We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

모든 동물 절차는 동물 보호의 로컬 가이드 라인에 따라 수행 하였다. 이 연구의 모든 세부 사항은 CECCAPP, 프랑스 윤리위원회에 의해 승인되었다. 훽스트 (Hoechst) 염료 유출 분석에 의한 측면 인구 (SP) 1. 선택 <ol><li> 훽스트 33342 염료로 5 천만 세포를 염색. <ol><li> 한 &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;라는 레이블이 붙은 튜브와 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;로 표시 한 두 개의 15 ml의에게 원뿔 바닥 멸균 튜브를 준비합니다. 멸균 5mm의 베라파밀 히드로 클로라이드 용액 10 ㎖를 준비한다. 줄기 세포 배양 배지 (CM)을 준비한다. <ol><li> 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) : F12 (1 : 3, V : V) 하이드로 코르티손의 소 태아 혈청, 5 % (FCS), 0.04 ㎎ / ℓ CSC (CM-CSC)에 대한 CM을 제조하기 위해, 다음과 결합 페니실린 100 U / ㎖, 0.1 g / L의 스트렙토 마이신, 및 표피 성장 인자 (EGFR) 20 μg의 / L. </li></ol></li><li> 층류 후드에서 세포를 Trypsinize. 의 세척, 용지를 제거terile 인산 완충 식염수 (PBS)와 75 cm² 플라스크에 대한 트립신 EDTA 1 ㎖ (0.5 g / L)를 추가합니다. 37 ° C에서 3 분을 품어. 부모 세포주 사용 배양액을 첨가하여 반응을 정지. 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 계산. <ol><li> 부모 세포주 (CM-P)에 대한 CM을 준비하려면 10 % FCS, 0.4 밀리그램 / 하이드로 코르티손의 L, 페니실린 100 U / ㎖ 및 0.1 g / 스트렙토 마이신의 L)와 DMEM을 보충합니다. </li></ol></li><li> CM-P 10 7 세포 / ml를 수득하는 단계 1.1.2에서 수득 된 세포 현탁액을 희석. 제조 된 2 튜브에 세포 현탁액을 분할 : 튜브 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;튜브 &quot;훽스트&quot;4 ㎖ (4 × 10 7 세포)에 100 μL (10 6 세포)를 넣습니다. </li><li> 샘플 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;에서, 5 mM의 베라파밀 염산염 용액 (최종 농도 0.5 mM)을 10 μL를 추가하고 부드럽게 혼합한다. (0.1 g / L의 최종 농도) 1g / L 훽스트 용액 5 μl를 추가합니다. 샘플 &amp; #에서(34) 훽스트는 &quot;1g의 5 μl를 추가 / L 훽스트 10 6 세포 당 용액 (200 μL 총) 이제부터, 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호 샘플을 유지.. </li><li> 1 시간 30 분 동안 37 ℃ 수욕에있는 모든 튜브 부화. 정착에서 세포를 방지하기 위해 부드럽게 매 15 분을 섞는다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거하고 1X PBS의 2 mL로 각각의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거합니다. PBS에 희석 재현 탁 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;5 ㎎ / ℓ 요오드화 프로피 듐 (PI) 500 μL의 펠릿을 완충액 5 밀리그램 / PBS 완충액에 희석 된 L PI 4 ㎖ 중의 &quot;훽스트&quot;펠릿. </li><li> 흐름 cytometer에 샘플 이해를 위해 튜브에서 하나의 셀 집계를 제거하고 수집하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플 솔루션을 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 나는셀 정렬에 의해 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 사이드 인구의 solation. <ol><li> 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 훽스트 부정적인 세포 분리를 수행 UV 레이저 (355 nm의), 블루 훽스트 (BP를 450/50)과 빨간색 훽스트 필터 (BP를 610/20)와 UV 레이저 경로 2 감지기, 2 집. <ol><li> 첫째, 염색 및 사이토 설정 흐름에 대한 긍정적 인 제어 역할을 샘플 &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;를 분석한다. </li><li> &quot;도트 플롯&quot;를 클릭, &quot;글로벌 워크 시트&quot;창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여 (다섯 번째 오른쪽 그림 상단)와 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, FSC-A (앞으로 분산)과 가로축에, SSC-A (측면 분산 형) (그림 1A)를 선택합니다. 