저자는 개구리 시설의 사용에 대한 교육과 Kirschner 연구실에 밥 프리먼을 감사하고, 지원 밴 Vactor 연구실의 구성원 것이다. 우리는 그림 1의 이미지에 빛을 현미경으로 도움이 하버드 의과 대학에서 니콘 이미징 센터를 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 추진하는 사업 : NRSA NIH 교제와 랄에 NIH K99 교제, 기초 과학 협력 기금 ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> AEF에), 그리고 NIH RO1 NS035909을 DVV에

참고 : 자세한 정보와 함께 우수한 프로토콜이 그 초점을 더 구체적으로 다음 단계에서 (예 : 8-12) 다른 곳에서 출판 된대로 우리 만 간단한에서 처음 두 절에 나와있는 단계를 설명합니다. 또한, 라이브 세포 배양에 Xenopus 척추 뉴런 작업의 일반적인 프로토콜은 이전에 자세한 방법 제 8 조에서 출판되었습니다. 여기에 우리가 성공적으로 수행하고 3 단계에서 신경 튜브 해부 및 도금 프로토콜 문제를 해결하기에 충분한 정보를 제공 하긴하지만 우리는 매우,이 동영상에 대한 보완으로 그 문서를 검토하는 것이 좋습니다. Xenopus 계란 1.에서 체외 수정 <ol><li> 계란 수집하기 전에 chorionic 생식샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12-18 시간으로 주입 된 여성 개구리의 알을 얻습니다. 1X 마크의 수정 벨소리 솔루션 (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 MM KCl, 1.0 MM MgSO 4, 2.0 MM CaCl 2 알을 수집, 5.0 밀리미터 HEPES, pH를 7.4 9). </li><li> 이전 9 설명한 바와 같이, 다진 고환과 체외에 계란을 비옥. </li><li> 적어도 20 분 후, 3-5 분 동안 1X MMR의 2 % 시스테인 (NaOH로 pH를 7.8로 이동)에 배아를 잠복기에 의해 배아 젤리 코트를 제거합니다. 3 : 0.1X MMR (88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.7 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 2.5 MM NaHCO 3, 5 MM HEPES, pH를 7.8) 또는 0.1X MBS (수정 바스의 식염, 1X 조리법)로 씻어 원하는 경우 상온에서 -5 시간, 유지 배아 주사 할 때까지, 또는 14-18의 장소 배아는 ° C 개발을 느리게합니다. </li></ol> 2. RNA의 Microinjection 참고 : 우리가 여기에 RNA 분사를 사용하는 동안, 이러한 기술은 RNA에 국한되지이며, DNA, 단백질, 또는 유전자 조작에 대한 수정 핵산도 사용 할 수 있으며, 이전에 12 설명되어 있습니다. <ol><li> cytoskeletal 또는 기타 구조물에게 AR을 라벨에 대한 실험 RNAs 이전e는 mMessage mMachine 키트 (Ambion)를 사용하여 선형화 된 DNA 템플릿에서 베꼈. mRNAs는 번역을 촉진하고 태아의 저하를 방지하기 위해 5 &#39;캡과 3&#39;polyadenylation 꼬리를 필요로합니다. pCS2 +이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 벡터이며, 전사 키트 합성 반응 중에 캡 아날로그이 포함되어 있습니다. 우리는 nuclease 무료 ddH 2 0에서 베꼈 mRNA를 다시 중지 500 2000 사이의 재고 농도에서 μl / NG, -80 ° C. 프롬프트 저장 한 다음 전에 주사에, 분사에 대한 적절한 농도로 ddH 2 0에서 RNA를 희석. 