단백질의 세포 내 국소화를 결정하는 것은 단백질의 적절한 기능과 관련된 메커니즘을 설명하는 데 중요합니다. 이 방법은 울트라 구조 수준에서 단백질의 세포 내 국소화를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 양자점 매개 면역 표지는 더 안정적이고 광퇴색에 내성이 있으며 자체 방출 스펙트럼을 가지며 높은 전자 밀도를 생성하며 조직에 더 나은 침투로 조직에 더 높은 효율성과 유지력을 나타냅니다.
공정의 여러 단계, 즉 고정, 에칭, 블로킹 및 최적의 퀀텀닷 농도는 최적화하기 어려운 단계입니다. 사용 된 시약의 여러 시점과 농도를 시도하는 것이 좋습니다. 또 다른 과제는 인내와 물론 연습 만이 효과가있는 그리드를 처리하는 것입니다.
이 절차를 시연하는 것은 우편 연구원 인 Chowdhury Abdullah, 내 실험실의 대학원생 인 Naznin Remex, 전자 현미경 서비스의 전자 현미경 감독자 인 Brandon Hartman입니다. 마우스를 마취시키고 흉강을 연 후, 0.1 몰의 나트륨 카코 딜 레이트 완충액에 얼음처럼 차가운 3 % 글루 타르 알데히드를 사용하여 2 분 동안 심장을 풍부하게합니다. 5 x 8인치의 25게이지 바늘을 사용하여 중력 압력을 사용하여 고정액을 심장에 도입합니다.
심장이 정착액으로 채워지기 시작한 직후, 심장의 정점을 들어 올려 압력을 완화하십시오. 심장에서 1-2 밀리미터 떨어진 혈관을 자르고 액체가 배출되도록하십시오. 심장을 해부하십시오.
심방을 제거하고 심실을 얼음처럼 차가운 3 % 글루 타르 알데히드와 0.1 몰 나트륨 카코 딜레이트가 들어있는 페트리 접시에 떨어 뜨립니다. 고정 30-60 분 후에 나비를 자르고 심실을 페트리 접시에 다시 넣으십시오. 1 입방 밀리미터의 작은 입방체로 수술 용 칼날을 사용하여 심장을 자릅니다.
해부 된 심장 조직을 글루 타르 알데히드에 고정하고 담그고 섭씨 4도에서 24 시간 동안 카코 딜 레이트합니다. 24 시간의 고정 후, 조직을 0.1 몰 나트륨 카코 딜레이트 완충액에서 20 분 동안 두 번 세척한다. 나트륨 카코딜레이트 완충액에서 조직을 제거하고 실온에서 4시간 동안 2%오스뮴 사산화칼슘 용액에 담그십시오.
침투 후 조직을 2% 아세트산나트륨 용액에 실온에서 10분 동안 담그십시오. 다음으로, 조직을 실온에서 1 시간 동안 2 % 우라 닐 아세테이트 용액에 담그십시오. 우라닐 아세테이트 염색 후, 등급이 매겨진 알코올과 아세톤을 통해 조직을 순차적으로 탈수시킨다.
탈수된 조직을 원고에 설명된 대로 저점도 에폭시 수지에 매립합니다. 조직을 8mm 마이크로 몰드의 새 수지에 넣고 내장된 조직을 섭씨 70도에서 밤새 경화시킵니다. 관심 영역을 찾은 후 울트라 45도 나이프를 사용하여 옅은 금색 초박형 섹션을 생성합니다.
이 초박형 섹션을 200 메쉬 구리 그리드의 둔한면에 놓습니다. 깨끗한 파라핀 필름에 20 마이크로 리터의 에칭 용액 메타 피리오데이트를 넣어 항원을 마스킹하여 염색을 시작합니다. 조직 섹션이있는 건조 된 그리드를 에칭 용액의 물방울 위에 놓습니다.
실온에서 30 분 동안 용액에 섹션 그리드를 그대로 두십시오. 에칭 된 조직 섹션을 증류수 방울에 60 초 동안 놓아 세척하십시오. 섹션 그리드를 0.05 몰의 글리신 용액 액적 위에 놓고 실온에서 10분 동안 침상시켜 잔류 알데히드를 차단한다.
그리드의 가장자리를 여과지에 닦아 잔류 글리신 용액을 제거합니다. 단면 그리드를 실온에서 25분 동안 10 내지 20 마이크로리터의 블로킹 용액에 둔다. 그리드 가장자리를 여과지에 묻히고 그리드 섹션을 항체 희석제 위에 놓고 실온에서 10분 동안 컨디셔닝합니다.
그리드 절편을 1차 항체와 함께 가습된 챔버에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한다. 그리드를 블롯 건조시키고, 그리드 섹션을 항체 희석제로 각각 5분 동안 2회 세척한다. 그리드 절편을 비오티닐화된 2차 항체와 함께 가습된 챔버에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
그리드가 블롯 건조되면, 그리드 섹션을 항체 희석제로 각각 5분 동안 2회 세척한다. 그리드 절편을 시판되는 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 QD에서 실온의 챔버에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 챔버를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되는 것을 방지하십시오.
여과지를 사용하여 그리드 가장자리를 얼룩 건조시킨 후 격자 부분을 물방울에 2 분 동안 두어 세척하고 그리드 가장자리를 닦아 건조시킵니다. 시편 홀더를 현미경 컬럼에 삽입하고 펌프 스위치를 작동시켜 고니오미터를 평가한 다음 시편 홀더를 현미경 컬럼에 완전히 삽입합니다. 원하는 영역에 잘 집중하십시오.
고속 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처하고 파일을 tif 형식으로 저장합니다. 미토콘드리아 막, 리소좀, 및 소포체 또는 근질 세망 막 미토콘드리아 계면은 Sigmar1 표지 양자점의 존재를 보여주었습니다. 심장 절편은 항-Sigmar1 토끼 1차 항체에 대한 이소형형 대조군으로서 토끼 면역글로불린 G 및 양자점을 사용하여 시각화하였다.
이 프로토콜에서 작업하는 동안 고려해야 할 한 가지 중요한 사항은 항원에 대한 마스킹 해제 시간입니다. 조직 절편이 너무 오랫동안 에칭되면, 메타주기 용액은 얇은 조직 절편에 천공을 생성합니다. 퀀텀닷 매개 라벨링은 종양 검출, 종양 분자 및 면역 상태 프로파일링, 조직 이미징 분야에서 주목을 받고 있어 의료 진단을 위한 새로운 길을 열어주고 있습니다.
퀀텀닷은 또한 광역학 요법을 통해 종양을 치료하고 눈에 약을 전달하여 안과 기형을 치료하는 데 유용합니다.
