This work was supported by National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) and National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

모든 동물의 절차는 스크립스 연구소의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 보건 및 승인 된 프로토콜에 따라 국립 연구소에 의해 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행 하였다. 1. 렌즈 해부 <ol><li> 건강 &quot;실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드&quot;의 국립 연구소 및 승인 기관 동물 사용 프로토콜의 권장 사항에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 곡선 집게를 사용하여 마우스의 눈을 명백히하다. 소켓에서 눈을 가지고, 다음 집게로 소켓에서 눈을 뽑은 포셉과 눈 주위의 조직을 우울. 해부 접시에 신선한 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)에 눈을 전송합니다. </li><li> 가능한 안구에 가까운 시신경을 잘라. 조심스럽게 조심스럽게 구멍 wher을 통해 안구에 잘 직선 핀셋을 삽입전자 시신경은 후방을 종료합니다. </li><li> 조심스럽게 각막의 가장자리에 후방에서 안구에 가위로 절개를합니다. 설치류 렌즈는 눈의 ~ 30 %를 차지한다. 주의 깊게 절개를 확인하고 렌즈 손상을 방지하기 위해 너무 깊은 눈에 핀셋이나 가위를 삽입하지 않습니다. </li><li> 안구 주위에 적어도 절반 방법의 각막과 공막 사이의 접합을 따라 잘라. </li><li> 부드럽게 단계 1.4 및 1.5에서 만든 개구를 통해 안구로부터 렌즈를 제거하기 위해 각막에 누른다. </li><li> 주의 깊게 여전히 렌즈에 부착되어있는 큰 이물질을 제거하기 위해 좋은 팁 직선의 집게를 사용합니다. 시각적으로 강성 측정을 진행하기 전에 손상은 렌즈를 검사합니다. </li></ol> 2. 강성 측정 <ol><li> 분석 용 저울을 사용하여 동일한 박스에서 적어도 10 커버 슬립을 단다. 커버 슬립의 평균 무게를 찾을 수 있습니다. 일관성을 위해 모든 실험 된 커버와 동일한 상자를 사용합니다. 사전 젖은실험을 시작하기 전에 적어도 2 시간 동안 실온에서 1X PBS에서 커버 슬립 및 직각 미러. </li><li> 1X PBS 75 mL로 - 측정 챔버를 채우기 (65) (도 1 참조). 측정 챔버는 사내 기계 공장으로 플렉시 유리로 만든 후, 챔버 내의 디 보트는 적절한 드릴 비트와 함께 원하는 깊이로 설정 드릴 프레스에 의해 만들어졌다. 렌즈 기계적 시험 기간 동안 실온에서 1X PBS 투명 남아있다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> 그림 1 :. 강성 측정 상공 회의소 다른 깊이와 모양의 디 보트의 다양한 사용자 정의 만든 강성 측정 챔버의 크기를 보여주는 사진입니다. 200 μm의 300 μm의 깊이 (노란색 화살촉) 인 라운드 디 보트는 마우스 렌즈의 측정에 사용된다. 디 보트는 2 직경 mm 및 ~ 13입니다-. 챔버의 가장자리에서 14mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 렌즈를 보유하는 데 사용되는 잔디에서 일정한 거리에있는 실에 직각 거울을 배치합니다. 거울은 실험 기간 동안 이동하지 않습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 신중하게 장악 겸자 또는 곡선 집게로 측정 챔버로 전송 해부 렌즈. </li><li> 직접 오버 헤드 무부하 렌즈의 상위 뷰 사진을 촬영합니다. 현미경 (아래)와 좌우의 광섬유 광원 해부에서 조명으로 30X 배율로 마우스 렌즈 사진을 찍어. 최대 광 강도의 80 %로 광섬유 전원 공급 장치를 설정한다. 필요에 따라 주변 조명, 사용자 선호도 및 화질에 기초하여 상기 전원 공급 장치의 출력을 조정한다. </li><li> 로타리를 통해 알 수있는 무부하 렌즈의 측면도 픽쳐를 취할GHT 각도 거울. 카메라가 보정되지 않은 경우 초점 미러 에지의 사진을 촬영. 