만 작은 볼륨 배아에 주입되므로, 버퍼에 resuspending하는 것은 필요하지 않습니다. 우리의 마지막 주입 농도는 구조에 따라, 일반적으로 50-200 PG / NL이며, 많은 실험실은 전통적으로 총 볼륨의 약 1 %에 10 NL, 최대 주입하지만 우리는 일반적으로 배아 당 4 NL까지 주입합니다 배아. RNA는 다량의 유독되고, 배아 장군 당 복용 할 수 있습니다최대 5 NG로는 특정 유전자와 순도에 따라 용납 할 수 있지만 베드로, 10 PG에서 1 NG 범위. 그러나, 이미징 단백질 현지화에 대해 가장 낮은 수준 이상의 표현의 유물을 피하기 위해 주입해야합니다. 이 프로토콜의 EB1-GFP를위한 RNA는 배아 당 250 PG의 최종 금액으로 사용됩니다. </li><li> ~ 0.2 μm의 팁 직경, 바늘 풀러 9 모세 혈관을 당겨 주입 바늘을 준비합니다. 열 644, 어서 125, 속도 70, 시간 250,하지만 이러한 매개 변수가 시스템에 따라 달라질 및 필라멘트 (현재 2.5 mm를 사용하여 변경 한 후 다시 조정해야합니다 : 셔터 P-87 풀러으로, 우리는 다음과 같은 설정을 사용 폭 2.5 mm)입니다 사각형 상자 필라멘트. 현미경에서 퀼 같은 모양을 생성하기 위해 각도로 집게로 바늘 끝을 부러. 가 주입 바늘 (예 : 11,12)을 깨고 작성을위한 다른 방법도 있지만, 우리는 작은 드롭 (0.5-1 μl)를 배치하여 RNA로 바늘을 작성의 뒤쪽 끝으로바늘. 태아에 microinjecting를 들어, 피코-주입기 (의료 시스템)되는 가장 일반적인 상업적으로 이용 가능한 분사 장치의 수, 두, 그리고 Nanoject (Drummond 과학)는 (자세한 내용은 11 참조)가 있습니다. 우리는 일관 nanoliter 볼륨을 제공하기 위해 시간을 디지털로 설정 한 기간 동안 압축 가스를 사용하는 의료 장비 PLI-100 피코 주사기를 사용합니다. 사출 볼륨은 스테이지 마이크로 미터를 사용하여 각각의 새로운 micropipette에 대해 보정하여야하며, 주입 시간은 주입 RNA의 원하는 금액을 달성하기 위해 조정해야합니다. </li><li> 장소는 1에서 수정 된 배아를 - 4 - 세포 단계에 0.1X MMR의 5 % Ficoll을 포함하는 플라스틱 그릇에. 포셉과 장소에 배아를 개최하거나 개최 플랫폼 (plasticine 또는 치과 왁스 함께 그릇의 바닥을 준수 ~ 1mm 눈금이있는 플라스틱 메쉬,)에 넣어, (단계 2.1 참조 동물 blastomeres에 원하는 볼륨을 주입 ) 사출 볼륨에 대한 자세한 내용은. 몇 LOC에 배포배아 전역 ations은 동물 blastomeres의 각에 적어도 하나의 분사는 (예를 들어, 4 셀 단계의 배아를 위해, 우리는 일반적으로 2 셀 단계에 반면, 각각의 blastomere에 1-2 번 주사 더 균일 한 분포를 구하는 방법 배아, 우리는)​​ 각 blastomere에 2-4 번 주입. 2-4 세포 단계까지 대기의 이점은 배아가 정상적으로 분열을 시작하기 때문입니다. 시간이 관건입니다 경우, 당신은 주입 할 필요가 더 많은 배아가 아닌 최종 결과에서 거의 차이가있는 1-세포 단계에서 시작할 수 있습니다. 이전 단계의 배아가 함께 사용 및 특정 세포 유형 주사를 대상으로하지만, 우리가 일반적으로 더 폭 넓은 표현을 선호으로, 우리는 더 많은 주사의 필요성을 줄이기 위해 젊은 배아에 주입하는 경우이 특히 유용합니다 수 있습니다. </li><li> 0.1X MMR을 포함하는 플라스틱 접시에 주입 배아를 전송하고 무대 20-23 13까지 개발 할 수 있습니다. 14 22 배아를 배양 ° C 원하는 SPE에 따라개발 거구나. (~ 14 ° C.를 사용 후 다음 날 신경 튜브를 해부를 들어, 하루를 ~ 22 ° C. 