Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

이 연구의 동물 부분은 알버타 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 모든 동물 실험 절차 승인 (프로토콜 # AUP00000131)와, 앨버타, 에드먼턴, 캐나다 대학의 대사 연구 단위에서 실시하고, 동물에 따라 마음에 든다고했다 동물 보호 가이드 라인의 캐나다 협의회 (1993)이다. 1. 배아 생산, 총 RNA와 DNase의 치료의 분리 <ol><li> 동물 실험 프로토콜 및 배아 컬렉션에 대한 이전 간행물 17, 18을 참조하십시오. </li><li> 수영장 및 액체 질소의 각 소에서 비슷한 단계의 배아를 동결 스냅 다음 RNA 추출 할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> (키트 정보 자료 목록에서 사용할 수 있습니다) 피코 규모의 샘플에서 RNA를 추출 할 수있는 컬럼 기반의 RNA 추출 키트를 통해 총 RNA를 추출합니다. 참고 : 권장 키트에는 다음이 포함 컨디셔닝 버퍼, 추출를 버퍼를선봉, 70 % 에탄올, 워시 버퍼 1, 세척 버퍼 2, 용출 버퍼, 수집 튜브 및 마이크로 원심 튜브와 RNA 정화 열입니다. </li><li> 튜브 포함 배아에 10 μL 추출 버퍼를 추가하고 42 ° C에서 30 분 동안 품어. 2 분 동안 800 XG에 원심 분리기 튜브는 microcentrifuge 관에 세포 추출물을 수집합니다. </li><li> 정제 컬럼 여과막에 250 μL 냉방 버퍼 피펫. 실온에서 5 분 컨디셔닝 버퍼와 RNA 정제 컬럼 인큐베이션. 1 분 동안 16,000 XG에서 수집 튜브의 정제 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 피펫 RNA 추출 버퍼 및 배아의 혼합물에 70 % 에탄올 10 μL. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 컨디셔닝 정제 칼럼에 피펫 혼합물. </li><li> 100 XG에서 2 분 동안 RNA, 원심 분리기 정화 열을 결합하고 즉시 통해 흐름을 제거하기 위해 30 초 동안 16,000 XG에서 원심 분리하여 수행하십시오. </li><li> 피펫 (100)81, 8,000 X g에서 1 분 동안 정화 열 및 원심 분리기로 세척 버퍼 1의 L. 참고 : DNase를 처리 RNA 분리 한 후 역전사 또는 증폭을 수행하는 경우 권장합니다. </li><li> 바로 단계 1.8 이후 게놈 DNA를 소화. 참고 : 권장 DNase의 키트는 재질 목록에서 사용할 수 있습니다. 추천 키트에는 다음이 포함 DNase의 I 원액 및 버퍼. </li><li> 35 μL 버퍼 5 μL의 DNase I 원액을 혼합하여 DNase의 배양 혼합물을 준비합니다. 부드럽게 반전 섞는다. </li><li> 정화 열 막에 직접 40 μL DNase의 배양 혼합물을 피펫. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. </li><li> 피펫 40 μL 세척 정화 열 막에 버퍼 1과는 15 초 동안 8,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 8,000 X g에서 1 분 동안 정화 열 및 원심 분리기로 피펫 100 μL 세척 버퍼 2. </li><li> 정화 열 및 원심 분리기로 또 다른 100 μL 세척 버퍼 (2) 피펫16,000 × g으로에서 2 분. </li><li> 새로운 0.5 ML의 microcentrifuge 관에 정제 열을 전송합니다. 직접 정제 컬럼의 막 상에 용출 버퍼의 피펫 11 μL. 용출 완충제를 분배하는 동안 막에 용출 버퍼의 최대 흡수를 보장하기 위해 부드럽게 막 표면에 피펫의 끝을 터치. </li><li> 실온에서 1 분 동안 열을 품어. 컬럼에서 용출 버퍼를 배포하는 1,000 XG에서 1 분 동안 열을 원심 분리 한 후 RNA를 용출 16,000 XG에서 1 분 동안 회전. </li><li> RNA의 질과 양 (19)을 평가하기 위해 제조자의 지시에 따라 bioanalyzer 수단을 사용한다. