이 프로토콜은 관심 있는 모든 세포 집단에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달을 기능적 및 분자적으로 평가하는 매우 재현 가능한 방법을 설명합니다. 기능 및 분자 평가는 동일한 세포 집단에서 수행되며 Wnt/PCP 경로의 모든 구성 요소를 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 시작하려면 이전에 펠릿화된 C2C12 셀을 10ml의 C2C12 배지에 재현탁합니다.
세포를 1:20의 비율로 희석하려면 9.5 밀리리터의 신선한 C2C12 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 0.5 밀리리터의 세포 현탁액을 넣고 P1000 피펫을 사용하여 혈청 학적 피펫과 부드럽게 혼합하고 희석 된 세포 현탁액 1 밀리리터를 새로운 4 개의 챔버가있는 웰의 각 웰에 넣고 인큐베이터에 넣습니다. O9-1 세포 삽입물을 도금하려면 O9-1 세포 펠릿을 10ml의 O9-1 성장 배지에 재현탁합니다. C2C12 세포 희석과 유사하게, O9-1 세포를 1:20의 비율로 희석한다.
다음으로, 1 밀리리터의 O9-1 성장 배지로 채워진 새로운 4 개의 챔버가있는 우물의 각 웰 내부에 단일 투과성 삽입물을 놓습니다. 희석된 O9-1 세포 현탁액 300마이크로리터를 각 인서트에 추가하고 인서트가 완전히 잠기도록 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 우물을 배양하십시오.
O9-1 세포에서 siRNA 녹다운을 수행하려면 제조업체의 권장 사항에 따라 감소된 혈청 배지에서 siRNA 및 형질주입 시약을 원하는 농도로 희석합니다. 희석된 siRNA와 형질주입 시약을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 실온에서 7분 동안 인큐베이션합니다. 18 내지 24시간의 세포 도금 후, siRNA 지질 복합체를 O9-1 세포 삽입물에 첨가하고 대략 34 내지 48시간 동안 배양한다.
세포가 70 내지 80%confluency에 도달할 때, C2C12 약실 우물에서 매체를 제거하고 PBS에 가진 세포를 한번 세척하십시오. PBS를 제거한 후, 멸균된 P10 피펫 팁을 단일 방향으로 단단히 통과시켜 세포 단분자층의 전체 길이 또는 너비에 걸쳐 세포를 긁기 시작합니다. 세포가 긁히면 PBS 1 밀리리터를 빠르게 추가하십시오.
그런 다음 컴퓨터와 현미경을 켭니다. 챔버 슬라이드를 스테이지에 놓고 대물 다이얼을 5배 배율로 돌립니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
카메라 탭을 클릭한 다음 라이브 버튼을 클릭하여 AxioCam IC 탭의 셀을 시각화합니다. 빛이 카메라와 컴퓨터 화면으로 전달될 수 있도록 조명 필터를 완전히 당겨 빼냈는지 확인하고 챔버 슬라이드를 수동으로 이동하거나 회전하여 AxioCam IC 탭의 라이브 이미지 중앙에 상처 영역을 배치합니다. 이미지를 촬영하려면 스냅을 클릭하여 이미지가 포함된 AxioCam IC 탭 옆에 있는 새 탭을 엽니다.
이 정지 이미지를 저장하려면 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택한 다음 왼쪽 막대에서 바탕 화면을 선택하여 파일을 바탕 화면에 저장하고 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력하고 그림을 czi 파일 형식으로 저장합니다. 사진을 tiff로 저장하려면 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택한 다음 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력합니다. 파일 형식 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 tiff를 선택합니다.
챔버 슬라이드를 수동으로 재배치하여 동일한 웰에 있는 상처의 다른 지점에서 2-3개의 이미지를 더 촬영합니다. 이미징 후 각 웰에서 PBS를 제거하고 C2C12 배지 1밀리리터를 추가합니다. 챔버 웰의 각 웰에 O9-1 세포를 포함하는 삽입물을 수동으로 배치하여 웰 삽입 공동 배양 시스템을 조립합니다.