거울 가장자리 5 mm 길이, 그리고이 측정 이후의 화소 / mm를 결정하고 이미지의 스케일 바의 역할을하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 장소 상기 잔디에 렌즈와 렌즈가 잔디에 안전하고 바로 장착되어 있는지 확인합니다. 로드하기 전에 렌즈의 사진을 촬영합니다. 렌즈는 전방 또는 후방 극의 잔디에서 휴식해야한다. </li><li> 렌즈에 부드럽게 한 커버 슬립을 놓습니다. 크리프를 허용하는 2 분을 기다린로드 렌즈의 또 다른 사이드 뷰 사진을 촬영합니다. </li><li> 단계 2.8로 된 커버를 추가하고 10 커버 슬립의 총이 적용될 때까지 단계 2.8에서와 같이 각 커버 슬립을 첨가 한 후 사이드 뷰 사진 촬영을 계속. </li><li> 모든 커버 슬립을 제거합니다. 2 분을 기다린 모든 된 커버를 제거한 후 렌즈 (내부와 외부 잔디의)의 사이드 뷰 사진을 촬영합니다. </li></ol> 3. 렌즈 핵 측정 <ol><li> determ하려면렌즈 핵의 크기 이네, 1X PBS로 가득 깨끗한 페트리 접시에 렌즈를 이동합니다. </li><li> 부드럽게 잘 직선 집게를 사용하여 렌즈를 디 캡슐. </li><li> 슬라 오프 장갑을 낀 손가락으로 렌즈를 압연에 의한 대뇌 피질의 섬유 세포. 나머지 렌즈 핵 하드 대리석처럼 느낄 것이다. 세 1 개월부터 성인 렌즈의 핵을 분리하려면이 절차를 사용하십시오. 고립 핵 강체이기 때문에, 렌즈 핵의 상기 기계적 시험이 설명 된 방법을 사용하여 수행 될 수 없다. </li><li> 조심스럽게 페트리 접시에 1X PBS의 렌즈 핵을 씻어. </li><li> 다시 측정 챔버 (안 잔디에서)에 렌즈 핵을 배치하고 오른쪽 각도 거울을 통해 렌즈 핵의 이미지를 촬영. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> 그림 2 :. 전의 Coverslips는에 의해 압축 된 마우스 렌즈 (A) 도식과 (B) 사진1X PBS로 가득 측정 챔버에서 200 μm의 깊은 잔디에 2 개월 된 마우스 렌즈를 보여주는 perimental 설정. 직각 미러 및 해부 현미경에 장착 된 디지털 카메라에 의해 압축 된 커버하는 동안 렌즈의 이미지를 수집 하였다. (C)를 순차 커버 슬립의 수를 증가시킴으로써 압축 2 개월 야생형 렌즈 시상 뷰 사진 축 적도 직경을 측정하고, 커버 슬립 기반 압축 테스트 중에 축 적도 변형 계산을위한 미가공 데이터를 제공했다. 렌즈의 반사는 때로 커버 슬립 (가장 눈에 잘 한 커버 슬립 이미지)에서 볼 수있다. 측정을 할 때의 반사를 무시하고, 렌즈의 정점까지 측정한다. (D) 상기 2 개월 야생형 렌즈 압축 후의 상기 절연 렌즈 핵의 시상 뷰 사진. 포스트 압축 렌즈와 격리 된 핵은 잔디 외부에 앉아있다. 스케일 바, 1mm. 이 수치는 Gokh에서 수정, 등. PLoS의 하나 2012 년 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 4. 이미지 분석 <ol><li> 로딩 전에 ImageJ에 또는 유사한 소프트웨어를 이용하여 각각의 적재 단계 후 렌즈 적도 및 축 지름을 측정한다. 각 렌즈 핵의 직경을 측정한다. 어떤 방향에서 측정 19, 21을 충분하므로 렌즈 핵은 거의 구형이다. </li><li> 사용 된 잔디의 깊이를 첨가하여 직경 축 렌즈를 수정한다. 측정 챔버에서 디봇은 렌즈의 축 방향 두께가 200㎛ 인 (2 개월 된 마우스 렌즈) 또는 300 ㎛의 (4 개월, 8 개월 된 마우스 렌즈)을 가려. </li><li> , ε = (D - D 0) 식을 이용하여 렌즈 직경 측정으로부터 축 적도 균주 계산 ε 스트레인 인 / D 0, D는 수직 또는 E이고quatorial 주어진 부하에서 직경 및 D 0 제로 부하에 대응하는 수직 또는 수평 직경입니다. </li><li> (밀리그램)에 부과 된 하중의 함수와 축과 적도 균주를 플롯. </li><li> 축, 적도 핵 직경을 플롯. 계산하고 적도 지름 축 직경 나누어 렌즈 종횡비 플롯. </li><li> 계산 방정식을 사용하여 렌즈 볼륨 플롯 부피 = R의 E는 적도 반경 R A는 단계 2.6에서 찍은 사진으로부터 측정 축 반경이다 4/3 × π × R E × 2 (R) A,. 이 방정식은 렌즈가 편원의 회전 타원체 (타원체) 1,22 가정합니다. </li><li> 계산 단계 3.5에서 찍은 사진에서 측정 된 R N 렌즈 핵의 반경 (R)의 N 3 × 식 체적 = 4/3 × π의 핵을 사용하여 부피를 플롯. 이 방정식은, 렌즈 핵 제가 가정SA 구 19, 21. </li><li> 계산 렌즈 볼륨 핵 부피의 비로 핵 분획을 플롯. </li></ol>

