Name: spatial measurements of perfusion, interstitial fluid pressure and liposomes accumulation in solid tumors
Uploaded: 2016-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors at JoVE.com

The authors would like to thank Dr. Javed Mahmood for assistance with culturing MDA-MB-231 cells and implanting the MDA-MB-231 xenografts, Linyu Fan for preparing the CT-liposomes. Shawn Stapleton is grateful for funding from the Natural Sciences and Engineering Research Postgraduate Scholarships Program and the Terry Fox Foundation Strategic Initiative for Excellence in Radiation Research for the 21st Century (EIRR21) at CIHR. This study was supported by grants from the Terry Fox New Frontiers Program (020005) and the Canadian Institutes of Health Research (102569).

모든 생체 실험은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 1. 동물 모델 <ol><li> 함께 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신을 100 배 희석 DMEM에 5 × 106 개 MDA-MB-231 7 유방 선암종 종양 세포와 배양. </li><li> 수확 된 세포들은 0.05 % 트립신 EDTA 용액을 이용하여 80 %의 컨 플루 언트 할 ​​때. 3 ~ 5 분 후 DMEM의 3 배 부피의 트립신 EDTA를 중화. 세포의 15 μL 나누어지는을 가지고 혈구를 사용하여 계산합니다. 200 XG에서 5 분간 원심 분리로 펠렛 세포는 ml 당 10 × 106 세포의 농도로 HBS 재 정지. </li><li> 임플란트 피하 (SC) 각각 8 내지 12 주령의 암컷 SCID 마우스의 뒷다리에 1 × 106 (2) 세포 주입함으로써 종양 (N = 5). 주입을위한 표준 25 G 바늘을 사용합니다. </li><li> 모니터 t사우스 캐롤라이나 종양 볼륨&gt; 200mm 3 (약 7 ~ 9 일)에 도달하면 umor 성장하여 캘리퍼 (볼륨 = 0.5 ×의 길이 x 너비 2)는 측정을 시작합니다. </li></ol> 2. CT-리포좀의 제조 및 특성 <ol><li> 리포좀의 제조 <ol><li> 1,2- 디 팔미 토일 - SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DPPC), 콜레스테롤 (CH) 및 1,2- 디스 테아 SN 글리세로 -3- 포함 CT-지질 리포좀에 대한 성분 (200 밀리몰 / L)에 용해시키고 40 : 5 DPPC : CH : PEG2000-DSPE 55의 몰비로 70 ℃에서 무수 에탄올 -phosphoethanolamine-N - 폴리 (에틸렌 글리콜) 2000 (PEG2000-DSPE). </li><li> 70 ° C로 가열 유지하여 에탄올을 증발시키고, 그 용액에 CT 조영제 iohexol (요오드 300 ㎎ / ㎖)을 추가하도록 최종 지질 농도는 100 mm이다. </li><li> 자주 텍싱 4 시간 동안 70 ° C에서 솔루션을 유지합니다. </li><li> 샘플 5 팀을 돌출, 단일 층 소포를 얻으려면두 ES 내지 250 psi의 압력에서 200 nm의 기공 크기 막을 적층하고, 10 ㎖ 지질 압출기를 사용하여 400 psi에서 두 개의 적층 된 80 nm의 기공 크기는 막을 통해 5 회 다시 돌출. 