우리는 과학적인 토론, 제안 및 의견에 대한 Rosenblatt 연구소의 회원 감사합니다. GFP 유전자 변형 zebrafish : 우리는 또한 친절 CK를 제공하는 플라스미드 인코딩 RFP - UtrCH와 데이비드 그런왈드를 제공 메리 할로란 감사하고 싶습니다. 감사합니다 또한 그레첸 왕의 zebrafish 우수 유지 보수 및 관리를위한 유타 대학에서 중앙 Zebrafish 자원의 직원. 이 작품은 JR을 OD002056 - 01 DP2 NIH - NIGMS NIH 원장의 새로운 이노 상 1 지원했다. GTE는 NIH 종합 암 교육 프로그램 그랜트 5T32 CA03247 - 8에 의해 지원되었다.

개발 Zebrafish의 표피에서 셀 압출 동안 굴지 역학 시각화의 기본 워크플로우 개발 zebrafish의 표피는 별개의 두 레이어, 표면 레이어 (또는 periderm)과 지하 막 2 연락 세포의 기저 계층으로 구성되어 있습니다. 외부 표면 층의 세포가 apoptosis를 받아야하고 압출 3 (그림 1)에 의해 조직에서 제거됩니다. 실시간으로이 과정을 시각화하기 위해, 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP를 표현 한 세포 단계 형질 전환 zebrafish에 utrophin, 굴지 바인딩 단백질 (RFP - UtrCH) 4,5의 calponin의 상동 도메인에 융합 RNA 인코딩 적색 형광 단백질을 주입 ) 층상 상피 조직 모터 cytokeratin 8 6 (그림 2A)에서. RFP - UtrCH이 ubiquitously RNA 주입 후 동물의 표현이지만, 우리는 RFP 및 GFP 모두 표피 (그림 2B)에 구체적으로 굴지 역학을 따르도록 표현 외면 표피 세포에 중점을두고 있습니다. 우리는 다음 apoptotic 세포 압출 및 이미지 회전하는 디스크 공촛점 현미경을 사용하여 표피와 굴지 필라멘트를 유도하고 4D의 데이터 세트를 얻기 G418과 애벌레를 처리합니다. 이전 실험을 시작 <ol><li> 에 체외은 mMessage mMachine SP6 키트 (앰비온)을 사용하여 선형의 DNA 템플릿에서 RNA를 녹음하고 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 뒤덮힌 RNA 정화. 멸균 물을 사용 ~ 60ng/ul로 RNA를 희석, 주입 준비까지 -80 3 - 5μl aliquots하고 저장 ° C합니다. 참고 사항 : 반복적인 동결 / RNA의 저하를 방지하기 위해 해동하지 마십시오. </li><li> 100 X 15mm 문화 판에 E3 배아 매체 (E3)에 2% 아가로 오스의 40mL를 따르고이 트레이에 microinjection 금형 (적응성 과학 도구, # I - 34) 배치하여 주사하는 동안 배아를 잡아 금형을 확인합니다. 아가로 오스가 확정되면, 아가로 오스의 골짜기를 노출하는 곰팡이를 제거합니다. 4 사용 ° C까지 준비에서 접시를 저장합니다. </li><li> 필라멘트 (OD 1.0mm, ID 0.78, 10cm 길이)와 다음과 같은 설정 (히트 485, 당겨 50, 속도 60, 딜레이 / 시간 90 기압 200 서터 P - 97 피펫 풀러와 borosilicate 유리를 사용하여 사출을위한 모세관 바늘을 당겨 ). 참고 : 유리의 종류가 나열된 조건의 최적화가 필요합니다. </li><li> 1퍼센트 42 E3하고 저장 1mL aliquots에서 낮은 용융 (LM) 아가로 오스 ° C.를 확인 주식에서 E3의 증발은 아가로 오스의 농도를 증가시킬 수로주의하십시오. </li><li> 빛 / 14 시간 빛과 어둠 7의 10 시간의 어두운주기 정기와 표준 실험실 조건 하에서 성인 zebrafish를 유지합니다. 