<ol>
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저자는 공개 아무것도 없어.

렌즈의 강도를 측정하는이 방법을 사용할 때 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 챔버 (θ)의 저부에 대하여 - (8.5 ° 8) 우선, 커버 슬립 약간 비스듬한 각도로 렌즈에 적용된다. 이 적도에 축보다는 오히려 부하의 매우 작은 구성 요소를 적용한다. 그러나이 적도 부하가 죄 θ ≈ 0.1 (19) 때문에 무시할 간주됩니다. 이 방법은 큰 렌즈에 적합한 경우, 상기 챔버의 하부에 커버 슬립 각도 적도 부하 응력의 계산에 고려되어야하는지 결정하기 위해 측정 될 필요가있다. 둘째, 렌즈 커버 슬립 각 첨가 후 평형을 허용하는 것이 중요하다. 이분의 대기 기간은 시간에 따라 변형이 가능 (예., 크리프)는 렌즈 평형 형상 (19)에있을 때 화상만을 촬영되도록 일어나기. 셋째,이 프로토콜은 m에 압축 변형을 측정하기에 최적화되어 있습니다부하의 넓은 동적 범위에 걸쳐 렌즈를 여러개. 파일럿 연구에서, 1293 mg의 (즉 10 18 X 18mm의 커버 슬립)의 하중은 넘어 부하가 감지 더 변형을 일으키지 않는 증가, 최대 변형 마우스 렌즈를 압축. 이 압축하에 19 상당히 변형하지 않는 강성 렌즈 핵의 존재에 기인한다. 넷째,이 프로토콜은 돌이킬 수없는 조직의 손상을 방지 할 수 있습니다. 이전에 게시 된 실험에서 마우스 렌즈의 기계적 특성에 대한 변경 사항은이 방법은 렌즈 (19)에 손상을주지 않는 것을 제안, 반복 하중에 관찰되지 않았다. 제 1 및 제 2의 변형 하중 곡선, 렌즈 직경 및 렌즈 볼륨 2.10 비교 - 기계적 종 또는 돌연변이 렌즈의 렌즈를 테스트 할 때, 파일럿 테스트 단계 280를 반복함으로써 최대 변형에 필요한 최대 하중을 결정하기 위해 이루어져야 로드. 마지막으로,이 방법은 강성 오의 경험적 측정을 제공합니다<html> 전체 렌즈 (F) 및 다른 세포 유형의 기부 (상피 세포, 섬유 피질 핵 섬유) 및 전체 렌즈의 기계적 성질을 수정체 낭을 구별 할 수 없습니다. 축 방향과 적도 균주가 부과되는 부하의 함수로 여기 플롯됩니다. 이전 연구는 마우스 렌즈 강성 19, 21, 탄력성 (21) 또는인가 된 부하에 따라 직경 (18)의 변화를 정량화했다. 변형은 다양한 크기의 렌즈 사이의 직접적인 비교를 허용하는 무 차원 양이다. 그 적도 확장 (양의 변형)로 인해 렌즈 볼륨 (즉, 포아송 효과)의 보존에 부하 축 방향 압축 (음 주)와 동시에 발생합니다. 그러나, 관측 된 적도 균주 축 변형에 비해이 방법은 적도 변형의 작은 변화를 감지 할 해상도를 나타내는, 축 균주보다 절대 크기가 훨씬 작했다. 마우스 렌즈는 없지만 요약 NT는 &quot;&gt;, 마우스 렌즈 강성을 측정하는 쉽게 조립 장치에이 간단한 방법은. 더 나은 렌즈 강성에 미치는 영향 돌연변이 단백질, 병리 및 / 또는 노화 이해하는 렌즈 연구에서 일반적으로 널리 적용 할 수있다 이 방법은 여전히​​ 증가 렌즈 강성에 기여하는 단백질과 연령 관련 수정 사항을 명료하게 할 수 있습니다, 수용, 그리고 잠재적으로 노안에 대한 새로운 치료법 개발에 새로운 지식을 기여한다.