같은 방식으로, SCC-H 도트 플롯 대 SSC-W를 만듭니다. 이 두 번째 도트 플롯에, P1 영역을 만들려면 &quot;다각형 게이트&quot;(열네번째 오른쪽 그림 상단) (그림 1B) (33)을 클릭합니다. 참고 : P1 영역이됩니다하나의 세포를 포함하고 이중선을 구별. </li><li> 옵션 : P1에 문 PI 대 FSC-A를 작성하여 PI를 양성 세포를 제외합니다. 이 점 플롯에서 PI 긍정적 인 죽은 세포를 제외 할 PI 부정적인 인구 (P2)을 선택합니다. </li><li> &quot;글로벌 워크 시트&quot;창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여, &quot;도트 플롯&quot;을 클릭하고 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, 블루 훽스트-A를 선택하고 가로축에, 빨간색 훽스트-A. 인구에 오른쪽 클릭으로 &quot;연락처보기 인구&quot;및 P1을 선택합니다. 이 점 플롯에서 영역 (P2) 세포의 주요 인구 (그림 1C)의 왼쪽에있는 사이드 암으로 나타나는 음의 Hoechst 염색 측면 인구 (SP) 셀을 선택하기를 만듭니다. </li></ol></li><li> 샘플 &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;를 분석하고 10,000 이벤트를 수집합니다. SP에 인구를 나타내는 게이트 P2가 잘 배치되었는지 확인하기 위해 샘플을 분석 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;(10,000 건)SP 인구 (그림 1D)의 실종을 관찰합니다. </li><li> 1.1.1.1 제조 CM-CSC 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 내의 SP 훽스트 염료 음성 세포를 수집한다. </li><li> 셀의 정렬이 끝나면, 원심 분리기에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을, 상등액을 제거하고 CM-CSC 1 mL로 펠렛을 재현 탁. 세포 계수기를 사용하여 정렬 된 셀의 수를 계산하고, 배양 플라스크에 세포의 적절한 수를 전송할 수있다 (표 1 참조). CM-CSC를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 품어. </li><li> 5 × 107 세포 (단계 3, &quot;세포 배양 방법&quot;참조)의 최소가 될 때까지이 통로의 최대 동일한 조건으로 배양 세포를 유지한다. </li></ol></li></ol> 측면 인구 조회 결과 순위에서 CD44 높은 / ALDH가 높은 하위 인구의 2 선택 <ol><li> ALDH 검출 키트 및 C와 SP 세포의 50 만 달러를 염색D44 항체. <ol><li> &quot;흠&quot;(튜브 A) &quot;CD44-APC&quot;(튜브 나) &quot;의 IgG1-APC&quot;(튜브 C), &quot;ALDH&quot;(튜브 라) &quot;ALDH 및 DEAB을 다음과 같이 일곱 15 ml의를 표시 멸균 튜브를 준비합니다 &quot;(튜브 전자),&quot;ALDH 및 CD44-APC &quot;(튜브 F),&quot;ALDH, DEAB 및 CD44-APC &quot;(튜브 g). 염색 동안 4 ° C에서 모든 튜브와 시약을 보관하십시오. </li><li> 4.5 (키트에 포함) 버퍼 1 mL 및 CD44-APC (알로 피코) 항체 (: 100 희석 1) 45 μL와 버퍼 A를 준비합니다. 버퍼 (1) 100 ㎕와의 IgG1-APC 항체의 1 μL (: 100 희석 1)와 버퍼 B를 준비합니다. 버퍼 (1)의 4 ml의 키트의 시약에 20 ㎕의 완충액 C를 준비한다. </li><li> 107 세포 / ml의 이전 정렬 세포 (단계 1.2.5)의 세포 현탁액을 준비한다. A, B 및 C, 및 튜브 F 4 ㎖ (4 × 107 세포)를 튜브 세포 현탁액 100 μL (10 106 세포)를 추가한다. 순간 튜브 D, E와 g에서 세포를 넣지 마십시오. </li><li> 5 분 동안 250 XG에 세포를 포함하는 튜브를 원심 분리기. diethylaminobenzaldehyde의 5 μL (DEAB), 튜브 전자와 g에 ALDH 억제제를 추가 상층 액을 제거하고 튜브 A, B 및 버퍼 (1) 100 ㎕에 C에서 펠렛을 재현 탁. <ol><li> 4 ml의 시약 C와 즉시 F 튜브를 Resuspend 세포는 튜브 D, E와 g에 100 μl를 전송합니다. 30 분 동안 37 ℃ 수욕에있는 모든 튜브 부화 알루미늄 박을 사용하여 직접 노광으로부터 보호한다. 침강 세포를 방지하기 위해 15 분 후 가볍게 볼 텍싱하여 세포 현탁액을 혼합한다. </li></ol></li><li> 이 순간부터, 얼음에 튜브를 유지하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 튜브가 뜨는을 제거합니다. </li><li> 4 mL 및 다른 관으로 버퍼 B. 100 ㎕와 버퍼 A. 재현 탁 관 C 100 ㎕와 b를 g 튜브에 재현 탁 튜브 F 1. 품어 10 분 4 °에서 버퍼의 100 μl를 추가;기음. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 튜브가 뜨는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 다시 1 버퍼 1 ㎖ (튜브 F 4 ㎖) 및 원심 분리기로 한번 씻어. 