Name: studying wnt signaling during patterning of conducting airways
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
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우리는 조직 학적 절차에 마이크 Muntifering 및 공 초점 이미지와 매트 코프 론 (Kofron)와 게일 Macke의 도움을 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 건강 NHLBI의 국립 연구소 (DS에 K01HL115447)에 의해 지원되었다.

동물은 무균 상태에서 보관 하였다. 마우스는 CCHMC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (신시내티, OH USA)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 처리 하였다. 이러한 연구를 통해 이용 마우스가 혼합 된 배경에서 유지 하였다. 1. 전체 마운트 X - 갈 락토시다 제 염색 <ol><li> CO 2 흡입에 의해, E14.5에 E11.5에서 임신 여성을 안락사. , CO 2 챔버에서 동물을 배치 CO 2 챔버를 부과합니다. 5 분의 최소 챔버에서 동물을 유지한다. 자궁 전위에 의해 안락사의 보조 방법을 수행합니다. </li><li> 에탄올 (EtOH로) 70 % 단일 복부 정중선 절개 개복술을 수행 청소 복부 영역입니다. 수술 가위 및 표준 패턴 (직선 톱니) 집게를 활용합니다. </li><li> 페트리 접시에 배치 즉시 집게 및 미세 가위를 사용하여 자궁 뿔을 분리하고 조직을 PBS 용액을 냉각 함유. 진행까지 얼음에 조직을 유지배아의 분리합니다. </li><li> 자궁 뿔에서 배아를 분리합니다. 해부 현미경을 사용하여 배아 기관 폐 조직을 해부하다. 상태에서 자궁 조직에 구멍과 배아를 해제 concepti하기 좋은 팁 집게와 가위를 사용한다. <ol><li> 배아 세포막을 나머지 제거합니다. 배아의 바늘 블레이드의 도움을 잘라 머리와 횡격막 아래의 하체 부분. 랜드 마크로 간을 찾습니다. </li><li> 배아의 흉부 영역의 분리 후, 몸 벽, 척추, 심장 사용 바늘 블레이드의 측면을 제거하기 위해 진행합니다. 기관 조직 부상을 방지하기 위해 심장을 제거하는 동안주의하십시오. 마지막으로, 조심스럽게 바늘 블레이드의 도움으로 식도를 잡아 당겨 기관에서 식도를 구분합니다. 얼음에 PBS 용액에 조직을 유지한다. </li></ol></li><li> 4 용액에 장소 조직은 유리 또는 전송 피펫을 사용하여 캡 튜브를 나사. 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 기관 폐 조직을 고정한다. 고정 후,PBS로 조직을 씻어. 세정하는 동안, X-여자 염색 용액 (5 mM의 K 3의 Fe (CN 추가) (6), (100 ㎕의 0.5 M 주식) 5 mM의 K 4의 Fe (CN) 6 (100 ㎕의 0.5 M 주) 2 밀리미터의 MgCl 2, (준비 20 ㎕의 1 M 주식) 0.01 %의 NaDOC (50 μl의 2 % 주), 0.02 % NP 4 O (100 ㎕를 2 % 주), 1 ㎎ / ㎖ X-여자 (20 mg을 500 μL / ㎖ 주) 및 9.13 ml의 10 ㎖의 최종 부피)으로 가져다 증류수. </li><li> 나머지 PBS를 제거하고 유리 바이알에 X-여자 염색 용액 2 ㎖를 추가합니다. 통에 트레이에 튜브를 놓습니다. 얼룩 조직 한 X-여자의 염색 액의 시간 2. 추가 처리 및 매립에 대한 4 시간 동안 X-여자 솔루션의 조직을 품어. </li><li> 3 % 디메틸 술폭 시드-PBS에서 세척 조직에 의해 반응을 정지. 5 분 동안 PBS에서 70 % 에탄올에서 각각 세척하고 저장을 3 회 헹군다. </li><li> 1 % 아가로 오스 / PBS 용액으로 배양 접시를 입력합니다. 