각 압출 사이클의 처음에 압출기에 리포좀 10 ㎖를 피펫 각 압출 사이클 후의 멸균 튜브 또는 원추형 유리 바이알로 모은다. </li><li> 100 kDa의 분자량이 0.02 mM의 HEPES 완충 생리 식염수 (HBS, 산도 7.4)의 250 배 용량 초과에 대한 (MWC) 투석 가방을 잘라 사용하여 투석을 16 시간으로 취소 캡슐화 iohexol를 제거합니다. 예를 들어, 커에 백 바깥 HBS 250ml를 투석 백에 리포좀 용액 1 ㎖를 배치했다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 75 nomical MWC 상업적 접선 흐름 방식을 이용한 CT-리포좀을 농축시킨다. 약 55 밀리그램 ml의 최종 농도 요오드 농축 -1. </li></ol></li><li> 리포좀 특성 <ol><li> ioxehol을 해제 한 다음 탈 이온수 100 배 체적 과량을 사용하여 희석 된 에탄올의 10 배 부피 초과 량을 사용하는 CT-리포좀 파열에 의해 밀봉 효율을 측정한다 (리포좀 즉, 10 ㎕의 100 에탄올 μL 후 희석을 이용하여 파열 10 ㎖의 최종 부피). </li><li> 245 nm의 파장에서 검출와 UV 분광계를 이용하여 농도를 결정 iohexol. 제의 양을 방출 iohexol 제의 비율 량을 고려하여 캡슐화 효율 계산은 제조시 첨가. </li><li> 제조자의 지시에 따라 동적 광산란 입도 분석기 시스템을 이용한 유체 역학적 직경 제타 전위를 측정한다. 측정을 용이하게하기 위해 탈 이온수 (최종 부피 1 ㎖의 리포솜 예 5 μL) 200X하여 CT-리포좀 용액을 희석. </li></ol></li></ol> 종양 미세과 CT-리포좀 3. CT 영상분포 참고 : 다른 소프트웨어 버전 또는 장비를 사용하는 경우 체적 검사를 수행하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오. <ol><li> 의료 공기 또는 산소와 혼합 2 % 이소 플루 란을 사용하여 각 마우스를 마취하고 발가락을 곤란하게하고 어떤 반응을 관찰하지에 의해 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 얇은 플라스틱 판에 발 테이핑하여 엎드린 자세 동물 고정시킨다. </li><li> 측면 꼬리 정맥에, PE10 튜브에 20cm에 연결된 사용자 지정 27 G 카테터를 삽입하고 테이프의 여러 조각 제자리에 고정합니다. </li><li> 중부 표준시 - 리포좀의 최소 200 μl를 포함하는 1 ML의 주사기를 준비합니다. 카테터를 세척 할 때 사용하는 식염수로 1 ML의 주사기를 준비합니다. (부피비 9 : 1) 마지막으로, 식염수와 혼합 자유 iohexol 적어도 150 μL와 함께 1 ml의 주사기를 준비한다. </li><li> 마이크로 CT 스캐너 침대에 발생하기 쉬운 마우스를 놓습니다. tumo을 배치 레이저 측위 시스템을 사용하여각 스캔에 대한 거의 같은 방향으로 연구. </li><li> 주사기 펌프에서 CT-리포좀 주사기를 놓고 주사기에 카테터를 연결합니다. 초 당 10 μL의 펌프 속도를 설정합니다. </li><li> CT 스캐너 콘솔 소프트웨어를 이용하여 명암 조정 스캔을 수행하여 시스템을 초기화한다. 관심의 각 영상 프로토콜에 대한 명암 스캔 옵션을 선택 드롭 다운 메뉴에서 명암을 선택하고 교정을 시작하려면 스캔 버튼을 누릅니다. </li><li> 어떤 조영제 주입하기 전에 종양 체적 해부학 마이크로 CT를 수행한다. 연동 장치가 해제 된 CT 스캐너의 안전을 보장하기 위해 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어 표시 봐. 중부 표준시 스캐너 콘솔 선택 검사에서 80 kV의 70 mA의 관 전류의 X 선 에너지를 선택하고 시간이 16 초 이상 1,000 이미지 전망을 캡처합니다. 스캔을 시작하려면 스캔 버튼을 누릅니다. </li><li> 400 mg의 요오드 kg의 농도로 CT-리포좀 루스를 주입하기 위해 주사기 펌프를 사용하여-1. 약 150 μL (25 g을 마우스를 가정)의 볼륨을 주입하는 펌프를 설정합니다. 주입하는 펌프의 &#39;시작&#39;버튼을 누릅니다. 