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 RNA 샘플을 저장합니다. </li></ol> 2. 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 증폭 및 라벨링 참고 : RNA 증폭 및 라벨 절차 작업 처음 사용자의 경우, RNA ALO에서 스파이크의 다섯 NG를 사용실제 아르나 샘플을 ng를하면 RNA 증폭 및 혼성화의 품질 제어 측정을 모니터링한다. 스파이크-에서 RNA 믹스는 소정의 비율로 열 체외 합성, 폴리아 데 닐화 성적 증명서가 포함되어 있습니다. 절차가 적절히 수행되면, 표지 사체 구체적 배열 상보 제어 프로브에만 혼성화하고 데이터는 최소한 자기 또는 교차 혼성화와 품질 관리 보증 추적 검사 할 수있다. 배열 및 데이터 분석을 스캔 한 후 제어 세기에 아군과 정상화 절차에 관한 더 자세한 설명은 이전 간행물 20, 21 참조입니다. 다음 절차는 일상적인 마이크로 어레이 사용자에게 제공됩니다. <ol><li> 11 μL - (10)의 총 부피 100 PG 고품질 RNA 시료 (RNA 무결성 번호 (RIN) 값 적어도&gt; 7.0)을 준비한다. </li><li> 증폭 키트에 수있는와 RNA 샘플을 증폭(작은 페이지 100로) 피코 규모의 샘플과 함께 작동합니다. 참고 : 권장 증폭 키트 정보는 재질 목록에서 사용할 수 있으며 수정없이 제조업체의 지침을 따른다. </li><li> 증폭 된 ARNA의 크기 범위의 프로파일을 평가하기 위해 형광 기반의 정량을 사용합니다. </li><li> 증폭 아르나의 농도를 측정하기 위해 (260 및 280 nm에서의 흡광도)을 분광 광도계를 사용하여 악기. </li><li> 라벨에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 증폭 된 ARNA를 저장합니다. </li><li> ULS ARNA 라벨 키트 사용 설명서에 따라 형광 라벨에 대한 증폭 된 RNA의 2 μg의를 사용합니다. 주 : 647 염료 쉽게 오존에 의해 분해되고 광 열화 647 시아닌 색소에 민감한 시아닌 547 시아닌 이후는 표시 순서는 빛의 최소량 및 오존이없는 환경 하에서 이루어진다. </li><li> 오존의 수준까지 오존 상자 (그림 1A)를 켜은 0.001 ppm으로합니다. </li><l난&gt; 시아닌 547 또는 시아닌 647, 라벨 버퍼 2 μL의 2 μL를 추가하여 오존 상자 (그림 1B) 내부의 반응 설치를 수행 한 다음 안전 등 아래의 RNase없는 물 20 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 광원에 암실 필터를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 혼합하고 15 분 동안 85 ° C에서 열 순환기의 튜브를 품어. 적어도 1 분 동안 얼음에 장소 샘플. 사이 영상 염색 표지 증폭 된 RNA를 정리하기 위해 (1.9부터 1.11까지) DNase의 처리에 관한 단계를 제외하고, RNA 추출 키트를 진행하기 전에 튜브의 내용을 수집하는 스핀 다운. </li><li> 측정 및 표시 증폭 된 RNA의 농도를 결정하고 사용하기 전에 3 일간 -80 ° C의 최대 레이블 ARNA을 유지하기 위해 분광 광도계 악기를 사용합니다. </li></ol> 3. 