사용) </li></ol> 3. 신경 튜브 해부 및 도금 <ol><li> 이전 dissections을 수행하려면, 문화 요리 14 준비합니다. 첫째, Mattek 또는 랩 - 테크 문화 요리 중의 coverslip의 표면, 이상 수영장, 1 시간 (또는에 품다 200 μg / PBS에 ML 폴리 라이신의 충분한 솔루션을 코팅 coverslips는, 하나는 앉아 유리 coverslips를 사용할 수 이미징 및 immunocytochemistry 유리 슬라이드에 나중에 게재 위치에 대한 페트리 접시)의 나사가 빠진 것. 기음과 PBS 3 회의 초과로 씻어, 건조 보자. 그런 다음 10 μg / PBS에 ML laminin과 코트 요리 37도에서 한 시간 동안 (우리는 일반적으로 충분한 표면 위로 수영장을 coverslip 당 500 μl를 사용). laminin 솔루션을 기음과 PBS의 초과로 3 회 씻어, laminin 코팅 표면은 무선 인터페이스에 노출 될 수 있도록하지 않도록주의 것. Replac문화 미디어 전자 PBS (50 % 벨소리의, 49% L-15 미디어, 1 % 태아 소 혈청, 플러스 50 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신과 gentamycin, 산도 7.4 및 필터는 소독). (벨소리의 미디어, 115 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 10 밀리미터 Hepes의 산도 7.4, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 우리의 프로토콜이 미디어를 사용하지만, 그것은이 뉴런이 에너지 보유 감소 나이가 Xenopus 망막 신경절 문화에 대한 일반적인 풍부한 미디어, 것에주의해야한다. 청소년 척추의 문화는 생존 및 추가 성장 요인없이 순수 Ringers의 미디어 이상의 24 시간을위한 성장,이 참이 시스템을 사용의 장점 중 하나입니다 것입니다. 선택 사항 : 추가 NT3와 BDNF 축삭의 가지를 높이기 위해 문화 미디어 (25 μl / NG 각각의 최종 농도까지). </li><li> 때문에 주입 mRNA의 표현의 다양성 때문에, 배아는 형광의 모자이크가 발생할 수 있습니다. 이전 EXP 그 배아를 식별하는 dissections, 형광의 존재에 대한 화면 배아를 수행하기신경 튜브의 형광 융합 단백질을 ress. Steinberg의 미디어 (58 MM NaCl, 0.67 MM KCl, 0.44 MM 칼슘 (NO 3) 2, 1.3 MM MgSO 4, 4.6 MM 트리스 후 7.8로 산도로 가득 아가로 오스 코팅 플라스틱 그릇에 무대 20-23에서 형광 배아를 배치 autoclaved) 5. 아가로 오스 코팅 요리, 0.1X MMR 그리고이 굳어에 녹인 1% 아가로 오스와 플라스틱 접시의 코트 바닥을 확인합니다. 손상은 이후의 분해 단계에서 사용되는 고급 집게와 텅스텐 바늘로 발생하지 않습니다 그래서이 부드러운 표면을 제공합니다. 단계 23 이후 배아의 해부가 가능하지만, 조직은 서로 밀접하게 준수하기 때문에 collagenase로 더 이상 치료를 필요로 더 도전합니다. </li><li> 박리 범위에서 고급 집게로 vitelline 멤브레인을 제거하고 절개 일련의하여, 배아의 전체 등쪽 부분을 분리. 한 포셉이 곳에서 배를 누른 상태 동안의 절개를 만들기 위해 두 번째를 사용하여중공 내부를 노출 할 수있는 배아의 측면. 그런 다음이를 신경 튜브를 포함하는 등쪽 부분을 분리 할 수​​ 반으로 배아를 절단, 배의 등쪽과 복부 반쪽 사이의 조직을 함께 공략하기 위해 두 집게를 사용합니다. </li><li> 조직을 느슨하게 할 수있는 회선 근에 15-20 분,하고 신선한 Steinberg의 솔루션과 플라스틱 아가로 오스 - 코팅 접시에 피펫 등의 explant에 대한 Steinberg의 미디어에 2 밀리그램 / ML collagenase있는 Eppendorf 튜브에 등쪽 explant를 놓습니다. 