뜨는을 제거합니다. 다시 일시 중지 4 mL 및 버퍼 (1) 1 ㎖에있는 다른 모든 튜브 튜브 F 펠렛을. </li><li> 사이토 흐름에 샘플 이해에 대한 적절한 튜브 단일 세포 집계를 제거하고 수집하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플 솔루션을 전송합니다. </li></ol></li><li> 형광에 의한 CD44 고 / ALDH 높은 세포 인구의 격리 셀 정렬을 활성화. <ol><li> 수행 CD44 높은 / ALDH 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 정렬 높은 세포하십시오 FITC 필터 (30분의 530), 1과 블루 레이저 경로에 블루 레이저 (488 nm의)과 적색 레이저 (633 nm의), 1 검출기 APC에서 필터 (20분의 660), 2 집과 적색 레이저 경로 검출기. </li><li> 사이토 소프트웨어를 사용하여 점 플로 &quot;를 클릭t &quot;(다섯 번째 오른쪽 사진) 섹션 1.2.1.2에 기술 된 바와 같이, SSC-A 도트 플롯 대 FSC-A를 생성하는 세포 형태를 확인하고 SSC-H 대 SSC-W와 함께 단일 세포로 구성 인구를 선택 도트 플롯. </li><li> &quot;글로벌 워크 시트&quot;창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여, &quot;도트 플롯&quot;을 클릭하고 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, 이중 스테인드 인구를 선택하기 위해 APC-A 및 가로 좌표, FITC-A에를 선택합니다. ALDH 높은 세포 (그림 2A)을 선택 D와 E 튜브를 사용하여 게이트를 만듭니다. 참고 : 긍정적 인 세포 DEAB (그림 2B)로 처리 튜브 전자에서 사라집니다. <ol><li> 같은 차트에서 CD44 높은 세포 (그림 2C 및 2D)를 선택하기 위해 튜브 b와 c를 사용하여 제 2 게이트를 만들 수 있습니다. 양성 세포의 IgG1-APC를 포함하는 튜브에 사라진다. F와 G 튜브를 분석하고 CD44 높은 / ALDH을 &lt;포함하는 제 3 게이트를 만들SUP&gt; 높은 세포 (그림 2E 및 2 층). 주 : 양성 세포의 IgG1-APC (도 2d)를 포함하는 튜브에 존재하는 경우, 세포와 APC 염색 항체 사이의 상호 작용은 특정하지 않다. </li></ol></li><li> CM-CSC 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 높은 CD44 / ALDH에게 높은 세포를 수집한다. CM (19) 1 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브에 저 또한 CD44 저 / ALDH를 수집합니다. 참고 : 단계 1.1.1.1에 기술 된 바와 같이 CM-CSC를 준비합니다. </li><li> 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하고, CM-CSC 1 mL로 펠렛을 재현 탁. 정렬 된 셀의 수를 계산. </li></ol></li></ol> 3. 세포 배양 방법 <ol><li> 전술 한 바와 같이 셀의 두 분류 후에, 5 % CO 2, 37 ℃에서 CM-CSC와 적절한 배양 플라스크 (표 1)에 정렬 된 셀 플레이트. 18 ~ 24 시간 후,세포가 부착 된 경우 확인하고 배지를 변경합니다. 확대 식민지는 50 %의 합류보다 큰까지 3 일마다 배지를 변경합니다. </li><li> 문화 플라스크에서 세포를 Trypsinize하는 EDTA (표 1) - 트립신 0.5 g / L의 적절한 볼륨을 사용합니다. 37 ° C에서 세포에게 3-5 분을 품어. 트립신의 작용을 중지 CM-CSC (표 1)의 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 얻어진 세포와 판 CM-CSC와 175 cm² 문화 플라스크에 4 × 10 5 세포의 수를 계산합니다. 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. 이 농도에서 24 시간의 배가 시간이 세포는 7 일 70 % 합류 할 것이다. </li><li> 그들은 3 구절을 시행하기 전에 시험 관내 또는 생체 내 실험에서 암줄 기세포를 사용합니다. </li></ol> 종양의 가능성과 CSC 특성 4. 확인 <ol><li> 종양 구 형성은 CD44 높은 / ALDH의 종양 가능성을 확인하기 위해높은 세포. <ol><li> 3.2에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 5 분 동안 250 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 1 × 10 6 세포를 추가합니다. 뜨는을 제거하고 DMEM에서 펠렛 다시 일시 : F12 (3 : 1) rhEGF 처치의 매체 FCS 무료, 20 ng를 / ㎖, 헤파린 및 1 배 B27의 4 ㎎ / ℓ를. 37 ° C에서 6도 낮은 고정 플레이트 문화 플라스크에 세포를 품어 5 % CO 2. 주 : 사용을 DMEM : F12 (3 : 1) FCS의 5 %, 20 ng를 rhEGF 미 / ㎖, 4 밀리그램 / L 헤파린 및 1X B27 셀은 FCS없이 증가하지 않는 경우를 포함하는 매체. </li><li> (도 3a)를 파종 한 후 4 내지 10 일에서 광학 현미경으로 종양 형성 영역을 관찰한다. 