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner2. Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus1. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses. 
Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression12-14, actuator compression15, probe indentation16, dynamic mechanical analysis 6,10 and bubble-based acoustic radiation force17. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness. 
This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Fine tip straight forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-40</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microdissection scissors, straight edge</td>
			<td style="width:139px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Scientific Tools</td>
			<td style="width:119px;">11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seizing forceps</td>
			<td style="width:139px;">Hammacher</td>
			<td style="width:119px;">HSC 702-93</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection dish</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12565154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm petri dish</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18mm x 18mm glass coverslips</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Measurement chamber with divots to hold lenses</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom-made (see Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Right-angle mirror</td>
			<td style="width:139px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">45-591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light source</td>
			<td style="width:139px;">Schott/Fostec</td>
			<td style="width:119px;">8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illuminated dissecting microscope</td>
			<td style="width:139px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZX-ILLD100</td>
			<td>With SZ-PT phototube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital camera</td>
			<td style="width:139px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Coolpix 990</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses

눈 렌즈는 굴절 및 망막에 선명한 화상을 형성하는 광을 집중 투명 기관이다. 인간, 모양체 근육 계약은 가까운 물체에 초점 렌즈 &#39;광 파워, 숙박 시설로 알려진 공정의 증가로 이어지는, 렌즈를 변형합니다. 렌즈 강성 연령 관련 변경 사항이 노안에 연결되었습니다 확장하여 수용 할 수있는 렌즈의 능력 감소하고, 안경을 독서의 필요성. 마우스 렌즈 수용 노안을 개발하지 않더라도, 마우스 모델 이해 렌즈 병리위한 귀중한 유전 적 수단을 제공 할 수 있으며, 마우스에서 관찰 된 가속 열화 렌즈의 연령과 관련된 변화에 대한 연구를 가능하게한다. 이 프로토콜은, 마우스 렌즈 강도를 결정 순차적으로 적용되는 렌즈에 압축 하중을 증가시키는 커버 글라스를 사용하는 단순하고 정확하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 대표적인 데이터는 마우스 렌즈처럼 나이가 엄격한되고 있는지 확인인간의 렌즈. 이 방법은 높은 재현성과 잠재적으로 더 큰 동물 시험 렌즈를 기계적으로까지 확장 할 수 있습니다.