또는 explant은 전체 절개가 이후 수행 할 수 15 분에 대한 collagenase 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 등쪽 표피와 복부 notochord에서 신경 튜브를 해부. 표피와 기본 조직 사이의 집게의 끝을 밀어 천천히 신경 튜브 아래를 공개, 표피를 잡아. 그런 다음 사이에 팁을 슬라이드에 조직을 개최 한 집게를 사용하여 다른신경 튜브 및 notochord. 마지막으로, 관의 양쪽에 somites을 제거 포셉을 사용합니다. </li><li> 단계 3.1에서 설명한 바와 같이, 문화, 미디어로 가득한 아가로 오스 - 코팅 접시에 신경 튜브를 전송합니다. </li><li> 여러 신경 튜브의 수집 후, 밖으로 확산, 중간 (단계 3.1에서 작성)로 가득 한 후 날카롭게 텅스텐 바늘이나 포셉, 그리고 플레이트 문화 요리의 조각을 사용하여 수많은 조각 (약 20 전체 튜브가 분리되어있는 경우)으로 잘라 균등 행의 explants. </li><li> 이 연결 셀을 방해하기 때문에 도금 후, 요리를 이동하지 않습니다. 20-22 주위 도금 신경 튜브 explants를 품다 ° C. 우리는 일반적으로 하룻밤 실온에서 벤치에 세포의 요리를 두십시오. Xenopus laevis 뉴런의 장점 중 하나는 CO 2 수준 또는 온도를 조절 세포 배양을위한 특별 보육이 필요하지 않습니다 것입니다. Neurites과 성장 콘은 실온 12 준수하고 이미징 할 수 있습니다도금 후 -24 시간, 가지가 성장 요인의 추가로 가속 할 수는 있습니다. 일반적으로, RNA 또는 플라스미드 제품의 표정은 세포 사이의 변수 표현 될 것이고, 따라서 성장 콘 사이의 형광 표현 수준의 범위가있을 수 있습니다. 이 특정 구조에 따라 달라집니다 있지만 우리는 도금 후 48 시간 이상 지속하는 형광 단백질의 RNA 발현을 관찰했습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 그림 1A에 요약되어있는 프로토콜을 따라하면 건강 올바르게 - 해부 및 배양 신경 explants는 laminin / 그림 1b에 도시 된 바와 같이 폴리 라이신 기판에 모든 방향으로 다수의 axons 또는 neurites을 보내드립니다. axons의 끝을 성장 콘은 이오를 검사하기 위해 이미지 전체 운동성 역학에 그림 1C에서 볼 DIC 광학, 또는 고해상도 형광 현미경에 의해 이미징 할 수 있습니다휘황 태그 cytoskeletal 단백질의 calization 예를 들어, EB1-GFP는 그림 1D에 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 프로토콜과 예상 결과의 요약. A) 프로토콜 흐름 차트입니다. 일 3 절개에 대한 자세한 내용은 동영상을 참조하십시오. 전체 신경 튜브는 약 20 동일 크기의 조각으로 잘라 coverslip에 행에 고르게 분산되어야한다. 이 만화에서, 가위는 훌륭한 포셉으로 조직을 절단 대표 그려져있다. CG chorionic 생식샘 자극 호르몬 B) explant (왼쪽 상단 모서리에있는 explant)에서 성장 axons 또는 neurites의 DIC 이미지입니다. 성장 축삭의 끝에서 성장 콘의 C) 높은 배율 이미지입니다. 성장 콘에서 EB1-GFP의 D) 형​​광 현미경 이미지입니다. 스케일 바는 10 μm이 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