마이크로 어레이 혼성화 및 세척 참고 : 다음 중요한 단계는 2 색의 마이크로 어레이 기반의 유전자 발현 분석 프로토콜에 따라 적응 (버전6.5 2010 년 5 월). <ol><li> 각 시아닌 547- 및 시아닌 647 표지 ARNA에서 ng를 825의 동일한 금액을 추가하고 25 배 조각과 10 배 차단 버퍼와 혼합. </li><li> 15 분 동안 60 ℃에서 혼합물을 가열하고 1 분간 얼음 쿨. </li><li> 배 하이브리드 버퍼의 같은 양을 넣고 잘 섞는다. </li><li> 13,000 rpm에서 원심 분리 후 혼합물 하이브리드에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 배열 슬라이드에 혼합물로부터 100 μL를 넣고 하이브리드 챔버 내부의 슬라이드를 밀봉. </li><li> 오븐에서 10 rpm으로 회전 65 ° C에서 17 시간 동안 하이브리드 오븐에 조립 챔버를 넣습니다. </li><li> 안정화에 담그고 30 초 동안 용액을 건조하여 오존 보호 치료 프로토콜에 따라 배열을 씻으십시오. </li><li> 어떤 먼지 입자를 용액에서 배열을 제거하고 배열 표면이 건조되어 있는지 확인 </li></ol> 4. 스캔 마이크로 어레이 슬라이드 <ol><li> 어두운 곳에서 배열을 유지하고 scann를 켭니다ER는 (15 분 대기 시간)을 사용하도록 준비 될 때까지. </li><li> 스캐너에, 왼쪽에있는 배열 바코드를 넣고 스캔을 시작합니다. 소프트웨어 사용자 설명서에 따라 현장 분석을 수행하고 (GPR) 파일 형식으로 데이터를 저장합니다. </li></ol> 5. 통계 분석 <ol><li> FlexArray 소프트웨어 http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php &quot;가져 오기 원시 데이터&quot;를 클릭하고 FlexArray에 GPR 파일을로드를 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> 필요한 경우 명령에 따라 정규화 및 통계 분석을 수행합니다. 참고 : 이전에 22 한 바와 같이 본 연구에서 긍정적 인 장소 선택에 대한 임계 값을 계산합니다. </li><li> 모든 혼성 관광 명소 및 배경 신호를 볼 수있는 FlexArray의 줄거리 뷰어에서 수동 드롭 다운 메뉴를 선택합니다. 주 : 마이크로 어레이에 하이브리드 후 컨트롤에 아군의 비슷한 그림은 이전 연구 (8)에서 볼 수 있습니다. </li><li> 선택FlexArray에서 배열 정규화 과정 사이의 분위수에 의해 다음과 같은 배열 내 황토 정상화 따라 매뉴얼을 내려 놓습니다. </li><li> 엑셀로 FlexArray의 모든 정규화 된 데이터를 내보내기하는 것은 더 사용을 위해 파일. </li></ol> 6. 생물 정보학 분석 소 태아 특이 성적로부터 프로브 시퀀스의 원래 주석은 (BESTv1) 마이크로 어레이는 이미 8 설명되었다. 본 연구에서는 20,403 고유 한 유전자 기호 (GS)을 (를 얻었다 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">을 File1을 보충</a> EmbryoGENE 실험실 정보 관리 시스템 (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca)을 통해). 6765 고유 한 유전자 (목록이 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">있는 File2 보조 식품</a> )을 선택하고 마이크로 어레이 정규화 과정 이후의 모든 긍정적 인 신호 (5 단계에 해당되었다0.5) 7 일 소 태아 유전자 발현 프로파일에서. 포지티브 신호 임계치는 A 값의 신호 강도로부터 투과성 공보 16에 기초하여 계산 하였다. <ol><li> 분류 시스템 (23), 24 (진화 관계를 통해 단백질 분석) PANTHER와 기능 분석을 수행하려면 다음 링크 (http://www.pantherdb.org/about.jsp)을 엽니 다. </li><li> 통계 overrepresentation 테스트를 사용하여 배아 개발하는 동안 특정 생물학적 과정을 확인하고 참조 목록 25 보스 황소의 기본 설정 (데이터베이스의 모든 유전자)를 사용하는 6765 배아 특정 GS의 목록을 업로드합니다. 참고 :이 통계적으로 과다 또는 발현 이항 테스트를 사용하는 GO 용어에서 발달 관련 프로세스의 식별을 할 수 있습니다. </li><li> 소프트웨어 기본값으로 &lt;0.05에서 설정 P-값 임계 값. 데이터 다운로드 및 엑스포 될 수있다추가 선택 16 Excel 파일로 rted. </li></ol>

