이 작품은 텍사스 맥거번 의과 대학 소아과에서 건강 NIDDK 부여 (K01DK092320) 및 시작 기금의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

(: HSC-AWC-13-135 프로토콜 #) 다음 프로토콜은 기관 관리 및 사용위원회의 역할을 실험 동물 의학 동물 복지위원회, 휴스턴의 센터에서 텍사스 건강 과학 센터의 대학에 의해 승인되었습니다. 신장 타겟 주사에 대한 Blastomeres을 1. 식별 및 선택 <ol><li> 배아를 생성하기 전에, 배아의 초기 세포 분열의 배향을 이해 Xenopus의 개발 (21)의 정상 표를 사용한다. 또한, Xenbase 11 Xenopus의 초기 발달 단계의 액세스도. </li><li> 마이크로 인젝션 대상이 될 할구 선택 Xenbase (11)의 상호 작용 Xenopus의 세포 운명의지도에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 단세포 배아가 어둡게 착색 된 동물 극과 흰색과 노른자위의 인 식물 극을 가지고 있음을 관찰한다. 참고 난황 전자로 알려진 보호막,nvelope, 배아를 다루고 있습니다. </li><li> 제 절단은 전형적으로 배아의 왼쪽과 오른쪽 사이에서 발생하는 것을 알 수 있습니다. 이러한 세포는 pronephric 리니지 동등 기여한다. </li><li> 두 번째 분열은 4 셀 배아로 이어지는, 지느러미 및 배아의 복부 절반을 분할합니다. 지느러미 세포는 작고 복부 세포 (그림 2A 그림 3A)보다 안료가있다. <ol><li> 왼쪽과 오른쪽에, 지느러미보다 개발 신장에 더 기여 (D, 작은, 빛 세포) 할구 (그림 2A), 복부 할구 (큰, 어두운 세포 V)를 확인합니다. </li><li> 4 셀 배아에 주입하면, 왼쪽 신장 (그림 3A 및 제 3 항)을 대상으로 왼쪽 복부 할구를 주입. </li></ol></li><li> 세번째 절단는 8 세포 배아 발생, 동물 및 식물의 측면을 이등분. 이 시점에서, 네 동물 할구는 [가 왼쪽 복부 오른쪽(V1)과 지느러미 (D1)] 네 식물 할구 [왼쪽과 복부 오른쪽 (V2)와 지느러미 (D2) (도 2b 및도 3b). <ol><li> 복부, 식물 할구 (V2)를 찾습니다. 이 할구는 다른 셀이 단계 (그림 2B)에서 개발 신장에 더 많은 기여한다. 8 세포 배아의 왼쪽 신장을 목표로, 왼쪽 V2의 할구 (그림 3b 및 제 3 항)에 주입. </li></ol></li><li> 네 번째와 다섯 번째 분열은 동물과 식물 할구를 이등분 것을 알 수 있습니다. 두 자손 16 세포 배아 발생, 각 할구로부터 생성된다. 세포는 그들의 전임자의 이름을 따서 명명된다. 예를 들어, 8 세포 단계에서 V2의 할구는 16 세포 단계 (도 2c)에서 V2.1 및 V2.2 자손을 일으킨다. 16 세포 단계에서 V2.2 셀 현상 신장에 기여하는 세포의 대부분을 제공한다. </li><li> 여섯 번째와 일곱 번째 분열 32 셀 엠브리 결과 참고영형. 다시 말하지만,이 자손들은 이전 다음 명명 된 각각의 할구에서 생성됩니다. 예를 들어, 16 세포 단계에서 V2.2의 할구 32 세포 단계에서 V2.2.1 및 V2.2.2을 일으킨다. 가 셀 (식물로 동물)에서 A, B, C, 및 D와 같은 네 개의 행에서 식별되는 32 세포 단계에서 대체 네이밍 시스템은, 4 열 1, 2, 3, 4 (AS 지느러미)에서 복부에. 따라서, 개발 pronephros에 가장 기여하는 V2.2.2의 할구는,이 대안 네이밍 시스템 (그림 2D)에서 C3라고합니다. </li></ol> 배아 2. 준비 <ol><li> (8.0 pH로 2 % 시스테인, 수산화 나트륨) Dejelly 용액 50 ㎖를 준비합니다. </li><li> 표준 프로토콜 (14)에 따른 단일 남성 개구리에서 두 고환을 분리합니다. 