아가로 오스 공고히 할 수 있습니다. 유리 전달 피펫을 사용하여, 아가로 공동의 조직을 올려PBS 용액으로 가득 ated 판. 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 사진. 시야에 적합한 필터를 선택합니다. </li><li> 더 나은 파라핀 삽입 및 절편에 대한 X-여자 염색 과정 샘플 사이트를 구별합니다. 미세 스크린 카세트에 넣어 샘플. <ol><li> 여섯 알코올의 변경 : 5 분 첫번째 변화와 나머지 각 변경 당 3 분 파라핀 삽입에 대한 샘플은 자동화 된 프로세서를 사용하여 다음과 같이 짧은주기를 설정 처리합니다. 크실렌의 세 가지 변화 : 5 분 첫번째 변화와 3 분 다음이 변경됩니다. 이전 단계는 30 ° C에서 수행됩니다. 25 분, 8 분, 5 분 : 마지막으로, 62 ° C에서 파라핀의 세 가지 변화를 수행합니다. </li></ol></li><li> 조직이 보트를 삽입의 바닥에 평평하게 누워 삽입하는 동양 샘플. 조심스럽게 삽입 배를 채우기 위해 파라핀을 추가합니다. 파라핀 응고 될 때까지 역을 내장의 냉각 판에 즉시 쿨. 보트를 삽입에서 블록을 제거합니다. 마이크로톰을 사용하여, 6 μm의 S를 생성ections. 전처리 - 슬라이드와 1 시간 동안 42 ° C에서 슬라이드 따뜻한 설정에 건조 슬라이드 마운트 부분. </li><li> 구워는 56 ºC에서 오븐에서 하룻밤 슬라이드. 랙에 슬라이드를 놓습니다. Deparaffinize 100 % 크실렌 세 변경, 10 분에 각각 슬라이드. 자일 렌 200 ㎖로 가득 요리를 염색 사용합니다. </li><li> 10 내지 30 초 동안 핵 패스트 레드 대조 염색 전에 PBS로 등급을 EtOH 시리즈 (100 %, 70 %, 50 % 및 30 %, 단계 당 1 분)을 사용하여 슬라이드를 재수. 수돗물로 5 분 핵 고속 레드 초과를 제거 할 때마다 세 번 슬라이드를 씻어. </li><li> 크실렌 기반 설치 미디어 미끄러지는 크실렌의 세 가지 변화 세척하기 전에 등급을 EtOH 시리즈의 슬라이드 (50 %, 70 % 및 100 %의 EtOH) (20 저러나 각 변경) 및 덮개를 탈수. </li></ol> 2. 렉틴 염색 <ol><li> 단계 1.4-1.1에 설명 된대로 E13.5 및 E14.5의 기관 폐 조직을 해부하다. 스크류 캡 바이알에 유리 전송 피펫에게 장소 조직을 사용. 2 ml의 기관 폐 조직 해결4 ℃에서 하룻밤 2 % PFA 솔루션입니다. 고정 후, PBS에서 10 분마다 세척을 위해 세 번 샘플을 씻어. </li><li> 완충 용액 10 ㎖의 최종 부피 보통 차단 준비한다. PBS의 8 ml의 BSA (1 %) 0.1 g을 추가합니다. BSA는 용해 할 수 있습니다. 염소 혈청 (2 %) 트리톤 X-100 (0.3 %)의 0.03ml의 0.2 ML을 추가합니다. PBS 10 ml의 최종 볼륨을 가져와. 실온에서 차단 완충액 0.5 ml를 1 시간 동안 차단 샘플. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거하고 렉틴의 50 μg의 / μL, 10 % 염소 혈청과 PBS로 구성 렉틴 용액으로 교체합니다. 샘플 당 렉틴 용액 250 μl를 사용합니다. 4 ℃에서 밤새 품어. 알루미늄 호일과 조직을 포함하는 유리 병을 포함해야합니다. 렉틴 용액으로 배양 한 후, 10 분 동안 PBS로 세 번 샘플을 헹군다. </li><li> 샘플을 충당하기 위해 충분한 PBS를 포함하는 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에 장소 외식. 