우리는 baculovirus의 AcMNPV를 제공하고 도움 토론 데이비드 Theilmann을 (태평양 아그리 - 식품 연구 센터, 섬머, 브리티시 컬럼비아) 감사드립니다. 이 작품은 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI), 보건 연구 (CIHR), 보건 연구 (MSFHR)의 마이클 스미스 재단의 캐나다 연구소, 그리고 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 부여로 지원이 .

1 부 : microinjection에 대한 Xenopus의 oocytes의 작성 <ol><li> 88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.82 MM : 칼슘 무료 수정 바쓰의 호수에서 collagenase 용액 (5 MG / ML collagenase 20 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 관에 Xenopus laevis의 난소의 작은 조각 (2cm에 대해) 장소 MgSO 4, 10 MM Hepes, 산도 7.5). Collagenase는 oocytes를 둘러싸고 뿌리 세포를 제거하는 데 사용됩니다. </li><li> 쉐이크 플랫폼에서 튜브를 장소와 한 시간 동안 (100 RPM에서) 부드럽게 그것을 바위. 이번 collagenase 다른 많은에 따라 다릅니다. 따라서 일시간 후, oocytes의 작은 샘플을 가지고 해부 현미경으로 그들을 검사합니다. 제대로 드 folliculated oocytes 잘 서로 구분해야하고, 그것은 oocyte에 유리 바늘을 삽입하기 쉬운해야합니다. oocytes가 충분히 드 folliculated하지 않으면, 그들은 collagenase 솔루션에 남겨진 또 수시로 확인하고 있습니다. </li><li> (MBS : 88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.82 MM MgSO 4, 0.33 MM 칼슘 (NO 3) 2, 0.41 MM CaCl 2, 10 MM Hepes, 산도 7.5) 수정 바쓰의 생리와 oocytes 세 번 씻으십시오, 그들을 전송 MBS 플러스 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 100 mm 직경 페트리 접시에. oocytes 지금 microinjected 준비하고 있습니다. microinjection은 또 하루에 수행되는 경우, 최대 일주일 4 ° C에서 oocytes를 저장합니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 microinjection을위한 성숙 단계의 VI oocytes를 선택합니다. 이러한 oocytes는 검은 동물 북반구와 크림 색깔의 식물 반구 사이 좋은 대조와 큰 있습니다. </li><li> microwell 접시 (Nunc, 10 μl 잘 볼륨)로 성숙 단계 VI의 oocytes을 전송합니다. 이것은 oocytes의 undisrupted 흡입을 허용하도록 끝에 절단되어 피펫 팁와 200 μl pipettor을 사용하여 신중하게 이루어져야합니다. </li></ol> 2 부 : Xenopus의 oocytes의 Microinjection <ol><li> microinjection의 시각화에 투입, 1 % bromphenol 파란색의 작은 금액을 추가하여 microinjected 수 가져오기 기판을 준비합니다. 예를 들어, 우리는 기판의 10 μl로 bromphenol 청색 1 μl를 추가합니다. </li><li> 100 mm 직경 페트리 접시에 Parafilm의 작은 스트립를 삽입하고, Parafilm 스트립에 주입하는 솔루션의 5 μl 드롭을 분배. </li><li> 주입하는 솔루션으로 이전에 보정 주사 바늘 (주사 + Matic 풀러와 6.6 - μl micropipette 드루먼드를 당기는 얻은) 입력합니다. 이 경우, microinjector는 열망 모드에 설정됩니다. 주사 바늘을 보정하기 위해서는 바늘 50 NL의 볼륨에 해당하는 모든 0.5 mm를 도트 표시합니다. </li><li> 세포질 주입 들어, 약 45도 각도에서 동물 반구에 아주 가까이, 식물 북반구에서 oocyte에 바늘의 끝부분을 삽입합니다. microinject에 microinjector 설정을 켜고, 그리고 수입 기​​판 50 NL 각 oocyte를 microinject. 바늘에 점 표시가 주입되어 기판의 크기를 모니터링하는 데 사용됩니다. </li><li> MBS 가득한 작은 (35 - mm 직경) 페트리 접시에 주입 oocytes를 전송하고, NPCs와 관련된 수입 기​​판의 관찰을 허용하는 등 (시간 포인트가 너무 선택됩니다 시간의 원하는 금액을 실온에서 품어, 이러한 문제가 발생합니다 단백질과 적극적으로 NPC쪽으로 이송 아르 사용할 수있는 최신 바이러스 예방 프로그램으로 10 ~ 30 분,이 시간은 또한) 주사의 사이트와 단백질 / 바이러스의 크기에 따라 달라집니다. </li><li> 배양이 완료되면, MBS의 2 % 글루 타 알데히드를 포함하는 4 - ML 유리관에 oocytes를 전송하고, 4 밤새 수정 ° C. </li></ol> 파트 3 : Xenopus의 oocytes의 해부 <ol><li> 다음날, MBS와 oocytes에게 3 회 씻는다. </li><li> 낮은 소금 버퍼 (1 ㎜ KCl, 0.5 MM MgCl 2, 10 MM HEPES, pH를 7.5 LSB) 가득한 작은 페트리 접시에 oocytes를 전송합니다. 해부 현미경을 사용하고 핀셋을 해부하고, 각 oocyte에서 식물 장대를 제거합니다. 다른 쌍 식물 기둥을 제거하기 위해 가위처럼 사용할되는 동안 그것은 핀셋 한 쌍의와 해부되는 oocyte를 안정화하는 데 유용합니다. 이 시점에서 그것은 cytosol에서 파란색 가미의 존재에 의해 microinjection의 성공 여부를 평가하는 것이 가능합니다. 프로토콜은 성공적으로 microinjected 있던 oocytes 지속됩니다. 