전날 밤 실험 구분선으로 구분 탱크 3 여성 2 남성을 배치하여 짝짓기 물고기를 설정합니다. 다음날 아침, 탱크에 물을을 변경하고 불이 어서 때 분할기를 가져옵니다. </li></ol> 1. 찬란 태그 굴지 바인딩 단백질을 인코딩 RNA의 분사 <ol><li> 얼음에 RNA를 해동. ~ 30ng/μl의 최종 RNA 농도에 대해 1:1 비율에서 RNA로 0.5 % 페놀 레드를 추가하고 백업 작성하여 뽑아 모세관 바늘에 1μl 솔루션을로드합니다. </li><li> 모아서 ~ 75 1 셀 8 단계 CK : E3에서 GFP의 배아. Pipet FST 더몬트 # 5 포셉와 여물 배아 5 microinjection 곰팡이로 배아를 수집 어 파스퇴르 pipet 부드럽게 동양. 참고 : 주입된 RNA의 모자이크 표현을 초래할 수있는 여러 세포 단계의 배아로 주입 피하기 위해 빨리 일을 처리해. </li><li> 표준 실험실 해부 stereomicroscope에서 압력 제어 microinjector (하버드 장치 PLI - 100 피코 - 주입기)를 사용하여 태아의 노른자로 RNA를 주입. 붉은 반점 (페놀 레드) 주사 후 배아에 표시되어야합니다. 각 실험에 대한 최소한 50 배아를 주사. (zebrafish 배아 9로 RNA 주입에 대한 자세한 프로토콜에 대한 이전 조브 프로토콜을 참조). 참고 : <ol type="A"><li> ~ 2nl의 볼륨은 한 세포 단계의 배아로 RNA의 주입을 위해 사용해야합니다. 주입된 RNA의 양을 확인하려면, 보정 마이크로 미터 슬라이드에 광유의 드롭으로 또는 eyepieces에 내장된 스케일 바와 함께 현미경 RNA의 볼러스 하는걸. RNA의 비말은 완벽한 구형해야합니다. 볼륨 (NL)를 = 4/3πr 3 : 방정식을 사용하여 전달되는 금액을 계산합니다. 악기에 대한 사출 압력 또는 시간을 변경하여 전달 볼륨을 조정합니다. </li><li> 관리는 또한 RNA의 높은 농도가 개발 배아에 독성 수 있으므로, 형광단의 시각화 수 있습니다 RNA의 가장 낮은 금액을 주입로 이동해야합니다. 적절한 표현 수준을 확인하려면, 복용 - 곡선 실험은 실험을 실행하기 전에 수행해야합니다. &lt;/ 리&gt; </ol></li><li> 모든 unfertilized 또는 손상된 달걀을 제거하고 28.5에 남아있는 모든 배아 곳으로 배아를 정렬 ° C. </li><li> 24 시간 후에, GFP (표피)와 RFP (굴지) 형광의 높은 수준의 보안을 zebrafish 배아를 선택하는 형광 해부 현미경을 사용합니다. 28.5에서 선택된 배아를 놓고 ° C apoptosis를 유도하기 위해 약물 치료를 계속 준비까지. </li></ol> 2. G418을 사용 Zebrafish 유충의 세포 압출의 유도 우리는 aminoglycoside 항생제 G418, 또는 Geneticin에게 노출이 알려지지 않은 메커니즘에 의해 zebrafish의 유충 3 개발 apoptosis와 표피 세포의 압출를 일으키는 것으로 확인되었습니다. 중요한 것은,이 치료는 사일 게시물 수정과 나이 애벌레에서 작동합니다. 우리는 ~ 5-25 세포 G418 취급 애벌레 zebrafish의 상피 지느러미에서 언제든지 확인하실 수 있습니다 압출 것을 알게됩니다. apoptotic 압출 세포의 금액은 생선에서 고기에 따라 다를 수 있듯이, 우리는 이미지에 대한 여러 물고기를 장착하는 것이 좋습니다. <ol><li> 수집 4 일 게시물 수정 (DPF) E3 3 밀리리터 (MLS)를 포함 35 X 10mm 문화 요리에 GFP 및 RFP 형광을 모두 전시 zebrafish의 애벌레를 놓습니다. 