<ol>
	<li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+in+dairy+cows:+bridging+the+gaps.">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li><li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions.">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li><li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos.">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li><li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF.">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+(MAQC)+project.">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li><li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome.">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li><li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays.">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li><li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+available+for+profiling+small+samples:+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling.">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li><li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+isothermal,+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications.">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li><li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+RNA+Amplification:+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells.">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li><li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation.">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).</li><li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Linkage+System:+versatile+nucleic+acid+labeling+technique.">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li><li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays.">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li><li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+porcine+(Sus+scofa)+embryo-specific+microarray:+array+annotation+and+validation.">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370 (2012).</li><li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulatory+response+and+embryo+production+in+Holstein+cows+fed+diets+enriched+in+oleic,+linoleic+or+&#945;-linolenic+acid.">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or &#945;-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li><li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows.">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li><li>. Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack)">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack)</a> (2016)</li><li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+analysis+of+benchmark+datasets+for+Agilent+two-color+microarray.">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).</li><li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset.">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li><li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species.">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li><li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER:+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function.">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PANTHER+database+of+protein+families,+subfamilies,+functions+and+pathways.">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system.">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li><li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos.">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li><li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development.">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li><li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development.">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li><li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis.">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li><li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Reprogramming.">Nuclear Reprogramming.</a> Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).</li><li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+(MAQC)+project.">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

