Name: a mimic of the tumor microenvironment: a simple method for generating enriched cell populations and investigating intercellular communication
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication at JoVE.com

This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

문화 미디어와 세포의 1. 준비 <ol><li> 이글의 최소 필수 12.5 % (부피 / 부피)으로 보충 된 배지 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 페니실린 100 유니트 500 ㎖의 용액 당 스트렙토 마이신 100 μg의 준비. 주 : 성장 배지 및 보충 (들)을 쉽게 다른 세포 균주 또는 세포주의 성장 조건에 대해 교환 될 수있다. </li><li> 각각의 인서트 (6 웰 포맷 인서트)를위한 세포 배양 배지 70 ㎕를 준비 : 이글의 최소 필수 배지는 50 % (vol / vol) 열 활성화, FBS 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 100 단위로 보충 페니실린과 스트렙토 마이신 ml의 당 100 μg의. 주 : 배지는 인서트의 바닥면 (즉, 하측)에 세포 부착을 용이하게하기 위해 50 % FBS가 보충된다. 성장 배지 및 보충 (들)을 쉽게 다른 세포 균주 또는 세포주의 성장 조건에 대해 교환 될 수있다. </li><li>인서트의 바닥면에 도금 될 운명 세포의 세포 현탁액을 준비한다. 주 : 여기에서, 결과 AG1522 75 ㎠로 세포 배양 플라스크에서 배양 정상적인 인간 섬유 아세포를 사용하여 수득하고, 이들 세포 따라서 세포 현탁액의 제조에 대한 설명이 분명 할 것이다. </li><li> 세포를 수집하기 위해, 성장 배지를 제거하고 5 ㎖ 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포 단층 배 씻는다. </li><li> PBS를 제거하고 RT (실온)에서 2 분 동안 세포를 실온 (RT)을 미리 예열 2.21 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)과의 트립신, 0.25 % (부피 / 부피) 1 mL의 확산. </li><li> (단계 1.1에서 제조) 완전 성장 배지 9 ml의 트립신 활성을 켄 칭하고 부드럽게 플라스크에 10 배의 표면에 세포 현탁액을 피펫 팅하여 세포를 수집한다. </li><li> 혈구 전자 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정하고 제공하기 것이다 세포 현탁액 부피 피펫전자 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 삽입 당 250,000 세포. </li><li> 원심 분리하여 세포 현탁액 (800 XG, 2 분) 펠렛. 70 μL 당 250,000 세포의 농도를 생성한다 (단계 1.2에서 제조) 성장 배지에서 세포 펠렛을 중지. 주 : 투과성 미다 공막 인서트의 세포 배양 물이 2 차원 기판에 근거 같이 세포가 초기에 부착을 촉진하는 50 % (부피 / 권) FBS를 포함하는 배지에 현탁한다 제외한 셀 시드가 마찬가지로 실행된다. </li></ol> 삽입 2. 준비 참고 : 세포 배양에 전념 층류 생물 안전 캐비닛에 무균 조건, 작업을 확인하십시오. <ol><li> 0.4 ㎛의 멤브레인 기공 크기 1 ㎛, 3 ㎛의로 선택 인서트 (기공 크기 실험이자 (들)에 의해 결정이 간 통신의 다른 모드의 역할을 조사하기 위해 사용될 수있다). 주 : 0.4 μm의 기공에 작은입니다L은 충분히 삽입 막의 양쪽 셀 간의 기능 차이 접합의 형성을 제한하는 요인에 의해 분비 세포 간 통신을 연구하는데 사용될 수있다. 반면, 1 ㎛ 내지 3 ㎛의 기공이 작동 갭 접합의 형성을 허용하기에 충분히 크고 갭 정션 분비 인자 모두 간 통신을 연구하는데 사용될 수있다. </li><li> 포장에서 개별 삽입물을 제거하고 동일한 크기의 멀티 잘 접시에 배치합니다. 참고 : 삽입 특정 애플리케이션 요구에 맞게 다양한 막 표면 영역을 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 6 자, 12도, 24도 삽입.). 여기서, 결과는 6- 웰 인서트를 사용하여 수득 하였다, 따라서 모델 설명의 초점이 될 것이다. </li><li> 접시 뚜껑 인서트를 포함, 접시를 커버. 두 손으로 멀티 잘 접시를 잡고 부드럽게 삽입 바닥 (즉, 아래쪽은) 지금 위쪽으로 향하게되도록 접시를 반전. </li><li> 일을 제거인서트의 바닥면을 노출시키는 멀티 웰 접시의 바닥 E. 한 번에 하나의 삽입 작업, 포셉의 살균 쌍을 사용하여 조심스럽게 제자리에 삽입을 누릅니다. 