 이전 간행물 20, 21 참조입니다. 다음 절차는 일상적인 마이크로 어레이 사용자에게 제공됩니다. <ol><li> 11 μL - (10)의 총 부피 100 PG 고품질 RNA 시료 (RNA 무결성 번호 (RIN) 값 적어도&gt; 7.0)을 준비한다. </li><li> 증폭 키트에 수있는와 RNA 샘플을 증폭(작은 페이지 100로) 피코 규모의 샘플과 함께 작동합니다. 참고 : 권장 증폭 키트 정보는 재질 목록에서 사용할 수 있으며 수정없이 제조업체의 지침을 따른다. </li><li> 증폭 된 ARNA의 크기 범위의 프로파일을 평가하기 위해 형광 기반의 정량을 사용합니다. </li><li> 증폭 아르나의 농도를 측정하기 위해 (260 및 280 nm에서의 흡광도)을 분광 광도계를 사용하여 악기. </li><li> 라벨에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 증폭 된 ARNA를 저장합니다. </li><li> ULS ARNA 라벨 키트 사용 설명서에 따라 형광 라벨에 대한 증폭 된 RNA의 2 μg의를 사용합니다. 주 : 647 염료 쉽게 오존에 의해 분해되고 광 열화 647 시아닌 색소에 민감한 시아닌 547 시아닌 이후는 표시 순서는 빛의 최소량 및 오존이없는 환경 하에서 이루어진다. </li><li> 오존의 수준까지 오존 상자 (그림 1A)를 켜은 0.001 ppm으로합니다. </li><l난&gt; 시아닌 547 또는 시아닌 647, 라벨 버퍼 2 μL의 2 μL를 추가하여 오존 상자 (그림 1B) 내부의 반응 설치를 수행 한 다음 안전 등 아래의 RNase없는 물 20 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 광원에 암실 필터를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 혼합하고 15 분 동안 85 ° C에서 열 순환기의 튜브를 품어. 적어도 1 분 동안 얼음에 장소 샘플. 사이 영상 염색 표지 증폭 된 RNA를 정리하기 위해 (1.9부터 1.11까지) DNase의 처리에 관한 단계를 제외하고, RNA 추출 키트를 진행하기 전에 튜브의 내용을 수집하는 스핀 다운. </li><li> 측정 및 표시 증폭 된 RNA의 농도를 결정하고 사용하기 전에 3 일간 -80 ° C의 최대 레이블 ARNA을 유지하기 위해 분광 광도계 악기를 사용합니다. </li></ol> 3. 마이크로 어레이 혼성화 및 세척 참고 : 다음 중요한 단계는 2 색의 마이크로 어레이 기반의 유전자 발현 분석 프로토콜에 따라 적응 (버전6.5 2010 년 5 월). <ol><li> 각 시아닌 547- 및 시아닌 647 표지 ARNA에서 ng를 825의 동일한 금액을 추가하고 25 배 조각과 10 배 차단 버퍼와 혼합. </li><li> 15 분 동안 60 ℃에서 혼합물을 가열하고 1 분간 얼음 쿨. </li><li> 배 하이브리드 버퍼의 같은 양을 넣고 잘 섞는다. </li><li> 13,000 rpm에서 원심 분리 후 혼합물 하이브리드에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 배열 슬라이드에 혼합물로부터 100 μL를 넣고 하이브리드 챔버 내부의 슬라이드를 밀봉. </li><li> 오븐에서 10 rpm으로 회전 65 ° C에서 17 시간 동안 하이브리드 오븐에 조립 챔버를 넣습니다. </li><li> 안정화에 담그고 30 초 동안 용액을 건조하여 오존 보호 치료 프로토콜에 따라 배열을 씻으십시오. </li><li> 어떤 먼지 입자를 용액에서 배열을 제거하고 배열 표면이 건조되어 있는지 확인 </li></ol> 4. 스캔 마이크로 어레이 슬라이드 <ol><li> 어두운 곳에서 배열을 유지하고 scann를 켭니다ER는 (15 분 대기 시간)을 사용하도록 준비 될 때까지. </li><li> 스캐너에, 왼쪽에있는 배열 바코드를 넣고 스캔을 시작합니다. 