저자는 축산은 &quot;Animalerie 센트 드 지프 쉬르 이베트&quot;에 의해 지원을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) FP6 부여 &quot;Embryomics&quot;에 의해 ANR 부여 &quot;에 의해, 마이클 슈베르트에 ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 및 ANR-11-JSV2-002-01)에서 기금에 의해 지원되었다 ANR- 장 - 프랑수아 니콜라스와 나딘 Peyriéras에 10 BLAN-121801 데브 - 프로세스 &quot;. 주앙 엠마누엘 카르발류는 FCT 박사 교제에 의해 자금을 조달 (SFRH / BD / 2,012분의 86,878). 여기에 설명 된 벡터에 대한 요청은 저자에게 직접 해결할 수 있습니다.

악기 및 시약 1. 준비 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 파스퇴르 피펫을 전송 <ol><li> 다른 속도로 불꽃보다 230mm 긴 파스퇴르 피펫을 잡아 당겨 다른 팁 직경 전송 파스퇴르 피펫의 시리즈를 생성합니다. 테이퍼이기도의 부드럽고 미세한 제어를위한 가능한 한 긴 있는지 확인하십시오. </li><li> 다이아몬드 스크라이브으로 수직 피펫의 길이에 따라 라인 피펫 긁힐. 두 손으로 무딘 컷을 생성하기 위해 길이로 피펫 평행을 당깁니다. 신속 불꽃 폴란드어 끝을 밀봉하지 않고 피펫. </li><li> , 200 ~ 400 μm의 (직경 500 μm의 주위에) 수정란를 들어, 600 μm의 미 수정 난자에 대한 300 ~ 400 μm의 (직경 150 μm의 주위에) : 난자 / 배아의 무대와 팁의 직경은 피펫 수에 따라 달라질 부화 neurulae합니다. 입 모니터링 흡인 튜브를 사용 피펫은 한 접시에서 난자 / 배아를 전송합니다다른. </li></ol></li><li> 주사 바늘 <ol><li> 의 RNase없는 조건을 보장하기 위해 장갑과 모세 혈관을 조작합니다. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다. </li><li> 모세 혈관이 자료 목록에 설명 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우, 다음 설정을 사용 : 열 (600), 속도 (80), 시간 (60), 압력 (200) 또는 그렇지 않으면 300 (50)를 당겨, 모양, 어떤 보장 성공적인 주사에 매우 중요, 다음 속성 그림 2에 도시 한 바와 같이 : 4-8 μm의 외부 팁 직경 2cm 테이퍼 길이. 참고 : 바늘은 산란기 전에 뽑아 시즌 내내 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 5 % 페놀 레드 원액 (4 배) <ol><li> 각 산란기 전에 신선한 준비합니다. </li><li> 0.22 μm의 여과 튜브에서 페놀 적색 분말을 25㎎ 달아. </li><li> 에 DNase-과의 RNA 분해 효소가없는 물을 0.5 ML을 추가분체를 함유하는 튜브. </li><li> 용액을 필터링 소독과 주사 바늘을 방해 할 수있는 결정을 제거하여 실온에서 18,000 XG에 3-5 분 동안 스핀. </li><li> 4 ° C에서 보관 또는 -20 ° C에서 250 μL 씩 저장합니다. </li></ol></li><li> / ㎖ 폴리 라이신 솔루션 0.25 mg의 <ol><li> 각 산란기 전에 신선한 준비합니다. </li><li> 증류수 20ml에 폴리 -L- 라이신 5㎎을 녹인다. -20 ℃에서 5 ㎖ 씩. </li><li> 폴리 라이신 코팅 요리에 난자의 재현과 강력한 접착력을 보장하기 위해 한 번만 즉시 해동 나누어지는을 사용합니다. </li></ol></li><li> mRNA의 합성 <ol><li> 각 산란기 전에 신선한 준비합니다. </li><li> (37 ° C에서 보통 2 시간 동안) 적절한 효소를 사용하여 원하는 DNA의 5 μg의 선형화. 