인서트의 바닥이 기본 C2C12 셀 바로 위에 오도록 인서트를 웰 아래로 부드럽게 밀어 넣습니다. 웰 인서트 구조체를 인큐베이터로 되돌리고 세포가 총 9-12시간 동안 이동하도록 합니다. 최적의 이동 시간을 결정하려면 상처 생성 후 6 시간에 세포를 확인한 다음 그 후 2-3 시간마다 세포를 확인하십시오.
대조군 조건에서 세포가 상처를 완전히 덮을 때 실험을 종료합니다. 마이그레이션 분석 종료를 시작하고 마이그레이션 기간의 9 내지 12시간 후에 O9-1 세포 삽입물을 제거하여 웰 삽입 시스템 해체를 시작한다. C2C12 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
챔버 웰에 0.5ml의 PBS를 추가하고 이동 후 세포의 최종 이미지를 촬영합니다. 배지와 혼합 된 모든 PBS를 조심스럽게 흡입하고 키트 지침을 사용하여 챔버 웰에서 플라스틱 챔버를 제거합니다. C2C12 세포를 포함하는 하부 슬라이드를 남겨 둡니다.
면역 염색을 위해 즉시 슬라이드를 4% 파라폼 알데히드로 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 파라포름알데히드를 제거하고 PBST가 포함된 0.1% 트리톤 X-100으로 슬라이드를 실온에서 15분 동안 세척합니다. 15분 후, PBST를 붓고 슬라이드를 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한다.
그런 다음 슬라이드 주위에 소수성 펜으로 소수성 경계를 만들어 슬라이드에서 용액이 쏟아져 부착 세포의 파괴를 방지하는 것을 방지합니다. 다음으로, 약 0.5ml의 1%BSA 차단 용액을 소수성 경계 내의 슬라이드에 첨가하고 가습된 슬라이드 챔버에서 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양이 끝나면 블로킹 용액을 제거하고 소수성 경계 내에서이 슬라이드에 phalloidin 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
다음날 슬라이드를 빛에 노출되지 않도록 슬라이드 홀더에 넣으십시오. 세포를 실온에서 각각 10분 동안 PBS로 세 번 세척한다. DAPI 함유 장착 매체를 추가하고 유리 커버 슬립으로 슬라이드를 장착하고 표준 형광 현미경을 사용하여 세포를 캡처합니다.
본 연구에서, 재조합 Wnt5a를 공동 배양 웰에 첨가하면 일부 영역의 완전한 회복과 함께 근원세포 이동이 9시간 가속화되었습니다. 세 가지 조건 모두에서 이동 근아세포는 잘 형성되고 돌출된 필로포디아 및 라멜리포디아와 액틴 세포골격 돌기의 비대칭 분극화를 포함하여 정상적인 이동 세포 형태를 나타냈습니다. 근원세포 이동에 대한 NCC 유래 Wnt5a의 파라크린 효과가 연구되었습니다.
Wnt5a에 대해 50 나노 몰 siRNA로 처리하면 음성 대조군에 비해 Wnt5a 유전자 발현이 64 % 감소했습니다. NCC에서 Wnt5a 녹다운 후 크게 감소된 C2C12 마일 블라스트의 이동과 외인성 재조합 Wnt5a의 추가는 이러한 근모세포에서 이러한 이동 결함 및 형태학적 결함을 구출했습니다. 파라 크린 모델에서 신호 수신 세포 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 ROR2 수용체를 녹다운하고 유전자 발현을 54 % 감소시켰다근세포에서 ROR2의 녹다운은 NCC의 존재에도 불구하고 이동 능력을 감소시킵니다.
외인성 재조합 Wnt5a는 ROR2 녹다운 후 근원세포 이동을 구출하지 못했으며, 이는 ROR2 고갈이 Wnt5a 신호를 수신하는 근원모세포의 능력을 방해함을 시사합니다. 배양 세포는 P10 팁으로 적절한 밀도로 스크래치를 한 번만 조립하고 조립되지 않은 공동 배양 시스템은 기본 세포를 방해하지 않고 조심스럽게 조립합니다. 이 기술은 신경 볏 세포 및 두 번째 심장 분야 생물학과 관련된 복잡한 Wnt/PCP 경로 내에서 특정 분자 신호 축을 연구하기 위한 개념 증명으로 사용되었습니다.