무료 손으로, 25 만 세포를 포함하는 세포 현탁액 (단계 1.3-1.8에서 제조)의 70 μl를 그리는 넓은 입 팁 피펫을 사용합니다. </li><li> 세포를 플레이트에 삽입의 멤브레인의 중심을 부드럽게 피펫 팁을 배치하고, 천천히 막의 표면 주위 피펫 팁을 이동하면서 서서히 세포 현탁액 70 μL 피펫. 삽입의 가장자리에 피펫 팁 및 세포 현탁액을 연장하지 않도록주의하십시오. 주 : 인서트의 가장자리를 터치하면 첨부 동안 건조 셀에 이르는 세포 현탁액 모세관 장력의 손실을 초래할 수있다. </li><li> 주의를 행사하지 않을 가능성이 미생물 오염을 방지하기 위해 노출 삽입을 통해 직접 작업에, 나머지 삽입을 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 다 잘 돌아갑니다접시 바닥은 삽입을 포함합니다. 반전 인서트 접시 유지 30-45 분 동안 37 ℃에서 5 % (부피 / 부피) CO 2의 가습 된 공기 분위기에서 배양한다. 주 : 삽입 콘택트 웰 바닥의 세포 현탁액을 조심스럽게 접시 바닥을 들어 올려이 약간의 각도를 형성하고, 접시의 표면 사이에 큰 거리를 생성되도록 접시 상부 가장자리에 나머지 경우 (세포를 시딩) 인서트의 바닥면. 이 대신 인서트의 웰의 표면에 부착로부터 세포를 방지한다. </li><li> 30 ~ 45 분 배양 시간에 따라 부드럽게 삽입이 들어있는 접시를 제거하고 층류 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. </li><li> 두 손으로 꽉 접시 뚜껑을 유지하면서 부드럽게 부착 세포를 함유하는 인서트의 바닥면은 이제 아래로 향하도록 상기 접시를 다시 반전. </li><li> 3 μm의 기공이 migrati을 방지하기 위해 삽입을 위해 차분히 2 ㎖ (1 ml에 추가삽입의 바닥 침지되도록 미리 예열 완료 매체의 삽입 구멍)을 통해 세포에 (각 웰 단계 1.1)을 참조하십시오. </li><li> 삽입을 포함하는 모든 우물에서 성장 매체를 추가 한 후, 가습 인큐베이터에 다시 접시를 놓습니다. </li><li> 인서트 48 시간 동안 인큐베이터에 그대로 남아 있습니다. 48 시간 후, 웰의 바닥에서 중간의 2 ml의 흡입 신선한 성장 배지 2 ㎖를 첨가하여 세포를 공급. </li><li> 이러한 경우 (이미 바닥면에 성장하는 제 1 셀 인구 인서트의 상부면에 상기 제 세포군 현탁액 (~ 250,000 세포 / ml)의 잘 시드 1 ml의 하단에 새로운 배지를 첨가 한 후 실험은, AG1522 (대조군) 세포 암 (실험) 세포)는 인서트의 바닥면에 성장 될 운명 CAFs에 이미 AG1522 세포를 갖는 인서트의 상부에 도금된다. 가습 인큐베이터에 다시 접시를 놓습니다. 참고 : 만약 작품삽입물의 아래쪽에 잘 부착되지 않는 세포를 보내고,이 세포는 다르게 인서트의 상부면 상에 성장 될 수있다. </li><li> 웰의 삽입과 하단의 상부에서 배지를 흡인함으로써 인서트의 윗면에 셀의 두번째 집단을 시딩 한 후 24, 72의 중간 및 96 시간을 변경한다. 부드럽게 웰의 바닥에 인서트의 윗면에 새로운 배지 1 ㎖를 2 ㎖에 추가한다. 두 세포 인구 120 시간의 투과성 미세 삽입 막의 양쪽에 공동 문화에 남아있을 수 있습니다. </li></ol> 3. 트립신에 의해 삽입에서 세포를 수집 주의 : 농축 된 세포 집단을 수득하는 용이성에 더하여, 삽입 TME 모델은 유사한 실험 치료 가능 (예를 들어, 화학, 상기 주위 공기보다 낮은 산소 환경에 노출, 이온화 방사선 처리 등으로 배양) 등 다른 시험관 </em&gt; TME 공동 배양 모델. 또한, 투과성 삽입 공 배양 용 기재가 이미 표준 2D 조직 배양 모델 개발 과정에 의해 분석 될 수있다. 예를 들어, 세포 (시츄 면역 검출, 웨스턴 블랏에서 예) 다음에 엔드 포인트의 분석에 이용 될 수있는 고농축 집단을 얻기 위해 삽입 멤브레인의 양측에서 수확 될 수 있거나 후속 실험 36 전파. <ol><li> 세포를 수집하기 위해, 성장 배지로부터 삽입물을 제거하고 1 ㎖의 PBS를 함유하는 35mm 세포 배양 접시에 배치. 1 ml의 PBS로 삽입 1 배의 아래쪽과 위쪽을 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거를 0.25 % 2.21 mM의 EDTA와 트립신 (부피 / 부피) 200 μl를 추가, RT에 미리 예열. <ol><li> 인서트의 바닥면에 성장 된 세포를 수집하는 경우, 35mm 접시에 트립신 용액을 넣고 부드럽게 RT에서 2 분 동안 트립신 용액으로 인서트의 바닥에 놓는다. </li><li> 세포를 수집하면삽입물의 상부면 상에 성장 S, A 35mm 접시에 삽입 배치하고, 삽입물의 상부에 트립신 용액을 첨가하고 실온에서 2 분간 배양한다. </li></ol></li><li> 완전 성장 배지 800 μl를 첨가함으로써 트립신의 활성을 해소. <ol><li> 인서트의 저면에 성장 된 세포를 수집하는 경우, 35mm 접시에 성장 배지를 추가하고 부드럽게 삽입이 약간 유지되면서 삽입 배의 표면 위에 세포 현탁액 1 ml의 피펫 팅하여 세포를 수집 각도는, 세포 현탁액은 접시에 수집되도록. </li><li> 인서트의 상면으로부터 세포를 수집하는 경우, 상면에 성장 배지를 추가하고 부드럽게 삽입 배의 표면 위에 세포 현탁액 1 ml의 피펫. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 세포 순도 4. 특성 주 : t의 순도를 유지하는 통기성 미세 다공성 막 삽입 능력을 특성화120 시간까지, 섹션 1-3 녹색 형광 단백질 (GFP)을 수행 하였다 위해 (즉, 상단과 하단) 그는 두 개의 세포 집단은 MDA-MB-231 세포는 삽입물의 상단면에 도금되는 -tagged하고, 비 GFP 태깅 AG1522 세포는 0.4 μm-의 바닥면에 1 μm-, 3 ㎛의 포어 인서트 도금된다. <ol><li> 인서트의 바닥 측으로부터 셀 (절차 3 장에 기재되어 있음)을 수집 후 원심 분리하여 세포 현탁액 (500g, 30 초) 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 1 % (부피 / 권) FBS로 보충 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS) 400 μL의 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> GFP 및 GFP의 광자 (37)를 검출하기 30분의 530의 대역 통과 필터를 여기하는 사이토 488 nm 인 레이저를 구비 한 흐름 세포 측정 분석을 수행한다. </li><li> 셀 식별을 위해, 유동 세포 계측기에 순방향 조정할 AG1522 조절 세포 집단 및 측면 산란 전압을 사용한다. 맞추다GFP의 채널 전압은 GFP 신호에 대한 낮은 검출 임계치와 셀룰러 형광도 값을 설정한다. </li><li> 대조군 세포를 이용하여 임계 값을 결정 게이팅. 제어 대 GFP 양성 세포의 존재에 기초하여 각각의 세포 집단의 순도를 평가한다. 주 : 순수 인구가 감지 된 GPF 양성 세포의 반사 될 것이다. </li></ol> 제자리에 면역 형광에 의한 세포의 5. 특성 <ol><li> 삽입에서 세포의 트립신에 따라, (3 절 참조) 세포를 수집, 판 5 × 10 4 멸균 커버 글라스 상에 250 ㎕의 성장 매체 (참조 단계 1.1) 세포, 그리고 가습 공기 분위기에서 1 시간 동안 부착 할 수 있도록 37 ° C 배양기에서 5 % (부피 / 부피) CO 2. </li><li> 인큐베이션의 끝에, 부드럽게 커버 슬립을 함유하는 접시를 제거하고 층류 생물학적 안전 캐비넷에 배치. </li><li> 조심스럽게 (단계 참조 미리 예열 완전 배지 2 ㎖를 추가1.1) 각 접시에,되도록 커버 슬립을 담근다. </li><li> 커버 슬립을 포함하는 모든 요리에 성장 매체를 추가 한 후, 48 시간 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 % (부피 / 부피) CO 2의 가습 공기 분위기에 요리를 반환합니다. </li><li> 48 시간 배양 후, PBS로 샘플 배를 씻어 RT에서 10 분 동안 PBS에서 4 % (중량 / 부피) 포름 알데히드로 고정한다. </li><li> 트리스 완충 식염수 (TBS : 50 mM 트리스 - CL, 산도 7.5, 150 mM의 염화나트륨)로 5 배를 씻어 후 5 분에서 0.25 % (부피 / 부피) 트리톤 X-100, 0.1 % (중량 / 부피) 사포닌과 Permeabilize 하시려면 RT. </li><li> 비특이적 2 % (부피 / 권) 정상 염소 혈청 (NGS), 1 % (중량 / 부피) 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % (부피 / 부피) TBS 트리톤 X-100을 가진 결합 부위를 차단 (블로킹 RT에서 1 시간 동안 용액). </li><li> 밤새 4 ° C에서 솔루션을 차단에 : 차 항체 (1,000 방지 카베 올린 1 (CAV1), 1)에 품어. </li><li> 0.2 % NGS (부피 / 부피), 1 % (중량 / 부피) BSA, 0.1 %로 언 바운드 일차 항체 (배, 5 분 / 세척)을 씻어 (VOl / 부피) TBS 트리톤 X-100 (세정액). </li><li> 솔루션을 차단에서 1 시간 동안 실온에서 차 항체와 함께 품어 (섹션 5.4 참조). </li><li> 언 바운드 차 항체 세척 용액 (3 배, 5 분 / 세척)을 씻어 (단계 5.6 참조). </li><li> 마운트 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)를 포함하는 안티 - 페이드 장착 매체와 슬라이드에 커버 슬립, 매니큐어로 밀봉. </li><li> 형광 여기를 위해 외부 광원을 구비 거꾸로 현미경에 오일 63X 배율 대물 렌즈를 사용하여 세포를 관찰하고, 후속 분석을 위해 부착 된 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡쳐. </li></ol> 서양의 얼룩에 의해 세포의 6. 특성 주 : 웨스턴 블롯 절차는 다른 38 설명한다. 