소프트웨어 사용자 설명서에 따라 현장 분석을 수행하고 (GPR) 파일 형식으로 데이터를 저장합니다. </li></ol> 5. 통계 분석 <ol><li> FlexArray 소프트웨어 http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php &quot;가져 오기 원시 데이터&quot;를 클릭하고 FlexArray에 GPR 파일을로드를 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> 필요한 경우 명령에 따라 정규화 및 통계 분석을 수행합니다. 참고 : 이전에 22 한 바와 같이 본 연구에서 긍정적 인 장소 선택에 대한 임계 값을 계산합니다. </li><li> 모든 혼성 관광 명소 및 배경 신호를 볼 수있는 FlexArray의 줄거리 뷰어에서 수동 드롭 다운 메뉴를 선택합니다. 주 : 마이크로 어레이에 하이브리드 후 컨트롤에 아군의 비슷한 그림은 이전 연구 (8)에서 볼 수 있습니다. </li><li> 선택FlexArray에서 배열 정규화 과정 사이의 분위수에 의해 다음과 같은 배열 내 황토 정상화 따라 매뉴얼을 내려 놓습니다. </li><li> 엑셀로 FlexArray의 모든 정규화 된 데이터를 내보내기하는 것은 더 사용을 위해 파일. </li></ol> 6. 생물 정보학 분석 소 태아 특이 성적로부터 프로브 시퀀스의 원래 주석은 (BESTv1) 마이크로 어레이는 이미 8 설명되었다. 본 연구에서는 20,403 고유 한 유전자 기호 (GS)을 (를 얻었다 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">을 File1을 보충</a> EmbryoGENE 실험실 정보 관리 시스템 (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca)을 통해). 6765 고유 한 유전자 (목록이 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">있는 File2 보조 식품</a> )을 선택하고 마이크로 어레이 정규화 과정 이후의 모든 긍정적 인 신호 (5 단계에 해당되었다0.5) 7 일 소 태아 유전자 발현 프로파일에서. 포지티브 신호 임계치는 A 값의 신호 강도로부터 투과성 공보 16에 기초하여 계산 하였다. <ol><li> 분류 시스템 (23), 24 (진화 관계를 통해 단백질 분석) PANTHER와 기능 분석을 수행하려면 다음 링크 (http://www.pantherdb.org/about.jsp)을 엽니 다. </li><li> 통계 overrepresentation 테스트를 사용하여 배아 개발하는 동안 특정 생물학적 과정을 확인하고 참조 목록 25 보스 황소의 기본 설정 (데이터베이스의 모든 유전자)를 사용하는 6765 배아 특정 GS의 목록을 업로드합니다. 참고 :이 통계적으로 과다 또는 발현 이항 테스트를 사용하는 GO 용어에서 발달 관련 프로세스의 식별을 할 수 있습니다. </li><li> 소프트웨어 기본값으로 &lt;0.05에서 설정 P-값 임계 값. 데이터 다운로드 및 엑스포 될 수있다추가 선택 16 Excel 파일로 rted. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Reprogramming.">Nuclear Reprogramming.</a> Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).</li><li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+(MAQC)+project.">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