소화의 완전성을 확인하려면 20 분 150 W에서 TBE 버퍼에 1 % 아가로 오스-TBE 겔에 소화 믹스의 볼륨에 2 %를 실행합니다. </li><li> 원격 교육의 압축을 풉니 다24 : 1 페놀 (PH 8.0) : 클로로포름 : 25 음 공인 DNA 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기 18,000 XG에 10 분 수성 (위) 단계를 수집하기위한 소용돌이. </li><li> (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이. </li><li> 10 : 300 선형화 된 DNA : 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) : -20 ℃에서 밤새 100 % 에탄올 100 선형화 된 DNA를 침전. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 70 % 에탄올로 씻어. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 건조 및 재현 탁 0.5 ㎍ / μL의 최종 농도 보자. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, 적절한 폴리머 라제 mRNA의 합성 키트를 사용하여 선형화 된 DNA 1 μg의 속기. </li><li> 1 페놀 (PH 4.7) : 5의 mRNA를 추출 키트와 함께 제공된 클로로포름, 초산 암모늄 스톱 솔루션을. </li><li> 20 초 동안 소용돌이, CEntrifuge XG 18,000에서 10 분 및 수성 상을 수집한다. </li><li> (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이. </li><li> 밤새도록 -20 ℃에서 100 % 이소프로판올 mRNA의 침전. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 80 % 에탄올에 씻어. </li><li> 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 그 다음, 재현 탁 어려울 수있는 바와 같이 더 이상보다 50-10 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛을 보자. 적어도 2 ㎍ / μL 최종 농도 DNase-과의 RNase가없는 물에 재현 탁 사출 믹스 흉 mRNA의 최종 농도를 보장한다. </li><li> 상기 전사 제품의 품질과 크기를 확인을 20 분 동안 150 W에서 TBE 버퍼의 RNase가없는 1 % 아가 로즈 겔상에서 TBE mRNA를 0.5 μL를 실행한다. 스토어 -80 ° C에서 2 μL 씩. </li></ol></li><li> 폴리 리신 - 코팅 요리 참고 : 폴리 라이신 COA테드 요리를 주입하는 동안 난자를 고정하는 데 사용됩니다. <ol><li> 각 35mm 배양 세포 배양 접시 (총 5)의 경우, 해동 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 리신 용액 1 ㎖와 함께 배양 접시의 저면을 커버. 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 각 35mm 세포 배양 페트리 접시 (총 5)의 경우, 다른 35mm 세포 배양 페트리 접시에 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 전송합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 배양 접시 건조, 거꾸로 보자. </li><li> 일주일 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 플라스틱 포장에 싸여 폴리 라이신 코팅 요리를 저장합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 코팅 요리 참고 : 그들은 문화를 주입 배아하는 데 사용됩니다. 