간략한 개요는 여기에 설명되어 있습니다 : <ol><li> 트립신 처리에 의해 삽입로부터 세포의 분리 이후, (제 3) 원심 분리 (500g, 30 초)에 의해 세포 현탁액 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 100 μl의 PBS로 세포 펠렛의 2 배를 일시 중지합니다. </li><li> 변성 radioimmunoprecipitation 분석 50 μL의 상등액를 Lyse 세포를 제거 (RIPA) 완충액 (트리스 pH를 7.5의 50 mM NaCl을 150 mm의 NP40 1 % (부피 / 권), 소듐 데 옥시 콜레이트 수화물 (DOC) 0.5 % (부피 / 부피), 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 0.1 % (부피 / 부피의)), 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 19,000g에서 얼음과 원심 분리기에 20 분 동안 품어. </li><li> RIPA 버퍼 내의 세제와 호환 가능한 광학 밀도 단백질 분석을 이용하여 상등액의 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 0.2 μm의 니트로 셀룰로오스 막 상 electroblot 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리 된 단백질. </li><li> 0.1 % (부피 / 부피) 트윈 - 20 (TBST), 4 % (중량 / 부피)를 포함하는 TBS에서 막을 품어 60 분 동안 우유 (차단 솔루션을) 탈지 및 (4 ° C에서 하룻밤 일차 항체와 반응 방지CAV1, 1 : 1000). </li><li> RT (5 분 / 세탁)에서 TBST로 막 배를 씻으십시오. </li><li> 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (5,000 1)와 접합 항 - 마우스 이차 항체를 함유하는 차단 용액에 30 분 동안 막을 인큐베이션. </li><li> RT (5 분 / 세탁)에서 TBST로 막 배를 씻으십시오. </li><li> 웨스턴 블 롯팅 검출 시스템을 이용하여 화학 발광 법에 의해 반응 생성물을 가시화. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 세포 간 통신의 7 특성 주 : 투과성 미다 공막의 적응성을 특징들은 간 통신 (예를 들어, 분비 된 인자 간극 연접)의 다양한 모드를 검사하기 위해 삽입한다. 섹션 1-2.12 비 형광 AG1522 세포 0.4 μm-의 바닥면, 한 μm-, 3 μm의 구멍에 삽입되는 도금으로 수행 하였다. <ol><li> 문화 섹션 1.1에 기재된 배지를 사용하여 90 % 포화 상태에 35mm 접시에 AG1522 세포는 비 - 표지. </li><li> 아르 자형INSE 세포 HBSS 1 mL의 1 배. </li><li> 칼 세인 오전 30 μM을 포함하는 HBSS에 세포를 배양하여 칼 세인 AM와로드 셀. </li><li> 37 ℃에서 5 % (부피 / 부피) CO 2의 가습 된 공기 분위기에서 15 분 동안 인큐베이션. </li><li> 워시 세포 HBSS 1 mL의 2 배. </li><li> RT에서 2 분 동안 2.21 mM의 EDTA와 0.25 % 트립신 200 μL 용액 (부피 / 부피)을 첨가하여 세포를 Trypsinize. </li><li> 12.5 %를 함유하는 완전 배지 (부피 / 부피) FBS 800 μl를 첨가함으로써 트립신의 활성을 해소. </li><li> 반복 피펫 팅에 의해 현탁액에 세포를 가져와. </li><li> 혈구 전자 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정 이미 바닥면에 성장 AG1522 셀이 인서트의 윗면에 칼 세인 AM 로케이션 250,000 세포 접시. </li><li> 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 공기 분위기에서 삽입 부화 6 시간 동안. </li><li> 설명 된 바와 같이 6 시간 후, 인서트의 바닥면으로부터 세포를 수집섹션 3인치 </li><li> 원심 분리하여 세포 현탁액 (500g, 30 초) 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 1 % (부피 / 부피) FBS로 보충 된 HBSS 400 μL의 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 레이저가 장착 된 사이토에 세포를 분석하고 흥미로운 가능한 필터 제조사의 프로토콜에 따라, 칼 세인 (496 nm 내지 516 nm의 각각)의 방출을 검출. </li><li> 셀 식별을 위해, 유동 세포 계측기에 전방 및 측면 스 캐터 전압을 조정하는 흠 AG1522 조절 세포 집단을 사용한다. 칼 세인 신호 낮은 검출 임계치와 셀룰러 형광도 값을 설정하기 위해 칼 세인 채널 전압을 조정한다. </li><li> 칼 세인 제어로드 셀을 사용하여 상위 임계 값 제한을 결정한다. 제어 대 칼 세인 양성 세포의 존재에 기초하여 각각의 셀을 삽입 통신 평가. </li></ol>