0.1 M의 NaCl, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산, 2 mM의 10 ml의 고환 스토리지 솔루션 (1 배 마크의 수정 링거 [MMR 가득 60mm 페트리 접시에 고환을 배치CaCl2를 5 mM의 HEPES pH를 8, 0.1 mM의 EDTA] (12), 1 % 소 혈청 알부민, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신). 4 ° C에서 고환을 저장합니다. 주 : 고환 약 7 일 동안 저장 될 수있다 - 39 ° C에서 10 일이지만 시비 효율 고환이 저장되어있는 이상 감소한다. </li><li> 표준 프로토콜 14에 따라 알을 얻기 위해 여성 개구리 짠다. 100mm의 페트리 접시에 계란을 수집합니다. 초과 물을 붓는다. </li><li> 이 집게와 면도날을 사용하여 고환 스토리지 솔루션에있는 동안 고환의 ¼을 잘라. 알을 함유하는 페트리 접시에 정소의 단편을 전송. 정소는 저장된 얼마나 고환의 크기를 고려하여 사용하는 정소 부분의 크기를 조정하고, 얼마나 많은 계란 시비하여야한다. 일반적으로 계란 한 클러치를 비옥하게하기 위해 갓 해부 고환의 1/3에 ¼ 사용합니다. </li><li> 집게와 면도날을 사용하여 작은 조각으로 고환 부분을 잘라. 충분히 0.3 배의 MMR 추가페트리 접시에 + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신은 계란을 포함합니다. 섞어 접시에 MMR 소용돌이 친다. </li><li> 수정은 실온에서 일어날 때까지 약 30 분을 기다립니다. 동물 반구 (배아의 색소 측) 효과적인 수정시 배아의 꼭대기에 앉아 않습니다. 이어서, 전사 피펫을 사용하여 배양 접시에서 MMR 제거. 배아를 충당하기 위해 요리에 충분한 Dejelly 솔루션을 추가합니다. </li><li> 다음 몇 분 동안 부드럽게 간헐적으로 접시를 소용돌이 친다. 이 때 접시의 격렬한 흔들림 축 결함의 원인이 될 수 있습니다. &#160; 배아의 젤리 코트 용해하고, 배아는 소용돌이 치는 동안 접시의 중앙에 모이는 것입니다. 배아가 밀접하게 접시의 중앙에 서로 닿지되면, 전송 피펫으로 Dejelly 솔루션을 제거합니다. 이상 5 분 동안 Dejelly 솔루션의 배아를 두지 마십시오, 또는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 0.3 배에서 5 배 - dejellied 배아 3을 씻으십시오조심스럽게 쏟아져 또는 MMR 오프 피펫과 새로운 MMR과 접시를 작성하여 MMR은 + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신. 접시에서 MMR을 모두 제거하지 마십시오, 또는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 모든 미 수정 계란 또는 고환의 조각을 제거합니다. </li><li> 14, 22 °의 C 사이의 배아를 품어. 주 : 낮은 온도에서 성장 된 배아 높은 온도에서 성장 된 배아보다 느리게 개발한다. 발달 단계의 타이밍 Xenbase (22)에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 자신의 개발 밖으로 공간, 페트리 접시에 한 수정에서 배아의 장소 반은 14 ° C로 유지하고, 페트리 접시에 배아의 나머지 절반은 18 ° C로 유지. 이는 단일 시비 4 셀, 8 셀 배아 내로 주사 두 집합을 허용한다. </li></ol></li></ol> 사출 솔루션 및 태아의 미세 주입 3. 준비 <ol><li> 0.01를 함유하는 주사액을 제조NG / NL 막 결합 적색 형광 단백질 (RFP-MEM)의 mRNA 9 배아 4 셀, 8 셀 스테이지 개발하고있다. 