수동 주입 전체 에이전트 양을 보장하기 위해 (두 카테터의 체적)의 생리 식염수를 50 μL로 카테터를 플러싱 카테터 분명하다. </li><li> CT-리포좀의 주입 후 10 분을 기다린 후 3.5에 설명 된 것과 동일한 방법 및 설정을 사용하여 두 번째 해부 검사를 수행합니다. </li><li> 3.3에서 설명 된 것과 동일한 주입 속도 설정을 사용하여 (부피비 9 : 1) 식염수와 혼합 자유 iohexol 100 ㎕의 부피를 주입 주사기 펌프를 설정하여 DCE-CT 스캔을 수행. <ol><li> CT 스캐너 콘솔 획득 매 10 초에서 80 kV로, 90mA의 튜브 에너지의 X 선 에너지 설정을 사용하며, 처음 30 초 동안 416 화상 돌기 매 초를 캡처하고 그 다음 5 분 동적 주사를 선택할 . DCE-CT 데이터를 5 초를 캡처 한 다음 injectio에 시작 버튼을 누릅니다n 개의 펌프. </li><li> 는 DCE-CT 검사 후 체적 해부학 마이크로 CT 스캔을 수행합니다. </li></ol></li><li> 단계 3.5에 기재된 바와 같이 동일한 체적 CT 설정을 사용하여 CT-리포좀 48, 72 시간 포스트 분사 사이의 해부학 CT 영상 캡처. </li><li> GPU가 재건​​축 소프트웨어를 사용하여 해부 CT 및 DCE-CT 데이터를 재구성. <ol><li> 재건 소프트웨어로 이미지를로드합니다. 관심 영역을 선택 마우스를 사용하여 이미지를 통해 투자 수익 (ROI)을 그려 재구성한다. 재구성 된 군데의 저장 위치와 파일 이름을 설정하고 &#39;.MAT&#39;로 출력 파일 형식을 선택합니다. 참고 : 소프트웨어가 자동으로 해부학 적 검사를위한 0.153 X 0.153 X 0.153 mm 3에 복원 된 복셀 크기를 설정하고 DCE-CT 검사에 0.153 X 0.153 X 0.462 mm 3. &#39;재건을 시작&#39;버튼을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 을 계산 CT-리포솜의 주입 전 10 분간 주입 후 스캔을 사용하여혈장 부피 분율은 앞서 설명한 3. 또한, 이전에 7 바와 같이 간극 체적 분율을 계산하는 사전 주입 iohexol 5 분 후 분사 스캔을 사용한다. </li><li> 종양 체적 내에 ROI (region of interest)를 식별하는 기능을 제공하는 소프트웨어에 DCE-CT 데이터를 가져 시간 강도 곡선 (TICS)을 얻었다. 그 후 시간의 함수로서 ROI의 평균 CT 향상을 계산한다. 이 실험에서 사용자 지정 소프트웨어는 투자 수익 (ROI)을 식별하고 TIC를 계산하기 위해 개발되었다. </li><li> 두 구획 추적 운동 모델을 사용하여 측정 틱 피팅에 의해 관류 및 혈관 투과성의 정량적 추정치를 얻습니다. 피팅 DCE-CT 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하고, 두 구획 트레이서 동역학 모델에서 고정 된 파라미터로서 선험적 플라즈마 체적 분율의 추정 및 삽입 부피비를 사용할 수있다. 원형질의 선험적 추정치를 얻기 위해 이전에보고 된 방법을 사용하여a와 간질 볼륨 분수 14. </li></ol> 종양 간질 유체 압력 4. 공간 측정 <ol><li> IFP는 PE20 폴리에틸렌 튜브 50cm 통한 압력 변환기 및 상기 IFP 수집 시스템 25 G 척추 바늘을 연결 측정합니다. 헤파린 설페이트 / 식염수 (1시 10분)으로 시스템 전체를 세척. 사용하기 전에 70 % 이소 프로필과 바늘을 소독. </li><li> 획득 시스템의 전원을 켜고 IFP 수집 소프트웨어를 실행하고 mmHg로의 IFP 측정을 획득 할 수있는 시스템을 보정하기위한 설정 파일을로드합니다. 지속적으로 IFP 데이터를 수집하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다. </li><li> 4.8에 기술 된 방법을 사용하여 리포좀 CT-48, 72 시간 포스트 분사 사이 IFP 측정 (이것은 종양의 CT-리포좀 피크 누적의 대략적인 시간에 상당)을 수행. 중부 표준시 - IFP 로봇에 IFP 바늘을 연결합니다. </li><li> 에 대한 좌표계를 정렬 교정 검사를 수행중부 표준시 - IFP 로봇과 CT 스캐너. 