하나는이 크기 문화 요리 25 애벌레까지 처리하실 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 28.5 ° C. 4 시간 동안 약물의 G418과 부화 유충의 E3가 포함된 1mg/mL의 3mLs으로 미디어를 대체 G418은 민감한 빛됩니다, 그래서 문화 요리가 대상이나 어둠 속에서 유지하는데주의를 기울여야. </li><li> 미디어를 제거하고 0.02 % Tricaine를 포함하는 미리 예열 28.5 ° C E3 미디어로 교체하고 애벌레를 장착을 참조하십시오. </li></ol> 3. 이미징 장착 Zebrafish의 애벌레 <ol><li> 1.5 ML eppendorf 튜브 3 애벌레를 전송하고 튜브의 바닥에 물고기 싱크 후 E3의 대부분을 제거합니다. 우리는 아가로 오스가 굳은하기 전에 최대 3 동물이 제대로 장착할 수 것으로 나타났습니다. </li><li> MatTek 문화 요리의 하단에있는 coverglass에 상처 pipet 팁, 튜브에 1퍼센트 LM - 아가로 오스 (42 ° C)의 pipet의 120ul, 믹스, 그리고 부드럽게 pipet 애벌레와 아가로 오스의 혼합물을 사용합니다. </li><li> 그들이 MatTek 요리의 coverglass에 대한 직선과 평면하므로 바늘 방향 신속하게 애벌레를 첨부 삽입 핀 또는 텅스텐과 FST 핀 홀더를 사용하여. 참고 : 우리는 일반적으로 표본의 손상을 방지하는 동안 그들은 coverglass에 대한 평면되도록 먼저 방향 애벌레 그리고 L - 모양의 핀 스트레이트 핀을 사용합니다. </li><li> 일단 아가로 오스는 경화되었습니다, 부드럽게 E3가 Tricaine 0.02 %를 포함하는으로 요리를 입력합니다. 참고 : 1mg/mL G418에 장기간 노출이 유충을 죽일 수 있지만 다른 방법으로, G418은, 유도 압출을 계속 이미징 접시에 E3에 추가할 수 있습니다. </li></ol> 4. 스피닝 디스크 공촛점 현미경을 사용하여 셀 압출 동안 굴지 역학과 개인 상피 세포의 동작 영상 라이브 우리는 zebrafish의 유충을 개발의 표피에서 apoptotic 세포 압출의 전체 과정은 약 20 분 소요 3 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 압출 프로세스를 시각화하기 위해 zebrafish 표피의 단일 계층을 통해 Z 비행기 일련의를 수집하는 시간 저속 이미징 실험을 설정하는 방법을 보여줍니다. 우리는 전형적인 형광 현미경 위드 필드가 큰 굴지의 필라멘트의 photobleaching 및 timelapse 이미징에 대한 허용하지 않는 원인 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리의 해상도를 극대화하고 photobleaching을 방지하기 위해, 우리는 회전하는 디스크 공촛점 현미경을 사용합니다. 아래 우리는 논의의 원칙은 유사한 현미경 세트 업에 적용할 수 있지만, 니콘 현미경으로 Andor의 IQ 소프트웨어를 사용하여 실험을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. <ol><li> 먼저, 아르곤 (488nm에서 GFP의 여기를위한)와 HeNe (561nm에서 RFP의 여기에 대한) 레이저, 현미경, 카메라, epifluorescent 램프를 켭니다. </li><li> Andor IQ 소프트웨어 (버전 1.10.1) 내에서, 이미지에 원하는 파장을 포함하는 시계열 프로토콜을 만들, 이미지 캡처와 숫자 사이의 시간 간격의 주파수는 캡처가 반복​​해야합니다. </li><li> 부드럽게 현미경 무대에서 표본을 포함하고있는 MatTek 요리를 배치하고 애벌레에 초점을 전달 빛이 20x 목적을 사용합니다. </li><li> 올바른 위치에 4​​0X 물 침지 목표 (NA 0.8)를 이동합니다. 