주입 할 준비가 될 때까지 얼음에 주입 솔루션을 저장합니다. </li><li> &quot;. 바늘 풀러 케이스의 상단에 정렬 교체 튜브의 상단에, 바늘 풀러로 교체 유리 모세관 튜브 (800)에 열 # 2 값을 설정하고 (650)을 눌러 당김 값은&quot;7을로드 당겨 &quot;버튼을 눌러 바늘을 당겨. 이는 단일 7에서 2 바늘을 만들 것&quot;유리 모세관. </li><li> 뒤몽의 포셉 한 쌍으로 뽑아 바늘의 끝을 싹둑. 참고 : 바늘을 당기는 후, 팁 차단을 밀봉 오픈 절단해야합니다. 바늘 끝이 될 직경이 작을 것이 절단 바늘의 지점에 가까워. 팁의 직경은 여기에 사용 된 마이크로 인젝션 시스템과 주입 부피에 영향을주지되지만, 더 큰 직경을 갖는 팁이 배아가 손상 할 가능성이있다. </li><li> m 개의 슬립바늘의이면 상 icropipette 콜레트. 다음에, 콜레트 뒤에 바늘의 후방에 큰 구멍 O 링 슬립. </li><li> 미네랄 오일이 바늘에 공기 방울을 얻을 않도록주의하면서, 27 게이지 피하 주사 바늘을 이용하여 바늘을 입력합니다. </li><li> 플런저에 설치되어있는 흰색 플라스틱 스페이서의 큰 구멍에 바늘을 좌석의 마이크로 인젝터의 플런저에 바늘을 슬립. 플런저 흰색 스페이서 큰 구멍 O 링과 콜릿 뒤에 마이크로 인젝터의 몸에 가까운 작은 O 링을 가져야한다. 콜레트를 조여 바늘을 고정합니다. 제대로 고정되어 있는지 확인하기 위해 바늘에 부드럽게 잡아 당깁니다. </li><li> 이 비프 음이 될 때까지 눌러은 마이크로 인젝터 제어 상자의 &quot;빈&quot;버튼을 누르고 있습니다. </li><li> 파라 필름의 조각 위에 주입 솔루션의 피펫 3 μL. 파라 필름에 주사 용액의 구슬로 바늘의 끝을 삽입합니다. 언론과는이 microi 버튼을 &quot;작성&quot;개최njector 컨트롤 박스는 바늘로 주사 솔루션을 그립니다. </li><li> 0.3 배의 MMR + 30 mg을 / ㎖ 겐타 마이신 5 % 피콜 메쉬 500 미크론 폴리 에스테르 늘어서 60mm 페트리 접시를 입력합니다. 접시에 30 4 셀 또는 8 셀 배아 - 조심스럽게 20 피펫. </li><li> 모발 루프 (14)를 사용하여, 바늘 할구를 향 분사 될 수 있도록 조작 배아. , 왼쪽 신장을 대상으로 4 셀 배아 또는 8 세포 배아의 왼쪽 V2의 할구의 왼쪽 복부 할구가 바늘을 마주 보도록 배아를 정렬합니다. </li><li> 디쉬 각 배아 선택된 할구로 주사액 10 NL 주입한다. 주 : 배양 접시의 바닥에 메쉬는 배아를 안정화시키고 그들을 안정화 모발 루프를 사용하지 않고 삽입 될 수 있도록 구르는을 방지한다. </li><li> 전송 0.3 배의 MMR + 30 mg을 / ㎖ 겐타 마이신 5 % 피콜 충전 된 문화 판의 우물에 배아를 주입. 주입 된 배아를 품어적어도 한 시간 동안 16 ° C에서의이 주입 된 할구 치유 할 수 있도록합니다. </li><li> 단계 9 (전 낭 배기로)으로 0.3 배의 MMR + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 충전 된 새로운 문화 판의 우물에 치유 배아를 전송합니다. </li><li> 40 21 - 배아 단계 38에 도달 할 때까지 22 °의 C - 14 배아를 품어. </li></ol> 4. 고정 및 태아의 면역 염색 <ol><li> MOPS / EGTA / 황산 마그네슘 50 ㎖를 준비 / 포름 알데히드 버퍼 [MEMFA : 100 mM의 MOPS (PH 7.4), 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산, 3.7 % (v / v)의 포름 알데히드]. </li><li> 유리 병에 40 배아 - 20 단계 (38) - 전송 피펫을 사용하여, 10을 넣어. 혼합 유리 병 및 반전 바이알에 100 % 에탄올에 10 ㎕의 5 % 벤조 카인을 추가합니다. 