조건이 적절한 경우 Xenopus laevis 신경 explants는 laminin / 폴리 라이신 기판에 도금 후 24 시간으로 매우 강력한 방식으로 neurites을 보낼 수 있습니다. 일반적으로 길이가 100 μm 이상 있지만,이 기판과, 성장 콘은 높은 운동성하고 explant에서 바깥쪽으로 모든 방향으로 연장, 1 mm까지의 축삭의 길이를 얻을 수 있습니다. neurites 알아 성장하지 않으면 경우가이 이유 제한된 수의가 있습니다. 하나의 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Chorionic 생식샘 자극 호르몬 </td><td> 은의 화학 연구소 </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> 시스테인 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine 키트 </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Borosil의 바늘에게 1.2 mm를 모세관 (OD) × 0.9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> 시그마 </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 Biologie Inox 집게 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek 요리 </td><td> 매트 테크 주식회사 </td><td> P35G - 1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> 폴리-L-라이시NE </td><td> 시그마 </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> 시그마 </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> 시그마 </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

축삭지도의 복잡한 과정은 크게 성장 축삭의 끝에서 동적 운동성 구조입니다 성장 콘에 의해 구동된다. 축삭의 가지 동안 성장 콘 앞으로의 성장 콘을 추진하고 정확하게 특정 목표 1을 (를) 찾을 수로 이동하기 위해 자사의 세포 골격을 조절하는 가이드 큐 정보를 여러 소스를 통합해야합니다. 이 통합은 cytoskeletal 수준에서 발생하는 방법을 계속 대두되고, cytoskeletal 단백질과 성장 콘에서 이펙터 역학 시험이 메커니즘의 해설을 할 수 있습니다. Xenopus laevis 성장 콘이됩니다 (직경 10-30 미크론) 충분히 큰 높은 수행 할 수 해상도 cytoskeletal 역학의 라이브 영상 (예 2-4)과는 다른 vertebrates에 비해 실험실 환경에서 분리하고 조작하기 쉽습니다. 개구리 성장 원뿔 마이크에 발달 신경 생물학 연구, 중요한 초기 분석을위한 고전 모델 시스템입니다rotubule 역학은 처음이 시스템은 5-7를 사용 발견되었습니다. 이 방법 8, 계란 수집하고 체외에서 수정 된, 유전자 발현을 조작하는 RNA 인코딩 휘황 태그 cytoskeletal 융합 단백질 또는 다른 구조로 주입 한 다음, 신경 튜브 단계로 발전 할 수있었습니다. 신경 튜브는 절개로 분리 한 후 배양하고 있으며, outgrowing neurites의 성장 콘은 이미징 있습니다. 이 문서에서는, 우리는이 방법 이후의 고해상도 이미지 분석을위한 문화 Xenopus laevis의 성장 콘에게있는 목표를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리가 + TIP 융합 단백질 EB1-GFP의 예를 제공하지만,이 방법은 성장 콘 이내에 행동을 명료하게하다하는 단백질의 수에 적용 할 수 있습니다.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

해부에서 배양 신경 explants<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

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Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

12.5K 조회수.  Harvard Medical School. 해부에서 배양 신경 explants Xenopus laevis 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.

비디오: Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서<em&gt; Xenopus</em&gt; 신경 근육 공동 문화

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

테스트 시각 기능에 대한 간단한 행동 분석<em&gt;는 Xenopus laevis의</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

대뇌 피 질의 로컬 필드 전위, 심전도, 치십시오, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 리듬 호흡의 동시 녹음

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...