저자는 더 경쟁 또는 상충되는 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 투과성 미다 공막 인서트 이형 세포의 공 배양에서 고농축 개별 세포 집단을 생성하기 위해 이용하는 간단한 시험 관내 절차에 적응 (도 1)이다. 현저하게, 간 모델은 다양한 통신 방식을 연구하기에 적합하다. 중요한 단계는 상단 측에 제 세포군 시드 50 % FBS로 보충 된 배지에서 인서트의 바닥면에 상기 제 세포군 시드 특정 실험이자 (S)에 적절한 기?...

종양 미세 환경 (TME)을 공존 기질 및 호스트와 함께 진화 암종 세포로 구성된 복잡한 시스템이다. 이 기질 성분은 일반적으로 섬유 아세포, 근육 섬유 모세포, 내피 세포, 다양한 면역 성분뿐만 아니라, 세포 외 매트릭스 (1)로 구성된다. 중요한 성분이 기질의 대부분은 종종 활성 섬유 아세포 자주 암 관련 아세포 또는 암 - 관련 아세포 (CAF) 2,3-라고 칭한다. 정상적인 비 - 활성화 된 섬유 아세포와 달리 CAFs에 유방, 전립선, 폐, 췌장, 피부, 결장, 식도를 포함한 암의 다양한에서 종양의 개시, 진행, 혈관 형성, 침윤, 전이 및 재발 4-11에 기여하고, 5,6,12-17 난소. 그러나, 암 발병에 걸쳐 CAFs에의 기여의 정확한 특성을 제대로 정의 된 상태로 유지됩니다. 또한, 임상 적 증거는 CAFs에의 예후 값을 보여 주었다높은 등급의 악성 종양, 치료 실패 및 전반적인 불량한 예후의 10,18,19에 자신의 존재의 상관 관계. 분명히, CAF 개발 개시 이벤트뿐만 아니라 TME 내 역할을 매개 세포 간 통신에 대한 이해를 향상 환자 결과를 향상시킬 수있는 새롭고 흥미로운 치료 대상 향상된 전략을 제공 할 수있다. 이 목표를 향해, 생체 내 및 생체 외 모델에서 여러 가지가 개발되어왔다. 생체 내 방법은 환자의 TME 더 반사하지만, 그들은 내 종양 사이에 모두 엄청난 복잡성과 이질성을 포함한 한계를 가지고있다. 또한, 피험자의 종양 샘플은 종종 매우 TME 개발 대표하고 TME 개시 이벤트에 대한 이해를 허용하지 않는다. 실험 동물 연구 때문에 그 풍모의 차이 그러나 인간에게 동물 데이터의 일반화가주의해야합니다 몇 가지 장점을 제공합니다같은 설치류 (예를 들어, 티올 화학 (20), 신진 대사 속도 (21), 관용 등, (22)을 강조하는)와 같은 인간과 동물 사이의 ology. 또한, 자연의 유전자 유형이있는 인구는 달리, 실험 동물은 일반적으로 동질성을 사육하고 있습니다. 또한, 일시적인 생리 학적 변화 및 ​​세포 표현형의 변화를 조사 할뿐만 아니라 설치류 동물을 사용하는 실험의 특정 매개 변수를 제어하는​​ 것이 곤란하다. 따라서, 체외 2- 및 3- 차원 (2D 및 3D) 조직 배양 모델에서 자주 TME 개발의 기본적인 이해를 전진하는 데에 이용된다. 생체 시스템의 복잡성을 정확하게 묘사의 부족에도 불구하고, 이러한 모델은 매우 기계적 조사를 용이 장점을 제공한다. 관내 모델은 TME보다 단순화 집중하고 비용 효과적인 분석을 위해, 이에 유의 허용 데이터가 생성 될 수있다동물에서 발생하는 전신 변동이없는 세포. 체외 시스템의 여러 종류가 있습니다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 TME 체외 모델은 혼합 단층 또는 회전 타원체 세포 배양으로 구성되어 있습니다. 두 배양 방법은 세포 간 상호 작용과 각종 TME 특정 세포 표현형 변화를 분석 (종양 세포 예를 들어, 정상 세포)의 기초 연구에 유리하다 (예를 들면, 정상 섬유 아세포에서 암과 관련된 섬유 아세포의 출현). 또한, 구 상체는 TME보다 반사 형 조직 구조를 만들 수 있고, 종양 이질성 (23)을 대표 할 수있다. 그러나 타원체는 종종 실험의 결론 (24)를 복잡하게 할 수있다 층에 걸쳐 매우 다양한 산소 장력 구배를 생산하고 있습니다. 불행하게도, 두 모델은 매우 코 아래의 추가 특성화 및 연구를위한 순수한 세포 집단을 분리하는 능력에 제한이문화. 이렇게 형광 태그 또는 머신 식별 표지 한 후 세포 집단을 분리 정렬 광범위한 프로세싱 셀에 공 배양을 행하여 혼합되도록 적어도 하나의 세포 유형을 필요로 할 수있다. 셀 소터는 다소 순수한 세포 집단을 분리 할 수 있지만, 하나는 세포 스트레스 및 전위 미생물 오염을 인식 25 위험이어야한다. 간 통신의 이해를 용이하게하기 위해 많은 노력과 개발 간략화 된 방식을 허용하면서 밀접 생체 내 환경을 모방 한 시험 관내 시스템에서 최적화 향해 헌신되었다. 그러한 도구는 투과성 미다 삽입, 제 1953 26 개발이어서 다양한 애플리케이션 및 연구 (예를 들어, 셀의 극성 (27), 엔도 시토 시스 (28), 약물 수송 29 티슈 모델링 30 FERT 적응 된 막 기판ilization 31 방관자 효과 32, 33 등). 이 시스템은 불 침투성 plasticware에 때 배양 관찰되지 않은 34, 35 마커 생체 내에서 많은 사람들의 생체 -like 해부학 적 및 기능적 분화와 세포의 성장뿐만 아니라 표현을 허용한다. 또한, 매우 얇은 다공질 막 (10 μm의 두께)의 생체 내 환경을 시뮬레이트 모두 꼭대기 및 기저 세포 영역에서 독립적으로 세포 기능을 허용 분자 평형 시간의 신속한 확산을 허용한다. 멤브레인의 기공을 통해 간 다양한 통신 모드를 유지하면서 TME 시스템으로 삽입 효용의 추가적인 장점은 동일한 환경 조건에서 멤브레인의 양측 상에 성장 개의 이형 세포 집단의 물리적 분리된다. 