아가로 오스는 주입 된 배아의 쿠션을 제공하고 접시의 바닥에 달라 붙는을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 인공 해수 (ASW) 37~38g / L의 통신을 사용합니다역삼 투 물에 ercial 염 + 0.25 mM의의 NaHCO3. </li><li> 전자 레인지에서 가열하여 용액을 0.22 μm의 필터 ASW에서 1 % 아가로 오스의 농도로 녹여. </li><li> 신속히 요리의 매우 얇은 코팅을 아가 보장하기 위해 또 다른 하나에 하나 35mm 페트리 접시에서 용액을 따뜻한 아가 붓는다. </li><li> 사란에 싸여 아가로 오스 코팅 요리 1 주일에 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 포장에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 주사 바늘 사출 믹스 로딩 <ol><li> 약 2 시간 주사를 시작하기 전에, 1-1.8의 mRNA ㎍ / μL, 15 % 글리세롤, 1.25 % 페놀 레드의 최종 농도 2 μL를 주입 RNA 분해 효소의 믹스와의 DNase없는 물을합니다. 주 : 페놀 레드 색 주입의 주입 효율 및 배아 식별 모니터링을 허용 용액. 글리세롤 난자 내의 mRNA의 확산을 선호. </li><li> 원심 분리기 4 분에 18,000 XG에펠릿 결정. 얼음에 사용할 때까지 유지합니다. </li><li> 10 μL 피펫, 결정을 펠렛 화 된 튜브의 바닥을 피 주사 믹스 0.5 μl를 수집한다. </li><li> 바늘의 큰 개구부에 주입 믹스 0.5 μL 드롭 피펫 팅하여 (여기서 주입 중에 하나를 바꿈) 적어도 두 개의 주사 바늘 백필. </li><li> 사출 믹스의 증발을 방지하기 위해 4 ° C에서 바닥에 액체와 함께 저장 항아리에 바늘을 설치합니다. 사출 믹스 천천히 기포의 생성을 최소화하기 위해, 적어도 1 시간 동안 주사 바늘의 선단을 여행하자. </li><li> mRNA의 품질이 저하 한 후, 세 개의 추가 용도의 최대 -80 ° C에서 보관 추가적인 주입 믹스 (데이타 미기재). </li></ol></li></ol> 생물 재료, 미세 주입 및 배아 문화 2. 컬렉션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 난자와 정자 수집 참고 : Theodosiou를 참조하십시오등의 알. 산란을 유도하고 배우자 수집을위한 상세한 프로토콜에 대한 (12). <ol><li> 24 시간 동안 23 ° C에서 ASW에 충격 남성과 여성. </li><li> 대부분의 성인은 일몰 후 1-2 시간을 산란하기 때문에 일몰 전에 한 두 시간은 19 ° C에서 ASW에서 개별 컵에 성인을 전송합니다. </li><li> 필터링 ASW에서 35mm 배양 접시를 씻어 그들에게 접시의 바닥에 달라 붙는 난자를 방지하기 위해 건조 거꾸로 보자. </li><li> 산란시, 즉시 1,000 μL 피펫으로 정자와 난자를 수집합니다. <ol><li> 정자를 유지하고 접촉 생식 세포가 건강에 해로운 때문에 난자가 성인 amphioxus 분리 (데이터가 표시되지 않음). </li><li> 또한, 정자와 난자를 모두 방출 움직임에 이르게, 성인 깜짝 놀랄 방지, 따라서 희석. 가능한 한 긴 활성 정자를 유지하고, 수정 속도를 최적화 가능한 집중으로 정자를 수집 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유지1.5 ML 튜브에 얼음에 정자. </li><li> 사전 세척 35mm 페트리 접시에 여과 ASW에서 난자를 전송합니다. </li><li> 전송 100 ~ 500는 주사를 수행하기 위해 다른 35mm 페트리 접시에 이전 뽑아 300 ~ 400 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 난자. </li><li> 정자와 난자의 품질이나 다른 실험 대조군으로 클러치의 나머지 기름지게. </li></ol></li><li> 난자 주입 <ol><li> 수평면에 50 ° 각도로 미세 조작기에 주사 바늘을 설치한다. 