첫 번째 문제는 유전자 발현 연구를위한 고품질의 RNA의 충분한 양을 받고 있지 않은 7 일 소 배아를 이용한 마이크로 어레이 분석을 수행한다. 기존의 페놀 / 클로로포름 RNA 추출 및 에탄올 침전 방법은 낮은 수율 및 RNA 증폭 반응 억제 할 수 남은 페놀의 결과로, 7 일 배아를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신에, 기준 열 기초 방법은 총 RNA를 분리 한 후 농도를 높이기 위해 최소 용출 버퍼로 RNA를 ...

높은 생산 젖소의 초기 배아 손실은 낙농 산업 1, 2의 주요 과제 중 하나입니다. 소는 그들의 유사한 발달 과정 3, 4 인간의 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미있는 모델이되고있다. 그러나, 더 많은 연구가 소 초기 배아 발달에 관여하는 유전자에 대한 이해가 요구된다. 첫 마이크로 어레이 기술 보낸 이십년 1995 5 개발 후보다 정교한 프로브 제작 기술 감소 인쇄 오류 및 마이크로 어레이 내의 상이한 플랫폼 (6) 사이의 어레이 칩의 변동의 개발. 개선 된 마이크로 어레이 기술은 초기 배아 질문에, 최근 임상 연구 7에서이 기술을 널리 응용 프로그램에서 결과를 uality 평가 (8). 마이크로 어레이 기술에 필요한 재료의 양이 큰 마이크로 어레이 기술은 초기에 초기 배아 발달로 연구 분야의 번호를 입력 못한 주된 이유이다. 최근 RNA 증폭 방법은 선형 RNA 재료 (9)를 시작 서브 나노 그램에서 마이크로 그램 수준까지 RNA를 증폭하도록 개선되었다. 시장에서 사용할 수있는 여러 상업 RNA 증폭 키트가 있습니다; 그러나, 더 많은 인기를 잘 개발 키트는 Ribo를 싱글 프라이머 등온 증폭 (10) 관련 및 T7 프로모터 (11) 방법을 구동된다. 가장 인기있는 안티센스 RNA 증폭는 5 &#39;말단 (12)에 T7 프로모터에 연결하는 올리고 DT 프라이머와 시험 관내 전사에 사용합니다. 이 기술은 선형 증폭 후에 F 대표적인 안티센스 전 사체를 최대한 유지할 수 있도록또는 배열 하이브리드 13. 이 방법은 소 배아 (8)로부터 추출 된 총 RNA의 피코 그램 수준을 증폭하도록하고있다. 유니버설 링크 시스템 (ULS)를 직접 구아닌 (14)의 N7 위치에 배위 결합을 형성함으로써, 백금 결합 된 형광 염료 중 하나 시아닌 (547) 또는 시아닌 647로 DNA 또는 RNA 증폭을 통합 라벨링 방법입니다. 이 방법은 ARNA이 효소 방법 (15)에 의해 생성 된 수정 된 아미노 알릴에 비해 수정하지 않고 ARNA 증폭보다 안정적인 생성하는 배아 연구에 적응했다. 단일 염료와 두 개의 염료 라벨 두 가지 방법은 마이크로 어레이에 범용 연계 시스템을 사용하여 적용하고있다. 큰 마이크로 어레이의 비교 연구는 단일 및 두 개 컬러 배열 플랫폼 (6) 사이의 데이터 품질의 상관 관계가 있다고 하였다. 최근 두 T7 프로모터 드라이브N 안티센스 RNA 증폭 ULS 라벨링 방법은 마이크로 어레이 혼성화 8 16 아르나 물질을 표지 고품질의 충분한 양을 생성하기위한 더 신뢰성있는 프로토콜을 제공하기 위해 개발되었다. 따라서 본 연구는 예를 들어 7 일 소 배아를 사용하여 두 개의 색상에 관련된 마이크로 어레이 데이터 분석 RNA 추출의 중요한 단계 중 일부를 입증하는 프로토콜을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>KIT0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instruments</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Screen Tape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULS Fluorescent Labeling Kit</td>
			<td>Kreatech Diagnostics</td>
			<td>EA-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Gene Expression Microarrays</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2514F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Agilent Gene Expression wash buffer 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Part #5188-5325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression wash buffer 2</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Part #5188-5326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Hi-RPM Hybridization buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>&#160;Part #5190-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X Fragment buffer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Part #5185-5974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X GE Blocking Agent</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Part #5188-5281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilization and drying solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>&#160;Part #5185-5979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2524-60012</td>
			<td>Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Color RNA Spike-In Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>&#160;Cat# 5188-5279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B array scanner</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GENEPIX 4000B-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ozone Free Box</td>
			<td>BioTray</td>
			<td>OFB_100x200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL file</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptome profiling of in-vivo produced bovine pre-implantation embryos using two-color microarray platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

7 일 소 배아로부터 총 RNA 증폭 아르나의 대표적인 결과가도 3에 도시되고 표 1에 요약 하였다. RNA 무결성 및 프로파일은 RNA 추출 후 평가 될 수있다. RNA의 질 평가 bioanalyzer 기기 (도 3a) 및 이상 7.0 증폭 (표 1)에 사용되는 자격 RIN 값들만 샘플에 의해 수행 될 수있다. <p class="...

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Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

7.7K 조회수.  University of Alberta. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies and neurological impairments. With a complex pathology, FASD affects approximately 1 in 100 children born in the United States each year. Due to the highly variable nature of FASD, animal models have proven critical in our current mechanistic understanding of ethanol-induced development defects. An increasing number of laboratories has focused on using zebrafish to examine ethanol-induced developmental defects. Zebrafish produce large numbers of externally fertilized, genetically tractable, translucent embryos. This allows researchers to precisely control timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts and quantify the impact of embryonic ethanol exposure through live imaging techniques. This, combined with the high degree of conservation of both genetics and development with humans, has proven zebrafish to be a powerful model in which to study the mechanistic basis of ethanol teratogenicity. However, ethanol exposure regimens have varied between different zebrafish studies, which has confounded the interpretation of zebrafish data across these studies. Here is a protocol to quantify ethanol concentrations in zebrafish embryos using head space gas chromatography.

This work describes a protocol to quantify ethanol levels in a zebrafish embryo using head space gas chromatography from proper exposure methods to embryo processing and ethanol analysis.

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...