형광 - 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 사진. approp를 선택riate 필터는 형광을 검출한다. 렉틴 PNA 보통 GFP에 연결된다. </li></ol> 3. 전체 마운트 면역 형광 염색 및 공 초점 현미경 <ol><li> 4 ml의 유리 스크류 캡 바이알에 전송하고 4 % PFA에서 하룻밤 수정, 기관 폐 조직을 분리합니다. E11.5 조직은 2 % PFA에서 수정 될 수 있습니다. 메탄올 스토어 100 %. 시료는 -20 ° C에서 몇 개월까지 저장할 수있다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 메탄올을 제거하고 2 시간 동안 덴트의 블리치 (4 부 메탄올, 1 부 DMSO 1 부 30 % H 2 O 2)를 사용하여 샘플을 Permeabilize 하시려면. 다음 PBS에 희석 메탄올 등급 시리즈 하이드레이트 조직 : 100 % 메탄올, 75 % 메탄올, 50 % 메탄올, 25 % 메탄올, 100 % PBS. 수화의 각 단계에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> PBS로 희석 한 0.5 % 차단 시약 블럭 조직 교반하면서 실온에서 2 시간 (상세한 재료 참조). </li><li> 차단에 차 항체를 희석솔루션 (Sox9 1 : 100, Nkx2.1 1 : 200, αSMA 1 : 250), 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어. 실온에서 PBS 다섯 번 씻을 샘플. 1 시간 동안 각 세척을 수행합니다. </li><li> 0.5 % 차단 솔루션 (500) 희석 : 1에서 차 항체를 적용합니다. 조심스럽게 차 항체 간의 결합을 방지하기 위해 이차 항체를 선택합니다. 어두운 방에 4 ° C에서 밤새 품어. 세척 된 샘플을 실온에서 20 분간 3 회. 다음 PBS에 희석 메탄올 등급 직렬 샘플 탈수 : 25 % 메탄올, 50 % 메탄올을 75 % 메탄올, 100 % 메탄올, 10 분마다 단계. 참고 : 시료를 알루미늄 호일로 덮여 남아 있는지 확인하고 빛에 노출을 최소화 할 수 있습니다. 촬영까지 조직을 지금 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 전송 샘플은 사용자 정의 머레이의 맑은 용액의 약 200 μl를 19, 20 (2 부 벤질 벤조 에이트, 1 부 벤질 알코올) 즉시 BEF 메탄올과 맑은 제거, 무대 판을 제작하기광석 영상. 공 초점 현미경을 사용하여 사진. 프로세스 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석한다. </li></ol> 4. 세포 증식 <ol><li> 체중 100 μg의 BrdU의 / g 농도의 BrdU의 용액으로 복강 내 E11.5 임신 마우스를 주사. E12.5 또는 E13.5에서 배아를 프로토콜의 섹션 1에서 설명하고 분리로 여성을 희생. 칼 블레이드, 소비세 머리와 흉강 아래 신체의 아래 부분을 사용. </li><li> 4 ml의 캡 튜브를 나사에 가슴 조직을 놓고 하룻밤 4 % PFA 1 ㎖에 고정합니다. 30 %, 50 % 및 70 % 에탄올을 5 분마다 단계 : 세척에서 5 분 동안 PBS로 2 번 샘플은 다음과 같이 70 % 에탄올에 증류수까지 희석 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수. <ol><li> 중간 크기의 화면 카세트에 넣어 샘플. 사용 파라핀 삽입 및 자동 프로세서에 대한 프로세스 조직. 8 분 동안 알코올의 여섯 변화 각각 6 분 각각 세 가지 C에 대한 크실렌의 세 가지 변화를 다음과 같이주기를 설정25 분, 9 분, 8 분 동안 파라핀의 hanges. </li></ol></li><li> 1 시간 동안 42 ° C에서 슬라이드 따뜻한 설정에 슬라이드 준수 조직을 슬라이드에 섹션 1. 