참고 : 50 °의 각도가 난자에 바늘의 상대 위치의 적절한 모니터링을 허용하지 않습니다 동안보다 50 °의 각도가 접시에 주위의 난자를 밀어 것입니다. </li><li> 25X 접안 형광 해부에서 여과 ASW를 함유하는 폴리 리신 - 코팅 접시 300-400 μm의 전송 파스퇴르 피펫 30 난자 옮긴다. </li><li> 수행 할 선을 따라 난자를 입금주문 방법 및 아웃 주사는 비 주입 난 모세포에서 분사 구별하기. 배아 현상을 변형시키는 경향이 폴리 리신, 난 모세포의 노출 시간을 최소화하기 위해 작은 수 (30 난자) 주사 (데이타 미기재). </li><li> 가능한 반투명으로 난자를 렌더링하는 암 필드 조명을 사용합니다. </li><li> 미세 조작기의 조동 노브, 난자 가까이에 주사 바늘을 가지고. </li><li> 미세 핀셋으로 선단이 만곡되기 시작 레벨에서 바늘을 오픈. 인젝터 펄스으로, 그 붉은 주입 혼합 실제로 바늘의 유출되어 있는지 확인합니다. </li><li> 200X 배율과 미세 조작기의 미세한 움직임 노브로, 부드럽게 난자의 핵심 내부의 주사 바늘을 이동합니다. 참고 : 너무 피상적으로 삽입 한 경우, 주입 된 용액이 난자 내부에 남아되지 않습니다. 너무 멀리 삽입 한 경우, 난자가 파괴됩니다. </li><li> 120 밀리 초 durat의 1-3 펄스 주입이온과 1 ~ 10 psi의 압력. 바늘이 충분히 좋은 경우, 일정한 압력에서 연속적인 흐름으로 주입. 사출 볼륨이 하나의 난자의 부피의 1/3에 1/5에 해당하는지 확인합니다. </li><li> 주입 후, 난자의 누출을 방지하기 위해 신속하게 바늘을 빼냅니다. </li><li> 주입 된 용액이 난자 내에서 유지하고 몇 초 후, 주입 된 용액이 난자에 걸쳐 퍼져 있는지 확인합니다. </li><li> 라인의 다음 난자에 이동합니다. </li><li> 주입 된 배아 스캔 할 때 배경 형광을 추정하기 위해 음성 대조군 각 시리즈의 일부 uninjected 배아를 유지합니다. </li></ol></li><li> 주입 배아 및 배아 문화의 시비는, 선택 <ol><li> 즉시 시리즈가 주입 된 바와 같이 난자를 기름지게. 난자의 질이 시간에 감소로, 주입, 12 산란 후 1 시간 내에 난자를 비옥. </li><li> 정자 농도에 따라 난자에 정자의 1-5 방울을 추가하고접시를 소용돌이 친다. 참고 : 수정 봉투는 약 1 분 후 배아에 명확하게해야한다. </li><li> 난자의 또 다른 시리즈를 주입하는 동안, 배아는 폴리 라이신 코팅 접시에서 분리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 아가로 오스 코팅 페트리 접시에 600 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 배아를 전송합니다. 모든 가능한 2 셀 단계 전에 경우, 가능한 한 빨리 폴리 라이신 코팅 접시에서 배아를 제거합니다. 참고 : 폴리 라이신에 장시간 노출 될 경우, 배아는 접시의 바닥에 닿는면에 평평하게 밀집 blastulae, 될 경향이있다. </li><li> 2 셀 4 셀 단계에서, DSR 필터와 형광 해부 범위로 선택 성공적으로 주입 배아, 즉, 페놀 레드 파생 적색 형광 신호를 전시하는 일반적인 형태와 그. </li><li> 원하는 스테이지까지 19 ° C에서 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에서 필터링 ASW에서 문화 배아를 유지생체 내 이미징. </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 글에서, B.의 주입을 위해, 처음으로, 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제시 lanceolatum 난자, 이는 후 B. floridae 13, 14 및 B belcheri 15는, 이와 같은 기술이 기재되어있는 제 amphioxus 종이다. 중요한 프로토콜은 B. 형광 단백질의 생산에 적합한 벡터 시스템의 설명을 포함 여기에 설명 시험 관내 생산 된 mRNA의 주입으로부터 lanceolatum (후술...