중부 표준시 - IFP 로봇에 기준 마커 첨부 파일을 추가하고 네 개의 다른 위치에 기준 마커와 네 메스 CT 스캔을 수행합니다. <ol><li> 은 CT-IFP 로봇 컨트롤러 소프트웨어를 실행 로봇을 초기화하고, X, Y, Z 대상 위치를 입력하고 &#39;이동&#39;버튼을 클릭하여 세 가지 위치로 로봇을 이동합니다. </li><li> 다음 X에서 CT 스캔을 가지고, Y는 Z 좌표 (1) 0,0,0; (2) -10,0,0 단계; (3) 0,7,0 단계; (4) 0,0,10합니다. 90 kV로, 10mA, 16 스캔을 시작하기 위해 CT 스캐너 소프트웨어를 눌러 &#39;시작&#39;을 사용하여 초 스캔을 선택합니다. 3.10에 기술 된 바와 같이 검사를 재구성. </li></ol></li><li> 중부 표준시 - IFP 로봇 정렬 소프트웨어를 실행합니다. 다음 &#39;열기&#39;클릭 &#39;등록 데이터&#39;영역에 들어있는 &#39;추가&#39;버튼을 클릭하고 4.3에서 얻은 네 재구성 등록 검사를 선택합니다. 주 : 기준 마커의 픽셀 위치가 자동으로 softwa에 입력됩니다레. <ol><li> &#39;계산 변환&#39;버튼을 클릭 한 다음 &#39;변환 적용&#39;버튼을 클릭합니다. 이것은 CT-IFP 로봇 좌표계 CT 스캐너 좌표계로 변환하는 데 사용되는 정렬 데이터를 생성한다. 보정이 완료되면 CT-IFP 로봇에 동물 플랫폼을 연결합니다. </li></ol></li><li> 의료 공기 또는 산소와 혼합 2 % 이소 플루 란을 사용하여 각 마우스를 마취하고 발가락을 곤란하게하고 어떤 반응을 관찰하지에 의해 확인합니다. CT-IFP 로봇 플랫폼 동물 고정화 종양의 CT-IFP 로봇 시스템에 액세스 할 수 있도록 마우스를 위치. 이 IFP 바늘 삽입 동안 이동하지 않도록 테이프를 사용하여 종양을 고정시킨다. </li><li> IFP 바늘을 삽입하기 전에 해부학 마이크로 CT 스캔을 수행합니다. 3.10에 기재된 단계를 사용하여 CT 데이터를 재구성한다. </li><li> 중부 표준시 - IFP 로봇 정렬 소프트웨어에 사전 바늘 삽입 CT 데이터를로드합니다. 종양을 시각화 할 수있는 창 레벨을 조정합니다. 일을 클릭모든 이미지에서 종양의 전자 림, 다음 두 번째 림 위치를 클릭합니다. 주 : 소프트웨어가 두 위치 사이의 직선을 따라 위치의 시리즈를 계산합니다. 는 X, Y 및 Z 참고 목록에서 5~8 균등 위치 일련의 좌표. </li><li> 삽입하기 전에 헤파린 생리 식염수와 바늘을 세척하여 IFP 시스템을 준비합니다. </li><li> 중부 표준시 - IFP 로봇 제어 소프트웨어에, X, Y, Z에 첫 번째 미리 결정된 바늘 위치를 입력하고 키를 누릅니다-이동 &#39;이동&#39;버튼을 원하는 위치로 로봇을 이동합니다. 조직에 바늘을 삽입하려면 &#39;삽입 바늘&#39;버튼을 클릭합니다. <ol><li> IFP 측정이 증가하고는 IFP 수집 소프트웨어에 값을-곤란 사전에 반환 지적 바늘이 IFP 바늘과 곤란과 PE20 튜브를 해제하여 조직 사이 좋은 유체 소통을 위해 삽입 한 후. 기준에 반환하지 않는 측정을 거부합니다. </li></ol></li><li> 취득삽입 된 바늘 해부학 CT 검사 후 조직에서 바늘을 철회하기 위해 CT-IFP 로봇 제어 소프트웨어의 &#39;후퇴 바늘&#39;버튼을 클릭합니다. IFP 값이 상기 바늘의 인출 후에 프리 바늘 삽입 값으로 복귀하지 않는 IFP 측정을 거부한다. 이 바늘은 측정 중에 걸려 수도 의미한다. 반복 4.8 각각의 바늘 위치에 대한 4.10 단계를. </li><li> 바늘 후 삽입 메스 CT 스캔에서 식별 된 종양 부피의 질량 중심 니들 포트 상대의 x, y, z 위치를 계산하여 종양 체적 내에서 바늘의 위치를​​ 결정한다. </li><li> 모든 측정이 완료된 후 자신의 케이지에 동물을 돌려줍니다. 무인 동물을두고 의식을 회복하고는 흉골 드러 누움을 유지 할 수 있습니다 때까지 그들을 관찰하는데주의를 기울여야하지 마십시오. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