배아를 마취 10 분을 기다립니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 유리 병에서 MMR을 제거합니다. 동시에 다수의 튜브를 처리하는 경우, 바이알을 24 웰 세포 배양 플레이트에 수직으로 유지 될 수있다. </li><li> 유리 파이프TTE, MEMFA와 유리 병을 채 웁니다. 실온에서 1 시간 동안 입체 요동 플랫폼 바이알을 놓는다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 유리 병에서 MEMFA를 제거합니다. 100 % 메탄올 병을 채 웁니다. 실온에서 10 분 동안 입체 요동 플랫폼 바이알을 놓는다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하고, -20 ° C에서 100 % 메탄올 하룻밤에 배아를 저장합니다. </li><li> 준비 1X 인산 완충 생리 식염수 - 소 혈청 알부민 트리톤 (PBT) 1X PBS, 2 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100. </li><li> 1X PBT 1 10 %의 염소 혈청과 : 차 항체 솔루션을 준비 마우스 단일 클론의 5 희석 4A6 항체, 마우스 모노클로 날 항체 3G8의 1:30 희석합니다 (중간 말단과 연결 세관 (20)의 막을 레이블을) 그리고 1 (근위 세뇨관 (20)의 라벨 루멘에) : 토끼 폴리 클로 날 RFP 항체의 250 희석합니다 (MEM-RFP의 추적 라벨을합니다). 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> seconda 준비공예 항체 용액 : 10 % 염소 혈청과 1X PBT, 1 : 500 알렉사 488 염소 항 - 마우스 IgG (재고 농도 2 ㎎ / ㎖, 라벨 4A6 및 3G8로), 1 : 500 알렉사 555 염소 항 - 토끼 IgG를 (주 농도 2 ㎎ / ㎖하며 MEM-RFP의 추적 라벨을). 저장 4 ° C에서, 호일에 튜브를 다루는 것은 빛으로부터 보호 할 수 있습니다. </li><li> 또한, 염색 후 기본 및 보조 항체를 수집하고, 미래의 실험에서 재사용 4 ° C에 저장합니다. 항체는 재사용을 위해 저장되어야하는 경우, 0.01 %의 아 지드 화 나트륨을 추가한다. </li><li> 설립 된 프로토콜 (18)을 사용하여 배아를 발현 사이. </li></ol> 태아 및 대상 Pronephric 조직의 분석 5. 시각화 <ol><li> 올바른 할구는 1X에서 형광 실체 현미경 하에서 추적의 형광을 확인하여 주입되었는지 확인하기 위해 면역 염색 배아를 화면 (전체 배아를 볼 수)과 5 배 확대 (신장를 볼 수 있습니다). 우리와 멀티 웰 유리 접시에 장소 배아1X PBT는 끝이 전송 피펫을 사용하여 가득 재편이 차단. 헤어 루프 배아를 조작 할 수 있습니다. 배아의 왼쪽에있는 pronephros의 공동 주입 추적 존재가있는 경우에만 배아를 사용합니다 (그림 3C, F 및 그림 4C, F) 유전자 과발현 또는 최저 분석. </li><li> 유리 병에 배아를 놓고 머레이의 취소와 함께 유리 병을 작성하여 : 또는 머레이의 지우기의 배아 (1 부 벤질 알코올이 부분 벤질 벤조 에이트)을 취소합니다. 유리 웰 플레이트를 사용하여 배아를 시각화합니다. 참고 : 머레이의 삭제는 유기 용매 및 취급시주의해야한다. 장갑을 착용하고 만 머레이의 투명 유리 튜브 및 피펫을 사용합니다. </li><li> 삼주 - 2 4 ° C 1 배에서 PBT에서 보관 배아. 배아의 장기 저장을 위해 10 분 동안 실온에서 100 % 메탄올을 두 번 세척하여 배아 탈수. 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 배아를 저장합니다. </li></ol>