또한, 샘플은 EM에 대비하려면이 절개의 단계는 트리밍과 샘플을 sectioning 때 핵을 찾을 수가 훨씬 더 쉬워집니다. </li><li> 실온에서 한 시간 만이라도 LSB의 2 % 글루 타 알데히드와 함께 다시 해부 oocytes을 수정. </li><li> 고정 후, LSB와 해부 oocytes 세 번 씻으십시오. </li></ol> 4 부 : 삽입 및 EM을 희석 - Sectioning위한 속이고 Oocytes의 작성 <ol><li> 우울증의 슬라이드를 해부 oocytes을 전송합니다. POS로 액체로 많은 기음(그래서 그들이 건조하지 않도록) 시블하고 신속하게이 2% 낮은 용융 아가로 오스와 해부 oocytes을 커버. 아가로 오스가 여전히 부드럽고 있지만, 서로 oocytes를 구분하기 위해 피펫 팁을 사용하고 각 oocyte가 아래로 얼굴 아니면되도록합니다 (옆으로). </li><li> 아가로 오스는 약 10 분 동안 응고하도록 허용합니다. 아가로 오스는 굳은되면, 작은 조각 하나를 해부 oocyte를 포함하는 각에 아가로 오스를 잘라 면도날을 사용합니다. </li><li> 4 ML 유리관에있는 아가로 오스 - 임베디드 oocytes를 삽입하고, 실온에서 한 시간 만이라도 1퍼센트 LSB에서 오소 4를 이후 수정. </li><li> 샘플에게 LSB에 세 번 씻으십시오. 필요한 경우, ° C 하룻밤 4 샘플을 저장하고 다음날 프로토콜을 계속합니다. </li><li> 순차적으로 (20 분 각 50, 70, 및 90 % 에탄올) 알코올의 오름차순 일련의 샘플을 탈수. 이것은 15 분 각각에 대해 100 %의 에탄올에 두 변경을합니다. 마지막 15 분 100 %의 아세톤과 샘플을 탈수. </li><li> 적어도 6 시간 동안 2시 1분 두 시간 동안 Epon와 아세톤의 혼합, 그리고 마지막으로 순수 Epon으로하여 침투 다음 한 시간 만이라도 1:1 Epon의 혼합물 (Fluka) 및 아세톤과 샘플을 침투. </li><li> 평면 포함 금형에 넣어 샘플 신선한 순수 Epon으로 가득. oocytes 같은 방식으로 지향하는 가까이 사출 사이트로 핵의 측면 -이 경우에는 해부되었습니다 oocytes의 측면은 - 먼저 sectioned 것입니다. 이 단계는 선택된 기판의 수입을 시각화의 기회를 최적화합니다. </li><li> 마지막으로, 60 이틀 ° C.에 대한 Epon을 중합 </li><li> 샘플을 시각화하기 위해 블록이 ultramicrotome를 사용하여 다듬은 후 sectioned 있습니다. 섹션은 표준 절차를 사용하여 스테인드 EM의 격자,에 전송하고, 전송 전자 현미경으로 시각. 그것이 표준 EM 절차이므로 우리는 프로토콜의이 부분을 표시하지 않습니다됩니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 프로토콜이 성공적 않은 경우 다음 핵 봉투 (NE)와 NPCs는 EM micrographs에 명확하게 표시해야합니다. 기판 주입 및 주입과 고정 사이의 시간의 양에 따라, 기판은 NPC에서 또는 NPC의 핵 얼굴, NPC의 세포질 얼굴을 볼 수 있습니다. 그림 1은 4 시간 동안 ° C 4 incubated baculovirus AcMNPV의 capsids로 주입되어 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 단면 NE, 그리고 퍼가기 얇은 섹션에 대한 처리를 보여줍니다 EM은 설명했다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. NPC의 세포질 얼굴 capsid 도킹은 흰색 화살표로 표시됩니다. 반대로, 그림 2는 네 시간 동안 실온에서 incubated 마우스의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스 (MVM)으로 주사되어있는 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 단면 NE를 보여줍니다, 그리고 삽입 및 EM과 같이 설명 얇은 섹션을 처리했습니다. 이 기법을 사용, 우리는 MVM은 NE (코헨과 Panté, 2005)의 혼란을 유도 것으로 나타났습니다. 괄호는 NE에 휴식을 나타냅니다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. NE와 관련된 Putative MVM의 capsids는 흰색 화살표로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="그림 1" width="600" height="459" /> 그림 1 : 4 incubated, baculovirus AC MNPV의 capsids로 주입되어 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 NE의 단면의 전자 현미경 ° 네 시간 동안 C, 그리고에 대한 처리 퍼가기과 얇은 부분 EM은 설명했다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. Capsids은 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 NM. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="그림 2" width="600" height="264" /> 그림 2 : 네 시간 동안 실온에서 incubated 마우스의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스 (MVM)으로 주사되어있는 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 NE의 단면의 전자 현미경과 삽입 및 EM과 같이 설명 얇은 섹션을 처리했습니다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. 괄호는 NE에 휴식을 나타냅니다. NE와 관련된 Putative MVM의 capsids는 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 NM.