비록 물리적으로 분리 된 두 세포 집단은 대사 드로 분비 소자를 통해 접속되며또한 갭 접합부 채널을 통해, 여기 스크라이브. 또한, 생체 부분 산소 장력의 인서트 (PO 2)를 유지함으로써,이 모델은 다른 시스템들에서 관찰 된 산소와 화학 구배의 합병증을 감소시킨다. 오히려, 그것은 자연 TME 제어 메커니즘에 대한 이해를 증가시킨다. 특히, 두 세포 집단 쉽게 공 배양 장기간 다음 형광 태그 및 / 또는 세포 소팅 않고 고순도로 분리 할 수​​있다. 여기서 우리는 멤브레인 기공을 통해 지속적인 양방향 통신 아직 인간 유방암 세포 투과성 미다 공막 인서트의 양쪽에 각각 자란 인간 섬유 아세포 이루어지는 관내 TME 프로토콜을 설명하지만. 우리는 그 표시 발달로 다양한 기공 크기와 간 통신의 특정 유형의 기여 (간극 연접 비교 예 분비 인자) 막을 사용하여TME으로 조사 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;For Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt;, AG1522) human diploid fibroblast</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passage 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>Parental line: ATCC (#HTB-26)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&#039;s minimal essential medium (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt;, permeable microporous membrane insert) (0.4 &amp;mu;m pore)</td><td>Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt;, permeable microporous membrane insert) (1 &amp;mu;m pore)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt;, permeable microporous membrane insert) (3 &amp;mu;m pore)</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>6-well Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; cell culture flask</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>without calcium &amp;amp; magnesium</td></tr><tr><td>0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge Tube</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Cell Culture Dish</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Immunofluorescent Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; Immunofluorescence - 1:5,000</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; Immunofluorescence - 1:2,000</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin - Fraction V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>Immunoglobulin and protease free</td></tr><tr><td>16% (wt/vol) Formaldehyde Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Dilute to 4% with 1x PBS</td></tr><tr><td>Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)</td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Flow Cytometric Analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM</td><td>Molecular Probes</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Western Blot Analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1,000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane (0.2 &amp;mu;m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Protein Assay</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