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<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Xenopus의 배아를 개발하는 pronephros을 타겟팅 확인하고 올바른 할구 주입에 의존합니다. 8 셀 배아의 V2의 할구의 주입 왼쪽 pronephros (18)을 목표로하고있다. 이 내부 통제와 반대편 오른쪽 pronephros을 떠난다. 모르가 녹다운 또는 RNA 과발현이 신장 개발을 변경하는 데 사용되는 경우, 반대측 pronephros 오른쪽 왼쪽 pronephros에 유전자 녹다운 또는 과발현의 효과를 비교하기 위해 사용될 수?...

Xenopus의 배아 신장의 pronephros은 신장 개발 및 질병 연구를위한 좋은 모델입니다. 배아 외부 개발 크기가 크며, 대량으로 제조 할 수 있고, 용이하게 미세 주사 또는 수술을 통해 조작된다. 또한, 포유류와 양서류의 신장 발달을 지배하는 유전자가 보존되어있다. 배아 양서류가 pronephros이 성인 양서류가 metanephros을하면서 pronephros, mesonephros 및 metanephros 1 : 포유류의 신장은 세 단계를 통해 진행. 이러한 신장 형태의 기본 필터링 유닛 네프론이며, 포유류 양서류 모두 nephrogenesis (2, 3)를 거쳐 동일한 시그널링 캐스케이드 및 유도 이벤트를 요구한다. 아프리카 발톱 개구리 pronephros는 근위, 중간의 선단과 세관의 접속 이루어지는 단일 네프론 포함 및 (포유 동물 사구체와 유사)는 사구 1, 4-6 (그림 1 </str옹&gt;). Xenopus의의 pronephros에서 하나의 큰 네프론 존재는 신장 개발 및 질병 과정에 관여하는 유전자의 연구에 대한 간단한 모델로 적합합니다. 세포 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립, 자유롭게 Xenbase 7-11에서 온라인으로 사용할 수있다. 동일한 기술은 같은 심장이나 눈과 같은 다른 조직을 대상으로 적용 할 수 있지만, 여기, 우리는 개발 Xenopus의의 pronephros을 대상으로 계보 추적자의 미세 주입하는 기술에 대해 설명합니다. 리니지 추적자는 초기 할구에 주입 될 수 있으며, 개발하는 동안 그 셀의 자손의 시각화를 허용 (중요한 염료, 형광 표지 된 덱스 트란, histochemically 검출 효소와 mRNA를 형광 단백질을 코딩 포함) 라벨이다. 이 프로토콜은 MEM-RFP의 mRNA는, 인코딩 막은 계보 추적으로, 적색 형광 단백질 (12)를 대상으로 사용합니다. 대상 미세 주입 기술여기에 설명 된 4 - 8 세포 배아의 개별 할구에 대한 niques 관심의 유전자를 과발현하는 유전자 발현, 또는 외인성 RNA와 함께 아래로 노크 morpholinos와 함께 주입을 위해 이용 될 수있다. 복부, 식물 할구에 주입하여, 주로 배아의 pronephros이 발달 컨트롤로 반대편 pronephros를 떠나, 타겟이 될 것입니다. 추적자의 공동 주입 올바른 할구 주입 된 것을 확인하고, 태아에 어떤 조직이 쇼는 pronephros의 대상 확인, 주입 된 할구에서 일어났다. pronephros의 면역 염색은 pronephric 세관을 대상으로 한 얼마나 잘 시각화 할 수 있습니다. 과발현 녹다운 효과는 발달 제어 역할 배아의 반대쪽에 대해 획득 될 수 있고, 13 pronephric 인덱스를 계산하는데 사용될 수있다. 세포 운명 맵의 가용성이 타겟 마이크로 인젝션 기술 OTH 조직을 대상으로 사용될 수 있도록어 pronephros, 형광 추적자의 공동 주입보다는 각 조직의 표적 미세 주입 분석하기 전에 확인할 수 있도록합니다. 배아 미세 주입 동안 발육 온도 단단히 통제 Xenopus의 발생률이 14에 크게 의존한다는 주어져야한다. 개발 시간이 둔화되기 때문에 4- 및 8 셀의 주사에 대해 - (16 °의 C (14)) 배아는 낮은 온도에서 배양한다. 22 ° C, 1 단계 (1 셀)에서 개발 시간에서 16 ° C 개발 시간에서 3 약 4 시간입니다 무대 동안 3 (4 셀), 약 2 시간입니다 무대입니다. 그것은 22 ° C에서 8 셀 (단계 4) 배아에 4 셀 배아에서 이동 약 15 분 걸리지 만 16 ℃에서 약 30 분 정도 소요됩니다. 마찬가지로, 22 ° C에서, 만 16 세포 배아 (단계 5)으로 진행하는 8 세포 배아 30 분 정도 걸립니다. 이 시간은 16 ° C 45 분으로 증가한다. 그만큼refore, 배아 16 세포 단계로 진행하기 전에 8 세포 단계에서 주입을위한 충분한 시간을 사용하는 배아의 발전 속도를 느리게하는 것이 유용하다. 또한, 성장 온도는 속도를 높이거나 신장이 완전히 개발 될 때까지 배아 발달을 느리게 조절 될 수있다. 올챙이 단계 Xenopus의 배아의 표피 조직 (15)의 절개 또는 청산하지 않고 개발 pronephros 쉽게 영상을 허용, 상대적으로 투명하다. 인해 Xenopus의 배아의 상대적 투명성, 생균 촬상 16,17 또한 가능하다. 이후 Xenopus의 배아 18-20에서 유전자 발현의 조작을 대상으로 pronephric 개발 평가 수 (40) 배아 - pronephros을 시각화하는 면역 염색하면, 중간 원위 인접, 무대의 연결 세관 (38) 레이블을 설립 항체 가능한 항목의 마운트.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin solution, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Benchtop incubator for embryos.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP plasmid</td><td></td><td></td><td>For making tracer RNA. Ref: Davidson &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7&quot; Drummond replacement tubes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Microinjection needles.</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>For breaking microinjection needle tip.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Microinjector.</td></tr><tr><td>Mineral oil, heavy</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Oil for needles.</td></tr><tr><td>27 G Monoject hypodermic needle</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micron Polyester mesh</td><td>Small Parts</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Screw thread vial</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>For fixing, staining, and storing embryos.</td></tr><tr><td>24-well cell Culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumen</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum, New Zealand origin</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 3G8 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label proximal tubules.</td></tr><tr><td>Monoclonal 4A6 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Secondary antibody to label kidney tubules.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>9 Cavity spot plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr></tbody></table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