참고 : 종양 구 직경이 35 개 이상의 μm의 수 있어야합니다. CD44 고 / ALDH 높은 세포는 CD44 저 / ALDH의 낮은에 비해 수와 크기면에서 더 빠르고 향상된 종양 구 형성을 표시합니다. </li></ol></li><li> 생체 내 종양 유발의 평가 후NOD-SCID 마우스에서 CD44 높은 / ALDH 높은 세포의 피하 주사. <ol><li> 정렬 후, 세 가지 농도 (104 세포 / ㎖, 105 세포 / ㎖, 10 6 세포 / ml)에서 PBS로 세포를 재 - 보류. 6 마우스의 우측 옆구리에 피하 영역 10 4 세포 / ㎖ (× 103 세포) 100 ㎕를 주입한다. 105 세포 / ㎖ (104 세포) 및 106 개 세포 / ㎖ (105 세포)를 위해 동일한 작업을 수행. 참고 : 10 3 세포를 테스트 할 수있는 것보다 낮은 희석. </li><li> 왼쪽 측면 지역에서 CD44 저 / ALDH 낮은 세포의 동일한 농도를 주입한다. 최대 10 주 동안 모니터 주입 된 마우스는 종양 진행 (19)을 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer.">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064 (2009).</li><li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes.">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subpopulation+of+CD133(+)+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy.">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li><li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met&#8314;+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis.">Head neck squamous cell carcinoma c-Met&#8314; cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li><li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas.">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li><li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis.">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells.">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li><li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+properties+of+CD44++cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li><li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44(+)ALDH1(+)+cells.">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li><li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase.">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li><li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).</li><li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line.">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li><li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li><li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer.">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li><li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2/Neu+transgenic+mice.">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li><li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts.">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 다른 HNSCC 세포주에 적용되는 특정 세포주에서 CSC 추가의 성공적인 분리를위한 신뢰성있는 방법을 설명한다. 격리 된 머리와 목 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스 (19)에 이식하여 체외 및 기능 검증에 더 분자 특성화 다음에 적합하다. 그러나 일부 수정 측면 인구 또는 부모 세포주에 존재하는 CD44 고 / ALDH 높은 비율에 따라 테스트 할 수 있습니?...