첫 번째 문제는 유전자 발현 연구를위한 고품질의 RNA의 충분한 양을 받고 있지 않은 7 일 소 배아를 이용한 마이크로 어레이 분석을 수행한다. 기존의 페놀 / 클로로포름 RNA 추출 및 에탄올 침전 방법은 낮은 수율 및 RNA 증폭 반응 억제 할 수 남은 페놀의 결과로, 7 일 배아를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신에, 기준 열 기초 방법은 총 RNA를 분리 한 후 농도를 높이기 위해 최소 용출 버퍼로 RNA를 ...

높은 생산 젖소의 초기 배아 손실은 낙농 산업 1, 2의 주요 과제 중 하나입니다. 소는 그들의 유사한 발달 과정 3, 4 인간의 착상 전 배아 발달을 연구하는 흥미있는 모델이되고있다. 그러나, 더 많은 연구가 소 초기 배아 발달에 관여하는 유전자에 대한 이해가 요구된다. 첫 마이크로 어레이 기술 보낸 이십년 1995 5 개발 후보다 정교한 프로브 제작 기술 감소 인쇄 오류 및 마이크로 어레이 내의 상이한 플랫폼 (6) 사이의 어레이 칩의 변동의 개발. 개선 된 마이크로 어레이 기술은 초기 배아 질문에, 최근 임상 연구 7에서이 기술을 널리 응용 프로그램에서 결과를 uality 평가 (8). 마이크로 어레이 기술에 필요한 재료의 양이 큰 마이크로 어레이 기술은 초기에 초기 배아 발달로 연구 분야의 번호를 입력 못한 주된 이유이다. 최근 RNA 증폭 방법은 선형 RNA 재료 (9)를 시작 서브 나노 그램에서 마이크로 그램 수준까지 RNA를 증폭하도록 개선되었다. 시장에서 사용할 수있는 여러 상업 RNA 증폭 키트가 있습니다; 그러나, 더 많은 인기를 잘 개발 키트는 Ribo를 싱글 프라이머 등온 증폭 (10) 관련 및 T7 프로모터 (11) 방법을 구동된다. 가장 인기있는 안티센스 RNA 증폭는 5 &#39;말단 (12)에 T7 프로모터에 연결하는 올리고 DT 프라이머와 시험 관내 전사에 사용합니다. 이 기술은 선형 증폭 후에 F 대표적인 안티센스 전 사체를 최대한 유지할 수 있도록또는 배열 하이브리드 13. 이 방법은 소 배아 (8)로부터 추출 된 총 RNA의 피코 그램 수준을 증폭하도록하고있다. 유니버설 링크 시스템 (ULS)를 직접 구아닌 (14)의 N7 위치에 배위 결합을 형성함으로써, 백금 결합 된 형광 염료 중 하나 시아닌 (547) 또는 시아닌 647로 DNA 또는 RNA 증폭을 통합 라벨링 방법입니다. 이 방법은 ARNA이 효소 방법 (15)에 의해 생성 된 수정 된 아미노 알릴에 비해 수정하지 않고 ARNA 증폭보다 안정적인 생성하는 배아 연구에 적응했다. 단일 염료와 두 개의 염료 라벨 두 가지 방법은 마이크로 어레이에 범용 연계 시스템을 사용하여 적용하고있다. 큰 마이크로 어레이의 비교 연구는 단일 및 두 개 컬러 배열 플랫폼 (6) 사이의 데이터 품질의 상관 관계가 있다고 하였다. 최근 두 T7 프로모터 드라이브N 안티센스 RNA 증폭 ULS 라벨링 방법은 마이크로 어레이 혼성화 8 16 아르나 물질을 표지 고품질의 충분한 양을 생성하기위한 더 신뢰성있는 프로토콜을 제공하기 위해 개발되었다. 따라서 본 연구는 예를 들어 7 일 소 배아를 사용하여 두 개의 색상에 관련된 마이크로 어레이 데이터 분석 RNA 추출의 중요한 단계 중 일부를 입증하는 프로토콜을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA Screen Tape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Fluorescent Labeling Kit</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Expression Microarrays</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression wash buffer 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Hybridization buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragment buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Blocking Agent</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Stabilization and drying solution</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Part #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide</td></tr><tr><td>Two-Color RNA Spike-In Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B array scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Ozone Free Box</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GAL file</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome profiling of in-vivo produced bovine pre-implantation embryos using two-color microarray platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

7 일 소 배아로부터 총 RNA 증폭 아르나의 대표적인 결과가도 3에 도시되고 표 1에 요약 하였다. RNA 무결성 및 프로파일은 RNA 추출 후 평가 될 수있다. RNA의 질 평가 bioanalyzer 기기 (도 3a) 및 이상 7.0 증폭 (표 1)에 사용되는 자격 RIN 값들만 샘플에 의해 수행 될 수있다. <p class="...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform at JoVE.com

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

7.7K 조회수.  University of Alberta. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

비디오: Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

형광 단백질의 발현에<em&gt; 창고 기</em&gt; 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

연구

발생학

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

유전학

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, the ability to determine an embryo&#39;s sex is necessary in many experiments particularly regarding early development. The present protocol demonstrates an inexpensive, rapid and non-toxic preparation of pig genomic DNA for use with PCR. Day 30 embryos must be humanely collected according to the guidelines established by Institutional Animal Policy and Welfare Committees for the present protocol. The preparation of the whole embryo for this PCR based sexing technique simply involves grinding the frozen embryo to a fine powder using a pre-chilled mortar and pestle. PCR-quality DNA is released from a small amount of embryo powder by applying a hot incubation in an alkaline lysis reagent. Next, the DNA solution is mixed with neutralization buffer and used directly for PCR. Two primer pairs are generated to detect specific sex determining region of the Y- chromosome (SRY) and ZFX region of the X- chromosome with high accuracy and specificity. The same protocol can be applied to other elongated embryos (Day 10 to Day 14) earlier than Day 30. Also, this protocol can be carried with 96-welled plates when screening a large number of embryos, making it feasible for automation and high-throughput sex typing.

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

의 사체 프로파일 링

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

형광 단백질의 발현에

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

를 사용하여 기능성 복제

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

전체 산

의 사체 프로파일 링

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

형광 단백질의 발현에

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

를 사용하여 기능성 복제

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

전체 산

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기