제노 laevis의 (개구리)에 pronephros의 배아 신장은 하나의 네프론 구성 및 신장 질환에 대한 모델로서 사용될 수있다. 제노 배아 외부 개발 크고, 쉽게 미세 주입 또는 외과 수술에 의해 조작 될 수있다. 또한, 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립되었습니다. 결국 기관 또는 조직의 관심을 야기한다 개별 할구로 타겟 마이크로 인젝션 선택적 배아의 나머지의 차 효과를 감소 또는 과발현이 제한된 영역 내에서 유전자 발현을 녹아웃하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 4 - 8 세포 배아의 특정 할구에 미세 주입을 통해 개발 Xenopus의 신장합니다 (pronephros)를 대상으로 설립 Xenopus의 운명 맵을 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 계보 추적자의 주입은 주입의 구체적인 타겟팅의 확인을 할 수 있습니다.배아 38 무대 개발 후 - 40 전체 마운트 면역 염색을 pronephric 개발 시각화 사용되고 pronephros 타겟팅 세포에 의한 기여가 평가 될 수있다. 동일한 기술은 pronephros 외에 다른 조직 유형을 표적으로하도록 할 수있다.

MEM-RFP의 mRNA와 4- 및 8 셀 Xenopus의 배아의 Microinjections는 pronephros을 대상으로 서로 다른 수준을 보여줍니다.도 4 단계 올바른 MEM-RFP mRNA 발현 패턴 (40) 배아 그림. 배아는 왼쪽 복부 할구 (그림 4A)에 주입하고, MEM-RFP의 mRNA의 적절한 발현 패턴 분류 하였다. 중간 근위 말단에서 MEM-RFP를 발현하고, 신장 세관의 접속뿐만 아니라, 적절하...

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.2K 조회수.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

비디오: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

연구

발생학

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

생물학

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

신경과학

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Xenopus의 세포 복구 전략을 조사하기 위한 망막 변성 생성

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

저자 스포트라이트: Xenopus Frog의 망막 재생 메커니즘 탐구 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

개발에 미세 주입을 대상으로 기술

요약

더 많은 비디오 탐색

공 촛점 분석을 사용하여

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

에서 신경 Explant의 문화

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성