머리와 목 편평​​ 세포 암 (HNSCC)는 전 세계 공통의 악성 종양이며, 현재 치료의 발전에도 불구하고, 고급 질환 환자는 예후가있다. 환자의 전체 5 년 생존율은 수술, 화학 - 방사선 요법 - 및 대상을 포함한 치료 적 접근법의 조합에도 불구하고 약 30 %이다. 최근의 연구는 항암 치료 한 다음 암 줄기 같은 세포의 생존 (암줄 기세포)에 국소 재발과 원격 전이 때문이다. 유방, 뇌, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 간, 피부 2- 등 다양한 고형 종양 줄기 세포 특성 (미분화 상태,자가 재생과 분화 능력 및 텔로 머라 제 활성)을 제시 세포의 존재를지지 축적 증거가있다 10. 그러나, 암줄 기세포의 기원은 11, 12 불분명 남아 있습니다. 그들은 정상적인 줄기 세포 3,13 또는 dedifferen의 악성 변환으로 인해 발생할 수있는암줄 기세포와 같은 기능 14, 15를 취득 종양 세포의 tiation. 따라서 암줄 기세포에 관한 독특한 경로를 이해하는 것은 조기 진단과 저항 HNSCC의 치료에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 된 CSC는 종양 세포 16-19의 부피에 비해 종양의 재발을 초래 표준 화학 요법과 방사선 치료를 회피 내성 표현형을 갖고, 20 틈새 저산소에 지역화 된 것이 제안되어왔다. 다양한 요소 그러한 정지 성향 등 CSC 추가의 저항이, 강화 된 DNA 수리, 상향 조절 세포주기 제어 메커니즘 및 자유 라디칼 소거능 (21)을 설명하기 위해 제안되었다. 또한, 여러 가지 종양의 분자 경로 구체적 된 CSC (17)에서 활성화 될 수있다. 또한 대상-치료를위한 암줄 기세포의 지식을 개선하기 위해, 우리는 줄기 세포 관련 마커의 이질성에 때문에, 식별 및 암줄 기세포의 분리를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다암 (22)의 다양한 종류. HNSCC에서, 줄기 등을 종양 시작 세포와 같은 약물 유출 컨베이어 식 (23), CD44 높은, CD24 낮은 CD133 고, C-메트로 + 10, 24을 표현형으로 다른 CSC의 바이오 마커를 (발현하는 세포를 정렬하여 주 환자의 종양에서 고립 된, 25, 또는 ALDH 활성이 높은 26) 또는 CSC 속성이 squamospheres을 형성하는 주요 환자의 종양 양성. 그럼에도 squamospheres의 개수는 따라서 더 특성화 작은 샘플 크기 (27)을 연구주는 두 통로 후 급격히 감소한다. 따라서, 생체 외 분석이 잘 확립 된 세포주로부터 시작하는 CSC 추가의 기술을 개선하기 위해 실험을 설계하기 쉬운 해결책이다. 이 문서의 목적은 multiparametric 유세포 분석 A를 사용 HNSCC 세포주에서 암줄 기세포를 분리하는 방법을 제안하는 것이다차 셀 정렬. ALDH 활동 등 여러 암줄 기세포의 특성과의 상관 관계에서 CD44의 발현은, 사이드 인구 (SP) 표현형, 회전 타원체 형성 능력과 발암는 분리와 암줄 기세포의이 하위 집단의 특성을하는 데 사용됩니다. CD44, 세포 표면 당 단백질은 세포 부착 및 이동에 관여한다. CD44은 매우 머리와 목 암 모델 29-31에 포함 암줄 기세포 (28) 많은 고형 종양으로 표현된다. 또한, CD44 높은 세포는 10 수없는 생체 내에서 CD44 낮은 세포 반면, 이종 종양을 생성 할 수 있습니다. SP는 분석은 CSC 내에 과발현 막 수송 단백질의 ATP 결합 카세트 (ABC)를 통해 가정 훽스트 염료 22를 유출하는 세포의 미분 가능성에 기초한다. 이 분석은 대조 시료에서 베라파밀로 ABC 트랜스 포터 억제제의 사용을 포함한다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 마지막 ret 레티놀 변환에 관여하는 세포 내 효소초기 줄기 세포 분화 25, 26시 inoic 산. 높은 ALDH 활동 쇼 HNSCC (26)의 줄기와 같은 세포의 행동과 ALDH 높은 세포의 매우 적은 수를 나타내는 세포는 생체 내 26,32에 종양을 생성 할 수 있습니다. 이러한 마커 및 속성의 조합이 성공적으로 베르트랑 전자 t의 알에 의해 사용되었다. 시험관 내에서 광자하려면 다음 암줄 기세포의 생체 내 탄소 이온 방사선 (19)의 저항을 연구. 그들의 결과는 명확하게 다양한 세포 마커 및 속성의 조합이 단일 마커 방법보다 HNSCC 암줄 기세포 집단에 대한 유용한 연구를위한 더 선택적인 것으로 나타났다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Gold</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone water soluble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100 X</td>
			<td>Dominique Dutscher</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5021</td>
			<td>The solution must be prepared just before use because it is very unstable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>StemcellTM Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td>Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V-4629</td>
			<td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44-APC, human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-095-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1-APC, human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 coulter particle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ20B cell line</td>
			<td>Gift from the John Little&#8217;s Laboratory</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FaDu cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low anchorage plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>145383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software v8.0.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of a head and neck squamous cell carcinoma subpopulation having stem cell characteristics