이 목표를 사용하여, 우리는 하위 셀룰러 굴지의 역학을 해결하는 동안 우리는 압출 동안 세포 동작을 수행하실 수 있습니다 입력란 당 약 20-25 세포 필름 수 있습니다. 참고 : 동일한 장착과 긴 작동 거리와 40X 물 침지 목표를 사용해야하지만, 이미지 전략은, 직립 현미경 적용할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 40x 목적의 상단에 물 한 방울을 배치하고 신속하게 위에 MatTek 요리를 놓습니다. 아니E : 물의 증발에 문제가있는 경우 자이스 혈구 Immersol의 집중 솔루션도 사용할 수 있습니다. </li><li> 상 또는 DIC 조명을 사용하여 표본을 확인하고 다음 GFP 긍정적인 표피에 특별히 초점을 488nm epifluorescence를 사용합니다. </li><li> 공촛점 스캔 모드로 전환합니다. 레이저 강도 이에 따라 채널의 각 노출 시간 (488nm 및 561nm) 조정합니다. 신호의 최적 검출을위한 노출의 레이저 파워와 시간을 균형을하고 photobleaching이나 독성을 방지하기 위해 몸조심. </li><li> 압출 세포를 식별하려면, GFP가 표시된 표피를 시각화하고 중간에 작은 원형 세포를 둘러싼 세포의 집합으로 구성된, 고전 로제트 패턴에 세포의 그룹을 식별하는 epifluorescence 사용합니다. 공촛점 스캔 모드를 사용하면, 또한 중간에있는 작은 원형 세포, 세포 압출의 특징 주위에 반지로 보이는 RFP - 라벨 굴지의 축적이 있어야합니다. 일단 빠르게 4D (XYZ 타임) 공촛점 데이터 세트를 얻기위한 현미경을 설정, 압출 세포가 확인되었습니다. </li><li> 압출 세포를 포함하여 표피의 단일 계층을 시각화하고, 단계 크기를 선택하는 Z 평면 내에서 상위 및 하위 점수를 설정합니다. 시간 경과에 대한 이미지는, 반복의 이미지 캡처 및 번호 간격을 설정합니다. 예를 들어, 우리는 일반적으로 1 μm의 단계 크기, 30 분마다 1~2분와 5 10μm를 스팬 Z 시리즈를 취득. </li><li> 데이터를보기 위해, 우리는 일반적으로 Z 시리즈의 3 차원 전망을하고 빠른 시간 (애플)와 호환되는 동영상 파일로 설정 데이터를 저장합니다. 이러한 방법으로, 우리는 굴지 링하고 시간이지나면서 죽어가는 세포 주위에 발생하는 상피 행동의 수축을 시각화 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. apoptotic 세포 압출의 도식. 굴지의 필라멘트가 빨간색으로 표시됩니다, GFP 긍정적인 표피 세포는 녹색입니다. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 실험 워크플로우. 실험에 대한 흐름의 A.의 도식. B. GFP zebrafish : 4dpf CK의 표피에 RFP - UtrCH 표현. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 아직도 상피 세포 압출의 과정 라이브 굴지 역학을 다음과 시간 경과 영화에서 프레임 (Z - 계획안). 화살표 2 분 과정을 통해 계약하고 닫습니다 인접 세포에 의해 형성 굴지의 반지를 상징.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

