줄기 세포 격리는 현재 방법을 사용하여 전구 세포의 공동 격리로 인해 주요 과제로 남아 있습니다. 우리는 혼합 선조에서 정지 줄기 세포를 분리하기 위해 새로운 바이오 마커없는 분석기를 개발했습니다. 이 스페로이드 기반의 주요 장점, 라벨 보존 분석, 그것은 확장하고 CFSE 또는 파 레드 라벨을 사용하여 FACS에 의해 자신의 딸 전조에서 라이브 줄기 세포를 분리 할 수 있습니다.
종래의 치료법은 대부분의 전립선암세포를 근절하지만, 암줄기세포는 치료저항으로 인해 남아 있어 질병 진행을 유도한다. 줄기와 같은 세포 격리는 효과적인 질병 면제를 위한 치료적으로 공동 표적으로 할 수 있는 새로운 유전자의 확인을 허용할 것입니다. 우리의 라벨 보존 분석은 다양한 조직및 세포에서 정상적인 줄기 세포 격리에 적용, 암 줄기 세포 연구에 대한.
중요한 것은, 이 분석은 유방과 대장암과 같은 그밖 상피 세포 암에 적용됩니다. 먼저 100mm 배양 접시에 2밀리리터 2.5 마이크로그램 섬유네틴 용액을 코팅하고 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 흡습하고 문화 요리가 생물 안전 캐비닛에서 45 분 동안 건조하게하십시오.
전립선 상피 세포 성장 매체의 9 밀리리터를 섬유네틴 코팅 접시에 넣고 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터에서 따뜻하게 유지하십시오. 냉동 인간 전립선 상피 세포의 한 유리병을 섭씨 37도 의 수조에서 해동하고, 따뜻한 매체의 10 밀리리터에서 세포를 재중단. 5분 동안 500배 g의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
그런 다음 흡인하고 상체를 폐기하십시오. 따뜻한 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단하고 미리 데워진 배지로 섬유넥틴 코팅 된 접시에 서스펜션의 1 밀리리터를 직접 전달합니다. 그런 다음 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.
세포를 공동 표지하는 경우 텍스트 원고에 설명된 대로 10일 2D 배양에서 BrdU 표지된 세포를 준비합니다. 그런 다음 5개의 마이크로몰러 CFSE 또는 파 레드를 추가하고 30 분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후, 조심스럽게 염료로 매체를 흡인하고 따뜻한 PBS의 5 밀리리터로 세포를 두 번 세척.
다음으로, 원고 의 방향에 따라 05 %의 트립신 EDTA로 효소 소화를 수행합니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오. 세포는 3D 프스타스피어 형성을 위한 얼음감기, 일대일 지하 막 매트릭스 및 배양 배지 혼합물로 재장매되었다.
3D 지하 매트릭스 시스템에서 prostasphere 문화를 준비하기 위해, 지하실 막 매트릭스를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 해동하고 사용하기 전에 얼음에 보관하십시오. 그런 다음 얼음차가운 지하 막 매트릭스 1밀리리터를 얼음냉식 배지에 부드럽게 넣습니다. 파이펫을 위아래로 섞어 기포를 도입하지 않도록 주의하십시오.
500 마이크로리터의 총 부피에 대한 얼음 차가운 일대일 지하 막 매트릭스 및 배양 매체 믹스에서 5 회 10 ~ 1/4 인간의 전립선 상피 세포를 다시 중단합니다. 각 우물의 바닥 림에 대한 용액을 피펫하고 플레이트를 소용돌이어 혼합물을 균등하게 분배합니다. 플레이트를 섭씨 37도이산화탄소 인큐베이터에 30분간 배치하여 매트릭스가 고화되도록 합니다.
그런 다음 링을 방해하지 않도록 잘 당 따뜻한 배양 매체의 1 밀리리터로 덮습니다. CFSE 라벨이 부착된 프로스타스피어를 수확하기 위해 배지를 두 밀리리터디스파스와 파이펫으로 대체하여 여러 번 섞습니다. 37°C의 플레이트를 30분간 배양하여 매트릭스를 소화한 다음 15밀리리터 원심분리기 튜브로 구체 혼합물을 수집합니다.
5분 동안 500배 g의 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 따뜻한 05%트립신 EDTA의 500 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 5분간 섭씨 37도에서 구체를 배양한 다음, 10%의 FBS로 500마이크로리터의 따뜻한 PBS를 추가합니다.
26게이지 바늘로 1밀리리터 주사기를 통과하여 구체를 완전히 분리합니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리합니다. 그런 다음 흡인하고 상체를 폐기하십시오.
밀리리터 프로피듐 요오드당 1마이크로그램으로 따뜻한 배양 배지의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단하여 죽은 세포를 더럽히고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 원심분리를 반복하고 상체를 폐기한다. 그런 다음 따뜻한 매체의 1 밀리리터로 세포를 씻으시면 됩니다.
원심분리를 반복하고 상체를 폐기한다. 따뜻한 배양 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 35 미크론 모공 크기의 세포 스트레이너 스냅 캡을 통해 여과하여 5 밀리리터 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브에서 세포를 수집합니다. 트립신 분산 CFSE 라벨 프로스타스피어 세포의 FACS 분석을 수행합니다.
비표지 된 세포를 음성 제어로 사용하고 CFSE 표지 된 세포를 긍정적 인 제어로 사용하여 게이트를 설정하고 샘플을 실행하여 분획 된 CFSE 높음 및 CFSE 로우 셀의 하위 집단을 정렬하고 수집합니다. 1차 정상 인간 전립선상피세포는 섬유넥틴 코팅 배양기및 세포 성장으로 2D 배양에서 유지되었다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양으로 옮겨가면, 분화한 상피 세포는 천천히 밖으로 정지하고 단지 전립선 줄기 세포만 남아 있었습니다.
3D 배양에서 스페로이드 형성에 이어 2D 배양에서 전립선 상피 세포의 이중 라벨링은 동일한 라벨 유지 세포에서 BrdU, CFSE 및 Far Red의 지역화를 보였다. 이중 면역스테인닝세포는 세포종단백질 케라틴 14, 세포정결 단백질 E-cadherin 감소, 줄기세포 조기 마커 단백질 Wnt10b 및 ALDH1A1 증가, 자가단백질 LC3 증가, myosin IIB 증가 등을 나타냈다. 더욱이, 스페로이드 기반의 라벨 보존 분석체는 전립선암 편형에서 암 줄기와 같은 세포를 성공적으로 검출합니다.
CFSE 표지된 유지 줄기 유사 암세포 및 인간 전립선암 표본에서 유래한 스페로이드는 비표지된 전구 세포에 비해 감소된 E-cadherin 단백질을 나타냈다. 이 프로토콜을 시도할 때 배양 배지 준비를 위해 매트릭스를 액체 형태로 유지하는 것이 중요합니다. 하룻밤 동안 4도에 보관하고, 분배 매트릭스 전에 얼음 차가운 PBS에 파이펫 팁을 냉각.
스페로이드 계 라벨 보존 분석을 이용하여 줄기 세포의 격리에 이어, 단세포 RNA 염기서열 분석은 줄기 세포에서 특정 유전자 및 새로운 바이오마커를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 스페로이드 계 라벨 보존 분석체에 의한 살아있는 암 줄기 세포의 격리는 연구원이 시험관내에서 암 줄기 세포 유래 종양을 성장시키고 새로운 항암제를 선별하는 것을 가능하게 합니다.