섹션에 설명 된대로 6 μm의 가로 또는 세로 섹션을 생성 할 수 있도록 원하는 위치에서 조직을 배향 파라핀에 포함. </li><li> 구워 슬라이드, 자신의 옆에, 하룻밤 56 ° C에서 오븐한다. 플라스틱 랙에 슬라이드를 놓습니다. 100 % 크실렌의 세 가지 변화, 변화 당 10 분 침지하여 탈 paraffinize 슬라이드. 완전히 슬라이드를 잠수함에 크실렌 200 ㎖를 사용합니다. PBS (5 분)로 등급을 EtOH 시리즈 (100 %, 70 %, 50 % 및 30 %, 교반 단계 당 5 분)를 이용하여 슬라이드를 재수. </li><li> 0.1 M 시트르산 18 ㎖의 시트르산 완충 monohydrated 혼합물을 100 ml의 0.1 M 시트르산 나트륨 용액 (82)을 준비하기 위해 10 mM의 시트르산을 완충액, pH가 6을 사용하여 항원 검색을 수행한다. <ol><li> 높은 전력에서 6.5 분 동안 항원 검색 솔루션과 전자 레인지로 가득 플라스틱 코 플린 항아리에 넣어 샘플. DIS 추가6 분 동안 40 % 전력에서 증발 - 시트 레이트 완충액 재가열을 보상하기 위해 코 플린 병에 물을 경작. </li><li> 물 위로, 6 분 동안 40 %의 전력으로 다시 재가열 코 플린 항아리를 채우십시오. 전자 레인지 시간은 사용하는 전자 레인지에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 슬라이드를 5 분 동안 PBS 다음 1 분, 증류수로 세척 슬라이드 전에 실온에서 20 분 동안 냉각시킵니다. PBS를 후 TBS를 함유하는 용액 (트리스 염기 2.425 g 및 1- 증류수 L로 희석 염화나트륨 8.765 g) 10 % 당나귀 혈청과 1 % BSA를 차단에서 2 시간 동안, 블록 슬라이드를 세척한다. </li></ol></li><li> 용액 (10 % 당나귀 혈청과 1 % BSA를 포함하는 TBS)를 차단에 희석 일차 항체를 추가합니다. BrdU의 (유사 분열 마커), Nkx2.1 (호흡기 상피) Sox9 및 αSMA (평활근 세포) (연골 세포를 야기 할 것이다). 4 ° C에서 밤새 슬라이드를 품어. 항체를 보존하기 위해 오버레이 방법을 사용합니다. 가스켓에 항체의 180 μl를 적용하고 커버 슬립 것처럼 슬라이드를 첨부핑. </li><li> 증류수로 슬라이드를 찍기로 가스켓을 분리합니다. 개스킷 제거한 후, TBS는 0.1 % 트윈 -20을 함유하는 여섯 5 분간 세척을 행하여 언 바운드 차 항체를 세척한다. <ol><li> 실온에서 1 시간 동안, 200 : 1의 희석 용액을 차단 희석 이차 항체로 슬라이드 부화. 그 중 원하지 않는 바인딩을 방지하기 위해주의 깊게 이차 항체를 선택합니다. 0.1 % 트윈을 포함하는 TBS로 3 ~ 5 분 세척을 수행하여 언 바운드 차 항체를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 두 번 0.1 M 트리스베이스에 슬라이드를 세척하고 5 분 동안 두 번 다음 0.05 M 트리스베이스. 또는 DAPI (1.5 μg의 / ㎖)없이 설치 미디어를 사용 coversliping 동안 슬라이드는 0.05 M 트리스베이스에 남아있을 수 있습니다. 저장 4 ° C에서 슬라이드 폴더에서 슬라이드와 알루미늄 호일로 폴더를 덮어 빛으로부터 보호합니다. </li></ol></li><li> 염색 및 사진 자동화 된 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다. 촬영 표지 세포 및 필드 당 총 세포 수를 계산20X 및 40X 총 세포에 세포 증식의 비율을 결정합니다. </li></ol>