두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 진행에 대한 이해의 진보에도 불구하고, 5 년 생존율 인해 국소 재발 및 원격 전이 낮은 유지된다. 이러한 재발을 설명하기위한 하나의 가설은 고유의 화학 치료 및 전파 저항을 제시 암 줄기 유사 세포 (CSC 추가)의 존재이다. 새로운 치료 전략을 개발하기 위하여, 표적 치료의 효과를 검증 실험 모델을 가지고 있으므로 된 CSC의 동정 및 분리를위한 신뢰성있는 방법이 필요하다. 이를 위해 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 수행되는 연속 된 두 셀 sortings (FACS)의 조합에 의존 HNSCC 인간 세포주에서 CSC 추가의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 첫 번째는 다른 사람의 사이에서 제외 따라서 카세트 (ABC) 트랜스 포터 단백질을 ATP가-바인딩 및 과발현하는 암줄 기세포의 특성을 기반으로, 같은 헥스 33342. 세포 같은 중요한 DNA 염료 번째로 정렬방법은 &quot;측면 인구&quot;(SP)로 식별됩니다. SP에 세포가 낮은 비율 부​​모 세포 (&lt;5 %)을 나타내는 바와 같이, 성장 단계는 제 2 셀 정렬 전에 수를 증가시키기 위해 필요하다. 다음 단계는 두 HNSCC 줄기 세포 특성은 세포 표면 마커 CD44 (고 CD44) 및 알데히드 탈수소 효소의 과발현 (ALDH 높음)의 높은 발현 수준을, 즉 보유 세포의 선택을 허용한다. 단일 마커의 사용 된 CSC, SP의 조합의 분리 수많은 제한 및 함정을 갖기 때문에, CD44 및 ALDH 마커는 생존 세포를 필요로 상기 분석 및 기능 분석을위한 된 CSC를 분리하는 유용한 도구를 제공 할 것이다. 암줄 기세포의 줄기 같은 특성은 마지막으로 tumorispheres의 형성과 β-catenin의 발현에 의해 시험 관내에서 확인되었다.