a mimic of the tumor microenvironment: a simple method for generating enriched cell populations and investigating intercellular communication

암세포와 주위의 비 - 암성 기질의 초기 이형 작용을 이해하는 것은 실질 활성화 및 종양 미세 환경 (TME) 설립 이어지는 이벤트를 아는데 중요하다. 시험 관내 및 생체 TME 모델 일부는 개발되었다; 그러나, 일반적으로 이러한 모델 용이 추후 연구 비 교란 조건 하에서 각각의 세포군의 분리를 허용하지 않는다. 이러한 어려움을 회피하기 위해 연장 된 공동에 대한 인서트의 멤브레인의 양측에 개별적으로 밀접 성장 고도로 농축 된 세포 집단의 단순 생성하면서도 허용하는 투과성 미다 공막 인서트 이루어진 세포 성장 기판을 이용한 시험 관내 TME 모델을 채용 한 - 문화 회. 이 모델의 사용을 통해, 우리는 정상 이배체 인간 섬유 아세포에서 (CAF) 인구는 다음과 같은 매우 풍부한 암 관련 섬유 아세포를 생성 할 수있다형광 태그 및 / 또는 셀의 정렬을 사용하지 않고 높은 전이성 인간 유방암 세포와 공 배양 (120 시간). 또한, 삽입물의 기공 크기를 조절함으로써, 우리는 개발 근본적인 메커니즘의 조사를 허용하는 두 개의 이형 세포 집단 사이 간 통신 (예를 들어, 갭 정션 통신 분비 인자)의 모드에 대해 제어 할 수있다 갭 접합 투과성의 역할을 포함 TME. 이 모델은 암 기질 개시의 TME의 초기 진화 및 치료제에 대한 암세포의 반응에 기질의 조절 효과로 이어지는 초기 사건에 대한 우리의 이해를 높이는 데 유용한 도구 역할을한다.

여기서 우리는 생체 내 종양 미세 환경 (도 1)를 모방 한 시험 관내 이형 세포 공 배양 시스템을 개발하는 투과성 미다 공막 인서트 장치. 서로 다른 세포 집단은 (유스에서는, 120 시간 이하) 장시간 동안 삽입물의 다공질 막의 양측에 성장 될 때까지 이러한 시스템은 허용한다. 0.4-, 1-, 3 M-세공 인서트의 윗면에 GFP 표지 된 MDA-MB-231 세포를 도금들이 ...

Watch this Scientific Journal Video about A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication at JoVE.com

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

a-mimic-tumor-microenvironment-simple-method-for-generating-enriched

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cancer Research

Cell Biology

Molecular Biology

Unit 1

Unit 2

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

10.2K 조회수.  Rutgers University. We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

비디오: A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

연구

암 연구학

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth factors and matrix-associated proteins in the microenvironment in vivo. Furthermore, readily available reagents for the modeling of microenvironments in vitro typically utilize complex mixtures of proteins that are incompletely defined and suffer from batch to batch variability. The microenvironment microarray (MEMA) platform allows for the assessment of thousands of simple combinations of microenvironment proteins for their impact on cellular phenotypes in a single assay. The MEMAs are prepared in well plates, which allows the addition of individual ligands to separate wells containing arrayed extracellular matrix (ECM) proteins. The combination of the soluble ligand with each printed ECM forms a unique combination. A typical MEMA assay contains greater than 2,500 unique combinatorial microenvironments that cells are exposed to in a single assay. As a test case, the breast cancer cell line MCF7 was plated on the MEMA platform. Analysis of this assay identified factors that both enhance and inhibit the growth and proliferation of these cells. The MEMA platform is highly flexible and can be extended for use with other biological questions beyond cancer research.