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M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+(hdf)+embryos.">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li><li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C/PDGFR+pathway.">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li><li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis.">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li></ol>

&quot;저자는 공개 아무것도 없어.&quot;

호흡 기관의 형태 형성의 기초 이벤트 완전히 도통기도의 패터닝에 필요한 공정, 특히 이해되지 않는다. 이전의 연구 개발 이식편 공기 - 액체 계면에서의 배양이나 마트 리겔 (21, 22)에 포함 된 상기 생체 외 기법을 이용 하였다. 성장 인자가 개발 기관의 패터닝 및 기관 연골의 형성에 미치는 영향이 연구에서 나타났다. 이러한 연구에 대한 제한은 상기 조직의 구조가 적절하게 유?...

호흡 기계의 개발은 복부 내배엽 foregut 1, 2에서 Nkx2.1 양성 세포의 모양과 배아 일 9 (E9)에 의해 시작된다. 튜브가 별개의 실체로 구별 할 수있는 경우 식도 - 기관 튜브 분리, E11.5에 의해 중간 엽 조직 (3)에 의해 둘러싸인 해결됩니다. Wnt 신호는 폐 무 발생 4,5가 발생합니다 내배엽 호흡기 상피 세포에서 내장의 중간 엽과 β-catenin의 삭제로 표현 subtype 중 Wnt2 및 Wnt2b의 삭제와 호흡기의 사양에 중요한 역할을한다. 우리의 이전 연구는 폐 형성 부전에서 내배엽 호흡기 결과에서, WLS, 모두의 Wnt 리간드의화물 수용체 매개 분비의 삭제를 결정, 폐 혈관 개발 및 기관 간엽 6,7의 잘못된 패턴의 결함. 이러한 데이터는 상피 간엽 CRO의 중요성을 지원그것은 또한 다른 연구 8,9에 도시 된 바와 같이, SS는, 세포 분화 및 명세서에 말한다. 폐 개발의 초기 단계의 연구는 우리가 더 나은 호흡 정체성 10-16 구동 메커니즘을 이해 할 수있는 생체 외 및 생체 기법, 유전자에 의존한다. 공기 액체 계면에서 전체 폐 이식편 배양 널리 형태 형성 10,17,18 분기 폐의 초기 단계에서 성장 인자의 효과를 연구하는데 이용되고있다. 이 방법 형태와 같은 분지 형태 형성과 같은 변경 및 유전자 발현 조절의 리드로서 사용되는 반면, 배양 자체가 혈관 (17)의 개발을 지원하지 않으므로, 발달 과정의 초기 연구에 제한되어있다. 기관 연골의 개발이 문화 기술과 호환되지 수 있습니다 이상 배양 시간이 필요합니다. analyz하려면호흡기 형성시 Wnt 신호의 역할 즉, 우리는 배아 연구의 요구를 충족하기 위해 표준 기술을 채택했다. 우리는 볼륨, 염색 시간, 기관 - 폐 조직의 청산을위한 파라핀 삽입 및 타이밍에 대한 처리 사이클을 수정했습니다. 본 연구에 기재된 기술을 최적화의 주요 목표는 E14.5로 E11에서 일어나는 생쥐 기관 발달의 초기 단계를 분석 하였다. 기자 마우스 라인 Axin2LacZ 개발 기관의 중간 엽에서의 Wnt / β-catenin이 활동의 우리 정확하게 결정된 사이트를 사용. 우리는 또한 전체 마운트 기관 조직에 대한 렉틴 염색 절차를 적용했다. 따라서, 우리는 중간 엽 응축을 시각화하고 연골이 일어날 사이트를 예측할 수 있었다. 전체 마운트 및 고급 현미경 기술과 결합 WlsShhCre 마우스에서 얻은 배아 조직의 섹션의 염색은 TRA에 의해 생산의 Wnt 리간드의 역할을 공개 할 우리에게 허용기관 패터닝에 cheal 상피.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , rabbit</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, rabbit</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, mouse</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, guinea pig</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, mouse</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, sheep</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mouse</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Alexa fluor Molecular probes</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher brand super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Component of TSA kit #2&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy cassettes</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Available in different colors</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&amp;nbsp; Kernechtrot 0.1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Micro knives</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ceramic coated</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wide field microscope</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescence Dissecting microscope</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Automated fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Leica Application suite</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica imaging software</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon imaging software</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaging processing software</td></tr></tbody></table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

이 Wnt / β-catenin의 활동 전체 마운트 락-Z 염색은 기자 Axin2 락 -Z 마우스 (11)에서 분리 된 배아의 기관 - 폐 조직에서 검출되었다. 염색 사이트의 Wnt / β-catenin의 활성을 나타냅니다. 전체 마운트 염색 부분의 분석의 Wnt / β-catenin의 활동이 기관의 중간 엽에서 개발 폐의 주변 영역의 중간 엽에 존재...

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

전체 마운트에 연결된 리포터 생쥐 부 염색 현미경 및 생체 내 분석에 사용은 호흡기 정상 패터닝 기전의 분석을 용이하게한다. 여기에서 우리는 이러한 기술이 기관 개발하는 동안 Wnt 신호의 분석에 기여하는 방법에 대해 설명합니다.