여기에 제공된 이미지 기반의 측정 방법은 종양 미세 속성, IFP, 및 CT-리포좀 축적의 공간 분포의 결정을 할 수 있습니다. 이러한 속성에 관한 이전의 시도는 다수의 종양 함유 동물 걸쳐 대량 측정을 수행에 의존하기 때문에 일반적으로 나노 크기의 약물 전달 시스템 (15)에 대해 관찰 된 인트라 종양 축적 이질성을 담당 메커니즘을 밝히기 감도 부족했다. DCE-CT는 종양 미세 특성의 내 종양 ...

나노 입자 약물 전달 시스템의 종양 내 축적을 측정하면, 세포 독성 약물의 적절한 농도는 종양 내에서 달성되었는지 확인하기위한 중요한 도구를 제공 할 수있다. &quot;화상 수&quot;리포좀 시스템의 개발이 비 침습성 정량을 허용 생체 같은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 한 광학 형광 2, 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 3 등의 영상 방식을 이용하여 약물 전달 비히클의 검출, (4) 및 자기 공명 영상 (MRI) 5. 이미징 약동학 및 리포좀 전달 시스템의 생체 분포를 결정하기 위해 나노 입자 축적 -6,7- 인 인터 피사체 내 종양 이질성의 정도를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 나노 입자의 영상은 혼자 자신의 가난한 축적 및 유통에 기여 생물학적 장벽을 식별하지 않습니다. 이 지식은 연구에 매우 중요합니다ational 더 효과적인 제제의 개발 및 전략을 내 종양 축적 (8)을 향상시킬 수 있습니다. 치료 전략이 향상된 나노 반송 구 결과 특정 생물학적 장벽을 변조하는데 적용될 수 있음을 증명하고있다. 또한, 나노 입자 제제는 특히 특정 생물학적 전송 배리어 (10)를 극복하기 위해 개발되었다. 두 시나리오에서, 생물학적 장벽 측정 적합한 나노 입자 약물 전달 전략의 사용을 유도하는데 사용될 수있다. 종양 미세과 높은 IFP 고체 종양 9,11 이러한 리포좀으로 나노 입자의 내 종양 축적의 두 가지 주요 결정 요인이 될 것으로 생각된다. 그러나 가난한 리포좀 축적에 기여할 수있는 다른 장벽은 조밀 한 세포 외 기질, 불 침투성 혈관, 고체 조직 압력 (12)을 포함한다. 이 장벽은 시공간에 관련방법 비정상적인 혈류 상승 간질 유체의 압력은 나노 입자의 초기 전달 및 혈관 외 유출 구동 두 가지 중요한 요인으로되고. 전술 한 바와 같이, 종양 미세 상승 IFP 및 리포좀 내 종양 축적 간의 관계를 확립하는 리포솜 촬상 데이터의 적절한 해석에 필수적이다. 여기서 정량 방법은 고형 종양에서 종양 미세 상승 IFP 및 나노 입자의 축적의 관계를 측정하는 것이 제시되어있다. 이것은 동적 콘트라스트 컴퓨터 단층 촬영을 개선하여 부피 CT 영상 종양 미세을 이용한 CT 리포좀 조영제 인트라 종양 분포 공동화 측정을 수행함으로써 달성하고, 영상 유도 로보트 침 위치 확인 시스템을 이용하여 종양 IFP는 불린다 중부 표준시 - IFP 로봇 13.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Lipids Inc., USA</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (CH)</td><td>Avanti Lipids Inc., USA</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Lipids Inc., USA</td><td>880128P</td><td></td></tr><tr><td>Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes</td><td>Whatman Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 m Lipex Extruder&amp;nbsp;</td><td>Nothern Lipids Inc, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa</td><td>Spectrum Labs, USA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column&amp;nbsp;</td><td>MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV spectrometer</td><td>Helios &amp;gamma;, Spectronic Unicam,&amp;nbsp; USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90Plus particle size analyzer&amp;nbsp;</td><td>Brookhaven, Holtsville, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eXplore Locus Ultra micro-CT system&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare, CA</td><td></td><td>Manipulated using CT-Console Software</td></tr><tr><td>AxRecon GPU-based Reconstruction</td><td>&amp;nbsp;Acceleware Corp. CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set</td><td>Terumo Medical Products, USA</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>PE20 polyethylyne tubing</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Pen tip 25 G &amp;times; 3.5&amp;prime;&amp;prime; Whitacre spinal needle&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>405140</td><td>IFP needle</td></tr><tr><td>P23XL&amp;nbsp; pressure transducer&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, CA</td><td>P23XL</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0</td><td>ADInstruments Pty Ltd., USA</td><td>PL3504, FE221</td><td>IFP acquisition system and acquisition software</td></tr><tr><td>CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot)</td><td>Parallax Innovations, CA</td><td></td><td>Manipulated using CT-IFP robot Control Software</td></tr><tr><td>CT-IFP robot alignment software</td><td></td><td></td><td>Custom Matlab software</td></tr><tr><td>DCE-CT Analysis Software</td><td></td><td></td><td>Custom Matlab software</td></tr><tr><td>Matlab 2013b</td><td>Mathworks, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial measurements of perfusion, interstitial fluid pressure and liposomes accumulation in solid tumors