HNSCC 셀 라인에서 암줄 기세포의 분리 때문에 부모 세포주에서 암줄 기세포의 매우 낮은 비율의 두 개의 연속 정렬이 필요합니다. 첫 번째 분류는 약물 유출 수송에 의한 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 할 암줄 기세포의 능력에 근거했다. 이 분류 전체 세포 인구 (그림 1) 1-5 %를 인수 결과. 의 Hoechst 염색 부정적인 셀 정렬하는 동안, SSC-A 도트 플롯 (그림 1A)</s...

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Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

8.5K 조회수.  Université de Lyon. Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

비디오: Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection of E6/E7 mRNA by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) requires RNA extraction which destroys the tumor tissue context critical for morphological correlation and has been difficult to be adopted in routine clinical practice. Our recently developed RNA in situ hybridization technology, RNAscope, permits direct visualization of RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue with single molecule sensitivity and single cell resolution, which enables highly sensitive and specific in situ analysis of any RNA biomarker in routine clinical specimens. The RNAscope HPV assay was designed to detect the E6/E7 mRNA of seven high-risk HPV genotypes (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58) using a pool of genotype-specific probes. It has demonstrated excellent sensitivity and specificity against the current &#39;gold standard&#39; method of detecting E6/E7 mRNA by qRT-PCR. HPV status determined by RNAscope is strongly prognostic of clinical outcome in oropharyngeal cancer patients.

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

The presence of high-risk HPV in head and neck tumor tissue is associated with favorable outcomes. The recently developed RNA in situ hybridization technique called RNAscope allows direct visualization of HPV E6/E7 mRNA in FFPE tissue sections.

에 RNAscope<em&gt; 현장에서</em&gt; 헤드 전사적으로 활동 인간 Papillomavirus의 탐지와 목 편평​​ 상피 세포 암

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Discovering Middle Ear Anatomy by Transcanal Endoscopic Ear Surgery: A Dissection Manual

The middle ear is located in the center of the temporal bone and bears a highly complex anatomy. The recently introduced exclusively endoscopic transcanal approach to the middle ear is a minimally invasive technique sparing the bone and mucosa of the mastoid bone, since the middle ear is accessed through the external auditory canal. This emerging method has several advantages over the traditional (microscopic) approaches to the middle ear such as the panoramic wide-angle views of the anatomy, the possibility to approach and magnify tiny structures, and the possibility of looking around the corner using angled endoscopes.
The cadaveric dissection method presented here consists of an overview on the technical requirements and a precise description of a step-by-step protocol to discover the anatomy of the middle ear. Each step and anatomical structure is carefully described in order to provide a comprehensive guide to endoscopic ear anatomy. In our opinion, this is particularly important to any novice in endoscopic ear surgery as it provides thorough anatomical knowledge and may improve surgical skills.

The aim of this article is to describe the methodology of exclusively endoscopic cadaveric middle ear dissection. Moreover, we aim to provide a comprehensive guide to endoscopic middle ear anatomy.

Transcanal 내 시경 귀 수술에 의해 중간 귀 해부학 발견: 해 부 매뉴얼

The middle ear is located in the center of the temporal bone and bears a highly complex anatomy. The recently introduced exclusively endoscopic transcanal ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

돼지 머리와 목 Microvascular 재건을 위한 훈련 모듈

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

머리와 목 편평 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성