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K 조회수.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  전체 마운트에 연결된 리포터 생쥐 부 염색 현미경 및 생체 내 분석에 사용은 호흡기 정상 패터닝 기전의 분석을 용이하게한다. 여기에서 우리는 이러한 기술이 기관 개발하는 동안 Wnt 신호의 분석에 기여하는 방법에 대해 설명합니다. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

연구

발생학

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

생물학

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt signaling operates via a dosage-driven mechanism, motivating the need to study and measure Wnt signaling in various cell types. Although several reporter models have been proposed to represent physiological Wnt expression, either the genetic context or the reporter protein highly influenced the validity, accuracy, and flexibility of these tools. This paper describes methods for acquiring and analyzing data obtained with the Axin2-mTurquoise2 mouse Wnt reporter model, which contains a mutated Axin2em1Fstl allele. This model facilitates the study of endogenous canonical Wnt signaling in individual cells over a wide range of Wnt activity.
This protocol describes how to fully appreciate Axin2-mTurquoise2 reporter activity using cell population analysis of the hematopoietic system, combined with cell surface markers or &#946;-catenin intracellular staining. These procedures serve as a base for implementation and reproduction in other tissues or cells of interest. By combining fluorescence-activated cell sorting and confocal imaging, distinct canonical Wnt expression levels can be visualized. The recommended measurement and analysis strategies provide quantitative data on the fluorescent expression levels for precise assessment of canonical Wnt signaling. These methods will be useful for researchers who want to use the Axin2-mTurquise2 model for canonical Wnt expression patterns.

Signaling levels are known to regulate cell fate, indicating that regulation of Wnt signaling constitutes an interesting therapeutic target. Here, we describe flow cytometry and confocal microscopy analysis methods for a robust murine canonical Wnt signaling reporter model that measures distinct Wnt signaling levels.

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be differentiated stepwise into 3D multicellular lung organoids, made of both epithelial and mesenchymal cell populations. We recapitulate embryonic developmental cues by temporally introducing a variety of growth factors and small molecules to efficiently generate definitive endoderm, anterior foregut endoderm, and subsequently lung progenitor cells. These cells are then embedded in growth factor reduced (GFR)-basement membrane matrix medium, allowing them to spontaneously develop into 3D lung organoids in response to external growth factors. These whole lung organoids (WLO) undergo early lung developmental stages including branching morphogenesis and maturation after exposure to dexamethasone, cyclic AMP and isobutylxanthine. WLOs possess airway epithelial cells expressing the markers KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) and MUC5AC (goblet) as well as alveolar epithelial cells expressing HOPX (alveolar type I) and SP-C (alveolar type II). Mesenchymal cells are also present, including smooth muscle actin (SMA), and platelet-derived growth factor receptor A (PDGFR&#945;). iPSC derived WLOs can be maintained in 3D culture conditions for many months and can be sorted for surface markers to purify a specific cell population. iPSC derived WLOs can also be utilized to study human lung development, including signaling between the lung epithelium and mesenchyme, to model genetic mutations on human lung cell function and development, and to determine the cytotoxicity of infective agents.

The article describes step wise directed differentiation of induced pluripotent stem cells to three-dimensional whole lung organoids containing both proximal and distal epithelial lung cells along with mesenchyme.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This process requires complex and coordinated paracrine interactions between signal-sending and signal-receiving cells. Given that these interactions can occur between various types of cells from different lineages, in vivo evaluation of cell-specific defects can be challenging. The present study describes a highly reproducible method to evaluate paracrine noncanonical Wnt signaling in vitro. This protocol was designed with the ability to (1) conduct functional and molecular assessments of noncanonical Wnt signaling between any two cell types of interest; (2) dissect the role of signal-sending versus signal-receiving molecules in the noncanonical Wnt signaling pathway; and (3) perform phenotypic rescue experiments with standard molecular or pharmacologic approaches.
This protocol was used to evaluate neural crest cell (NCC)-mediated noncanonical Wnt signaling in myoblasts. The presence of NCCs is associated with an increased number of phalloidin-positive cytoplasmic filopodia and lamellipodia in myoblasts and improved myoblast migration in a wound-healing assay. The Wnt5a-ROR2 axis was identified as a crucial noncanonical Wnt signaling pathway between NCC and second heart field (SHF) cardiomyoblast progenitors. In conclusion, this is a highly tractable protocol to study paracrine noncanonical Wnt signaling mechanisms in vitro.

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

The present study outlines a highly reproducible and tractable method to study paracrine noncanonical Wnt signaling events in vitro. This protocol was applied to evaluate the impact of paracrine Wnt5a signaling in murine neural crest cells and myoblasts.

체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

생체공학

조류 배아 피부 이식 배양 프로토콜에 대한 종합적인 검토

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

저자 스포트라이트: 현재 실험적인 조류 피부 이식 방법론에 대한 통찰력

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

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Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

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체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

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