개발하는 동안, 하나의 세포가 세포 분열과 이동을 모두 포함하는 매우 복잡한 공정에서 전체 유기체를 일으킨다. 나은 셀 동작의 역학의 기초 생물학적 원리를 이해하기 위해서, 발달 생물학 형광 기반 생체 이미징 기법을 사용하기 시작했다. 이러한 세포막 등 세포의 구체적인 구획, 어느 형광 염료로 처리하여 특이성 부족 및 조직 침투 (1)의 저해 방법을 표시 할 수, 또는 형광 단백질 둘을 코딩 외인성의 mRNA 배아 내로 특정 도입. 다른 기술들은 예컨대 mRNA가 같은 외인성 화합물의 효율적인 전달을 위해 사용될 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 미세 주입, 전기 천공, 미세 입자, 리포 펙션과 함께 충격 전달 3,4, 이에 한정되지 않는다. 이러한 모든 접근에 외인성 화합물을 도입하는 데 사용될 수 있지만배아를 현상 만 마이크로 인젝션은 각 셀 (3)에 소정 수량의 정확한 적용을 허용한다. 마이크로 인젝션 기술은 모든 주요 발달 모델 시스템을 위해 설명되었다 4 (예, 초파리, 선충 웜, 제브라 피쉬, 개구리, 마우스)뿐만 아니라 발전기구의 발전을 이해 목표 비교 연구에 사용되는 등 일부 다른 모형 (4)에 관해서 (예를 들어, 말미잘, 환형 동물 벌레, 성게, 멍게의 tunicates, 두삭 동물의 amphioxus). 함께 tunicates과 척색 문을 설정 척추 동물로, 특히 적합 모델입니다 Cephalochordates는 척색 동물의 진화와 무척추 동물의 조상 5-8에서 척추 동물의 다양 화를 연구한다. 두삭 동물의 혈통은 초기 척색 진화하는 동안 분기; 세 장군으로 세분화되어 현존하는 cephalochordates (밀기울chiostoma, Asymmetron 및 Epigonichthys가), 척추 동물과 유사 모두 전체 해부학과 게놈 구조 5-8의 관점에서. 지금까지 설명 된 cephalochordates의 약 30 종, 다섯 배아 발달 연구 6,9 사용할 수 있습니다 Asymmetron의 lucayanum (바하마 창고 기), Branchiostoma floridae (플로리다 amphioxus), 창고 기 (유럽 amphioxus) Branchiostoma belcheri (중국 amphioxus)과 Branchiostoma japonicum (일본 amphioxus). 이 종의 세 가지의 잘 익은 성인 (B.의 lanceolatum, B.의 belcheri 및 B. japonicum)는 주문형 짝짓기의 계절 (10, 11) 중 산란을 유도 할 수있다. 또한, 적어도 용 B. lanceolatum, 효율적인 산란은 이에 연구소 용에 대한이 특정 두삭 동물 종에 액세스 할 수 있도록, 인공 해수 (12)에 유도 할 수있다천연 해수에 액세스 할 수 없습니다 이거 야. B의 조합, lanceolatum, 이러한 미세 주입 등의 효율적인 전달 방법과 배아에 편리하고 안정적으로 액세스의, 지금까지 13 ~ 15, (B. floridae와 B belcheri 모두) amphioxus에서 개발 된 유일한 전달 기술의 개발을 가능하게합니다 계보 tracing- 및 동적 셀 동작 기반 접근 방식을 포함 속임수 기술의 새로운 제품군. 의 mRNA를 효율적으로 미세 주입을위한 프로토콜은 B의 형광 단백질을 표현 lanceolatum 배아, 따라서 개발되었다. 또한, B의 라이브 영상을위한 기본 툴킷을 제공하는 lanceolatum 배아, 벡터 시스템은 막 - 관련 단백질의 형광 핵 발현 허용하는 것이 개발되었다. 막 타겟팅의 경우, 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는)는 mCherry 및 eGFP는 인간 HRAS의 CAAX 상자와 핵 현지화했다 융합했다제브라 피쉬 히스톤 2B (H2B) 엑손 (그림 1, 보충 파일 1)을 융합하여 얻을 수 있습니다. 또한, 단백질 번역을 최적화 할 목적으로, 구조체의 서열과 코작 코돈 변형 된 사용 및 B.에 적응 lanceolatum. 종합적으로, 여기에 제시된 주입 방법 및 발현 벡터는 특히 최근의 생체 영상 기술에 기반하여 형광 분석 cephalochordates 새로운 실험 접근법의 생성을위한 기초로서 역할을한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

위에서 설명한 프로토콜 B. 마이크로 인젝션 용의 기초를 제공한다 lanceolatum 난자 따라서 B. 개발에 도입 mRNA를 lanceolatum 배아는 생체 내 이미징 형광 단백질을 코딩. 기술은 확실히 견고하고 신뢰할 수 있지만,이 프로토콜을 이용하여 성공적으로 주사 속도 변수 (표 1) 남아있다. 이 흥미로운 사실​​을 매우 그럴듯한 설명은 난자 클러치의 극단적 인 변화입...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다.

형광 단백질의 발현에<em&gt; 창고 기</em&gt; 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K 조회수.  Institut Pasteur.  우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

연구

발생학

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...