리포좀의 이종 종양 내 축적 효능의 중요한 결정 인자이다. 혼돈 종양 미세하고 IFP 상승 모두는 나노 리포좀 계 약물 전달 시스템의 이종 종양 내 분포에 연결된다. 본 연구에서 종양 미세 상승 IFP 및 나노 입자의 축적이 관계는 생체 내 실험을 통해 조사 하였다. 이것은 동적 전산화 단층 촬영 (DCE-CT) 강화 된 콘트라스트 및 종양 IFP 측정 마이크로 CT 스캐너에 접속 된 새로운 영상 유도 로보트 바늘 배치 시스템을 사용하여 사용하여 종양 미세 평가함으로써 수행 하였다. 리포솜의 종양 내 축적 안정적 조영제 iohexol (CT-리포좀)를 캡슐화하는 나노 입자 리포좀 제제의 CT 이미지 기반의 평가에 의해 결정 하였다. CT 영상에서의 공간 분포의 공동 지역화 허용종양 혈역학 유방암의 각각의 피하 이종 이식 마우스 모델에서 IFP 및 CT-축적 리포솜. 측정 관류 플라즈마 부피 분율은 리포솜의 종양 내 분포의 강한 매개체이다 발견되었다. 또한, 결과는 IFP 혈류를 변조를 통해 리포좀 분포 매개 간접적 인 역할을 제안한다.