강성 및 2-, 4-, 8 개월 된 마우스 렌즈의 크기를 측정 하였다. 마우스는 TSRI 동물 사육 시설에서 얻은 순수한 C57BL6 변형 배경 모두 야생형 동물이었고, 각각의 렌즈는 1~10 커버 슬립 적재 하였다. 축 적도 균주 각 커버 슬립을 첨가 한 후, 렌즈의 축 적도 직경을 측정 한 다음 해당 언로드 직경 직경 각 변화를 정규화하여 하중의 함수로서 계산 하였다. 각 세부터 여덟 렌즈를 테스트 한 결과는 평균 ± 표준 오차로서 표현된다. 이전 19에 도시 된 바와 같이, 축 방향 변형 하중 (도 3a)의 대수 함수이다. 최대 하중 (그림 3)에서 축 방향 및 적도 균주에서 통계적으로 유의 한 연령에 따라 감소는 마우스 렌즈 나이 경직을 나타냅니다 있었다. 성작은 표준 오차에 의해 입증 된 바와 같이 비 측정은 같은 나이의 렌즈를 통해 높은 재현성했다. 이 실험에서 수집 된 영상 데이터는 여러 가지 다른 렌즈 형태 학적 특성 (도 4)를 결정하는데 사용되었다. 나이 (그림 4A, 4B와 4D) 증가 예상, 축 방향 및 적도 직경 및 렌즈 볼륨으로. 종횡비는 렌즈 축 직경보다 약간 큰 직경을 갖는다 적도 것을 나타내고,이 파라미터는 나이 (도 4C)으로 변화하지 않았다. 렌즈 핵의 직경 및 체적 분율은 연령 (도 4E, 4F 및 4G) 증가 하였다. 이 결과, 렌즈 핵 렌즈 연령으로 상대적으로 크기가 증가하는, 개조 제안. 이 데이터는 마우스 렌즈가 변화에 나이와 비슷한 강성 증가 보여인간의 렌즈 9,15을 카. 이러한 데이터는 또한 동일한 방법을 사용하여 제조 18 이전의 관찰 결과와 마우스 렌즈 나이 강성 증가 루앙 광학 현미경 (23)에 의해 동의한다. 두 개의 다른 연구가 tropomodulin-1을 표시하도록 한 방법을 사용하고, 액틴 단백질, CP49하는 골치 아픈 중간 필라멘트 단백질을 상한 엔드를 지적하고, 아쿠아 포린 0 렌즈 (19, 20)을 강성을 유지하기 위해 필요하다. 이 방법으로, 렌즈의 병리 및 마우스의 가속 노화 마우스 모델의 과다 유전 변이 및 / 또는 노화에 의한 렌즈 강성도 변화를 이해하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 다른 종으로부터의 렌즈 구성 될 수있다. 이 실험에 사용 된 챔버의 크기는 마우스 렌즈에 대해 최적화되지만, 용이하게 큰 종으로부터 렌즈까지 확장 할 수있다. 향후,이 렌즈의 크기가 종에 걸쳐 렌즈 강성에 따라 확장 여부를 결정 흥미로운 일이 될 것이다. <p class="jove_content" f오 : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 가장 낮은 부하 (1 커버 슬립, 129.3 mg)을에서, 2-, 4-, 8 개월 된 렌즈 사이의 축 방향 및 적도 균주에서 명백한 차이가 없었다. 나이 렌즈 강성의 증가는 높은 부하에서 더 분명 해졌다. 먼저 coverslip에 의해 압축 렌즈 (~ 100 μm의)의 가장 바깥 쪽 피질 나이와 강성의 변화, 또는이 메소드는 낮은 부하에서 변형의 작은 변화를 구별 할 수없는 것을하지 않는 것이 가능하다. morphometrics 데이터는 전체 렌즈 핵 볼륨 모두 증가 연령의 함수로서 증가 된 렌즈의 강도와 상관 관계가 있음을 나타낸다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig3.jpg" /> 그림 3 :. 2-, 4-, 8 개월 (2M, 4M 및 8M) 야생 형 마우스 렌즈에 대한 축 방향 적도 스트레인 부하 곡선은 (A) 축 방향은 압축 변형 (부하 하중의 함수로 꾸몄다 mg)을 얻었다. (B) 적도 완ressive 변형은 하중 (mg)의​​ 함수로 꾸몄다. 네살 8 개월 된 렌즈는 나이와 렌즈 강성의 증가를 나타내는 등가 최대 부하에서 2 개월 된 렌즈보다 긴장을 나타냈다. **, P &lt;0.01. Y 축이 (A)와 (B) 사이에 다릅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig4.jpg" /> 그림 4 :. 2-, 4-, 8 개월 (2M, 4M 및 8M) 야생 형 마우스 렌즈의 형태 학적 특성 (A) 축 직경 (B) 적도 직경이 점진적으로 나이가 증가한다. 렌즈의 종횡비 (C)의 마우스 렌즈는 렌즈 적도 약간 넓은 것을 보여준다. 렌즈 량 (D), 핵 직경 (E), 핵 음량 (F)과 핵 분획 (G) 점진적 연령 증가한다. ** P &lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

마우스 렌즈의 압축 강성을 평가하는 유리 Coverslips는 순차적으로 응용 프로그램 : 스트레인과 형태 학적 분석

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

sequential-application-glass-coverslips-to-assess-compressive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K 조회수.  The Scripps Research Institute. Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

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Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

연구

생물학

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

형태학 및 Murine 악의 관절 돌기 세포 분석 방법

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...