동물 복지 보증 zebrafish, Danio rerio를 사용하여이 절차를 수행 모든 절차는 기관 동물 케어 승인 및 (동물 복지 보증 # 10-07017) 유타 대학위원회 (IACUC)를 사용하고 있습니다.

여기에서 설명한 프로토콜은 실제 상피 조직에서 압출하는 과정을 시각화하는 간단하고 직접적인 방법을 보여줍니다. 이런 유형의 실험은 우리가 이전에 고정 조직 분석에서 평가하지 굴지 역학 미묘을 확인하실 수 있습니다, 따라서, 일반적인 immunofluorescent 방법을 보완합니다. 로 우리는 더 염증 반응이나 손상된 세포의 축적으로 이어질 것입니다 우리가 기대 apoptotic 세포를 제거하고 취소하고...

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 유형 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> 시약 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 키트 </td><td> 시약 </td><td> 앰비온 </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> 크로싱 탱크 </td><td> 도구 </td><td> Thoren 아쿼틱 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pipet 펌프 </td><td> 도구 </td><td> 벨 아트 제품 </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 어 파스퇴르 Pipet </td><td> 도구 </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microinjection 몰드 </td><td> 도구 </td><td> 적응형 과학 도구 </td><td> I - 34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm 문화 플레이트 </td><td> 도구 </td><td> 어부 </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / 브라운 Micropipet 풀러 </td><td> 도구 </td><td> 서터 악기 회사 </td><td> 모델 P97 </td><td></td></tr><tr><td> 필라멘트와 Borosilicate 유리 모세 혈관 </td><td> 도구 </td><td> 서터 악기 회사 </td><td> B1400 - 78-10 </td><td> OD 1.0mm, 0.78mm ID, 10cm 길이 </td></tr><tr><td> 전극 보관 용기 </td><td> 도구 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> P0290 </td><td> DPBS으로 0.5 % </td></tr><tr><td> 압력 제어 Microinjector 및 Micromanipulator </td><td> 도구 </td><td> 하버드 장치 </td><td> PLI - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm 문화 요리 </td><td> 도구 </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> 시약 </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> DH 50 MG / ML 2 0 </td></tr><tr><td> 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 도구 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm 핀 홀더 </td><td> 도구 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> 핀을 삽입 </td><td> 도구 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 26007-02 및 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 coverglass와 유리 바닥 문화 요리 </td><td> 도구 </td><td> MatTek </td><td> P35G - 1.5-10 - C </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 용융 아가로 오스 </td><td> 시약 </td><td> 어부 </td><td> BP1360 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> A - 5040 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> 현미경 </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ645 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> 형광 현미경 분석 해 봅시다 </td><td> 현미경 </td><td> 올림푸스 </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> 디스크 공촛점 현미경 스피닝 </td><td> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 에클 립스 티 </td><td> Yokagawa 회전 디스크 헤드와 함께 복 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 카메라 </td><td> Andor </td><td> DV - 885 - VP </td><td> 1002x1004x8 마이크론 스퀘어 픽셀 </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

상피 조직의 생체 항상성 유지 보수 장벽 기능을 중단하지 않고 손상된 세포의 지속적인 제거가 필요합니다. 우리의 연구는 죽는 세포는 출구에서 결과있을 수있는 격차를 닫는 동안 상피 시트에서 밖으로 배출 굴지과 마이 오신의 고리를 형성하고 계약에 그들의 사는 이웃에게 신호를 보내는 것을 발견, 과정은 세포 압출 1 칭했다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기서 우리는 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다. 압출을 시각화하기 위해, 우리는 표피의 녹색 형광 단백질을 표현 한 세포 단계의 배아 유전자 변형 zebrafish에 F - 굴지의 적색 형광 단백질로 분류 프로브를 삽입하고 애벌레로 G418를 추가하여 apoptosis를 유도. 우리는 다음 apoptotic 세포 압출의 과정에서 굴지의 역학과 상피 세포의 행동을 관찰하기 위해 회전하는 디스크 공촛점 현미경에서 시간 저속 이미지를 사용합니다. 이러한 접근 방식은 우리가 살고 상피 조직에서 압출 프로세스를 조사 수 있으며 apoptotic 세포를 제거하기 위해 실패로 인한 질병 상태를 연구하는 수단을 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K 조회수.  University of Utah. 죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.

비디오: Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

연구

생물학

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.