The purpose of the method presented here is to show how microenvironment microarrays (MEMA) can be fabricated and used to interrogate the impact of thousands of simple combinatorial microenvironments on the phenotype of cultured cells.

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

유세포분석 기반 암 면역 주기 모니터링 

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between cancer and immune cells, the so-called cancer-immunity cycle. In vitro co-culture systems combined with multiparametric flow cytometry (mFC) and tumor-on-a-chip microfluidic devices (ToCs) enable simple, fast, and reliable monitoring and characterization of each step of the cancer-immunity cycle and lead to the identification of the mechanisms responsible for tipping the balance between cancer immunosurveillance and immunoevasion. A thorough understanding of the dynamic interplays between cancer and immune cells provides critical insights to outsmart tumors and will accelerate the pace of therapeutic personalization and optimization in patients. Specifically, here we detail a straightforward mFC- and ToC-assisted protocol for unraveling the dynamic complexities of each step of the cancer-immunity cycle in murine cancer cell lines and mouse-derived immune cells and focus on immunosurveillance. Considering the time- and cost-related features of this protocol, it is certainly feasible on a large scale. Moreover, with minor variations, this protocol can be both adapted to human cancer cell lines and human peripheral-blood-derived immune cells and combined with genetic and/or pharmacologic inhibition of specific pathways in order to identify biomarkers of immune response.

암-면역 주기 모니터링 및 종양 미세환경 역학 탐구

Here, we detail a simple, fast, and reliable multiparametric flow cytometry- and tumor-on-a-chip-assisted protocol to monitor and characterize the steps constituting the cancer-immunity cycle. Indeed, a thorough understanding of the interplays between cancer and immune cells provides critical insights to outsmart tumors and guide clinical care.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

<meta charset="utf8"></head><body>미세생리학적 시스템을 이용한 신장암과 건강한 조직 공동 배양

Microfluidic Co-culture of Renal Healthy and Tumor Epithelium to Model Kidney Cancer Progression

Microphysiological systems (MPS) have enabled the introduction of more complex and relevant physiological elements into in vitro models, recreating intricate morphological features in three-dimensional environments with dynamic interactions lacking in conventional models. We implemented a renal cell carcinoma (RCC) co-culture model to recreate the cross-talk between healthy and malignant renal tissue. 
This model is based on the referenced multi-organ platform and consists of co-culturing a reconstructed renal proximal tubule with RCC spheroids. Custom-designed 3D-printed chambers were used to culture human renal epithelial proximal tubule cells (RPTEC) and facilitate their self-assembly into a renal tubule contained in a collagen type I matrix. Caki-1 RCC cells were embedded in an agar collagen matrix, subsequently forming cancer spheroids. Both collagen and agar/collagen gels were optimized to maintain their integrity during cyclic perfusion and withstand shear stress during a minimum culture period of 7 days. 
The gels also enable adequate nutrient supply and cell secretions. Moreover, the agar/collagen gels limit the overproliferation of RCC cells, ensuring relatively homogeneous spheroid size. The MPS chip microfluidic circuits comprise two independent culture chambers with the size of a standard 96-microplate well. The renal tubule and RCC gels populate separate chambers and share the same culture media, which is recirculated approximately twice per minute. Under these conditions, we observed upregulation of immune factor expression and secretion in the renal tubules (interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha). The renal tubules also shift their metabolic activity towards glycolysis under the influence of RCC. This novel approach demonstrates that a co-culture-based MPS can amplify the complexity of RCC in vitro and be employed to study the impact of cancer on non-tumor cells.

<meta charset="utf8"></head><body>신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

Here, we present protocols that detail instructions for implementing 3D cell cultures using collagen and collagen-agarose matrixes in a microphysiological system. These protocols support renal proximal tubule and renal cell carcinoma spheroids co-culture, simulating in vivo conditions and enabling advanced investigation of kidney cancer cell interactions.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

Microphysiological systems (MPS) have enabled the introduction of more complex and relevant physiological elements into in vitro models, recreating ...

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양