상기 프로토콜은, 각각 91.8 ± 0.3 nm 내지 -45.5 ± 2.5 MV를, iohexol의 캡슐화 농도 CT-리포좀을 수득 리포솜 직경 55 밀리그램 mL의 -1의 제타 포텐셜을 의미한다.도 1a는 대표적인 DCE-CT 영상을 포함 결과 iohexol의 종양 내 축적의 시간 변화를 표시 체적 데이터의 시계열을 얻었다. 종양 내에서 ROI를 선택하면 관류, 혈관 투과성, 혈장 부피 분율 및 간극 체적 분율...

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Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

spatial-measurements-perfusion-interstitial-fluid-pressure-liposomes

Research

JoVE Journal

Medicine

7.6K 조회수.  University of Toronto. The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

연구

생체공학

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

조정 아티 스핀 라벨을 사용하여 폐 관류의 자기 공명 이미징 부량

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

의학

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

암 연구학

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

형광 공 초점 Videomicroscopy를 사용하여 종양 혈관의 생체 내 이미징

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

미세유체역학(Microfluidics) 기반 혈관화된 인간 미세종양 모델 준비

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

저자 스포트라이트: Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research (중개 암 연구를 위한 모델로서의 인간 혈관 미세 종양 생성) 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Guided Tumor Inoculation and Multimodal Imaging in Mice

A Dorsal Skinfold Window Chamber Tumor Mouse Model for Combined Intravital Microscopy and Magnetic Resonance Imaging in Translational Cancer Research

Preclinical intravital imaging such as microscopy and optical coherence tomography have proven to be valuable tools in cancer research for visualizing the tumor microenvironment and its response to therapy. These imaging modalities have micron-scale resolution but have limited use in the clinic due to their shallow penetration depth into tissue. More clinically applicable imaging modalities such as CT, MRI, and PET have much greater penetration depth but have comparatively lower spatial resolution (mm scale). 
To translate preclinical intravital imaging findings into the clinic, new methods must be developed to bridge this micro-to-macro resolution gap. Here we describe a dorsal skinfold window chamber tumor mouse model designed to enable preclinical intravital and clinically applicable (CT and MR) imaging in the same animal, and the image analysis platform that links these two disparate visualization methods. Importantly, the described window chamber approach enables the different imaging modalities to be co-registered in 3D using fiducial markers on the window chamber for direct spatial concordance. This model can be used for validation of existing clinical imaging methods, as well as for the development of new ones through direct correlation with "ground truth" high-resolution intravital findings. 
Finally, the tumor response to various treatments-chemotherapy, radiotherapy, photodynamic therapy-can be monitored longitudinally with this methodology using preclinical and clinically applicable imaging modalities. The dorsal skinfold window chamber tumor mouse model and imaging platforms described here can thus be used in a variety of cancer research studies, for example, in translating preclinical intravital microscopy findings to more clinically applicable imaging modalities such as CT or MRI.

저자 스포트라이트: 고해상도 생체 내 영상 및 MRI를 통합하여 정위 신체 방사선 치료 계획 향상

Translation of Intravital microscopy findings is challenged by its shallow depth penetration into tissue. Here we describe a dorsal window chamber mouse model that enables co-registration of intravital microscopy and clinically applicable imaging modalities (e.g., CT, MRI) for direct spatial correlation, potentially streamlining clinical translation of intravital microscopy findings.

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

Preclinical intravital imaging such as microscopy and optical coherence tomography have proven to be valuable tools in cancer research for visualizing the ...

관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

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명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

조정 아티 스핀 라벨을 사용하여 폐 관류의 자기 공명 이미징 부량

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

형광 공 초점 Videomicroscopy를 사용하여 종양 혈관의 생체 내 이미징

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델