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	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

얇은 sectioning EM과 함께 Xenopus의 oocytes의 Microinjection은 nucleocytoplasmic 전송을 연구를위한 매우 효과적인 도구입니다. 이 시스템은 같은 세포질 섬유와 핵 바구니 (Panté 2006에서 검토)로 NPC의 구조 구성 요소와 핵 수입 기​​판의 예를 들어 상호 작용에 대해, NPC를 통해 수입의 서로 다른 단계를 매핑하는 데 사용되었습니다. 또한 원자력 복제 바이러스의 핵 수입 (; 레이브 외, 2003;. 코헨...

microinjection of xenopus laevis oocytes

얇은 sectioning 전자 현미경 (EM) 다음 Xenopus laevis의 oocytes의 Microinjection은 nucleocytoplasmic 전송을 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다. 때문에 대형 핵 및 핵 기공 단지 (NPCs)의 높은 밀도, 핵 수송 Xenopus oocyte의 시각에서 쉽게하실 수 있습니다. 원자력 수출입의 메커니즘에 많은 통찰력이 시스템의 사용 (Panté 2006 년 검토)를 통해 얻은되었습니다. 또한, 우리는 호스트 핵의 복제 여러 바이러스의 핵 수입 경로를 해부하다에 Xenopus의 oocytes의 microinjection을 사용했습니다. 여기서 우리는 핵 수입 기판과 Xenopus의 oocytes의 세포질 microinjection을 보여줍니다. 우리는 또한에 의해 시각화를위한 주입 oocytes의 준비를 보여 얇은 sectioning 해부, 탈수, 그리고 에폭시 수지에 포함 oocytes의 포함 포함 EM​​합니다. 마지막으로, 우리는 baculovirus Autographa californica의 nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) 또는 마우스 (MVM)의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스의 capsid와 microinjected, 그리고 기술의 잠재적인 응용 프로그램을 논의했습니다 oocytes에 대한 대표적인 결과를 제공합니다.

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

여기의 세포질 microinjection을 보여주<em&gt; Xenopus laevis</em핵 수입 기​​판뿐만 아니라 박막 sectioning 전자 현미경에 의해 시각화를위한 주입 oocytes의 준비&gt; oocytes.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K 조회수.  University of British Columbia - UBC. 여기의 세포질 microinjection을 보여주 Xenopus laevis oocytes.

비디오: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

연구

생물학

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis 여성의 난자를 구하기

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

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