우리는 그의 전문 기술 지원에 대한 박사 하비 헨즐리 감사합니다. 동물 시설 및 스몰 애니멀 영상 시설의 실험실 :이 작품은 다음과 폭스 체이스 암 센터 (FCCC) 시설의 사용에서 이익. 이 작품은 FCCC / UPenn (P50 CA083638) FCCC 핵심 부여 (P30 CA006927)에서 난소암의 포자 및 난소 암 연구 기금에 의해 부분적으로 지원되었다.

난소 종양 세포 I. 준비 <ol><li> 문화 루시페라제을 표현하는 난소암 세포 라인을 성장. 루시페라제의 소스 반딧불, Renilla 또는 다른 종의 수 있습니다. 형광 단백질을 표현하는 세포도 사용할 수 있습니다. 이 예제의 경우 우리는 반딧불 루시페라제을 표현하는 난소암 세포 라인, OVCAR5를 사용합니다. </li><li> 일상적인 세포 배양 기술을 이용하여 수확 세포. </li><li> 칼륨의 세포 현탁액 (10,000 세포 / μL)는 사출 시간까지 얼음 호수 (PBS)를 버퍼 유지. </li></ol> II. Intrabursal 사출 이 절차는 두 사람의 도움이 필요합니다. 모든 수술 절차는 무균 조건 하에서 실시하고 있습니다. 이것은 수술 복장을 입고 및 무균 수술기구, 주사기 및 주사 바늘을 사용하여 포함합니다. <ol><li> 케타민을 염산염 (100 MG / ML), xylazine 염산염의 1.6 ML (100 MG / ML), acepromazine (10 MG / ML)의 1.5 ML, 그리고 0.9 %의 나트륨 염화물의 20 ML 3 ML을 혼합하여 마취 솔루션을 준비합니다. </li><li> 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. 8 선량 볼륨 ~ 9 ML / kg 체중 (BW)와 intraperitoneal (IP) 주입을 통해 준비 케타민을 - xylazine - acepromazine 마취와 동물을 마취. </li><li> 동물이 동물은 뒷다리 발톱에 포셉 또는 손가락으로 발가락 핀치를 수행하여 마취의 수용 일반 아래에 있는지 확인합니다. 페달 반응이있다면 동물이 프로 시저에 응답하기 전까지, 마취의 깊이 일반 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. </li><li> 머리가 떨어져 직면하고 꼬리가 당신쪽으로 향하게과 멸균 거즈 패드에있는 동물 등의 측면을하다. 절개의 요점은 난소 위의 왼쪽 또는 오른쪽으로 정중선의 및 위치하고 있습니다. 절개 지점에 70 % 알코올로 모피를 면도 또는 젖었어. </li><li> 포셉를 사용하여 침수 피부를 허용하고 dorsomedial 위치에 직접 난소 지방 패드 위에 가위로 작은 절개를합니다. 난소 지방 패드는 복막 벽의 표면 아래에 표시되어야합니다. 지방 패드 그것을 둘러싼 어두운 분홍색 조직 대조의 흰 색깔로 쉽게 알아볼 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 복막 벽을 라이닝을 리프트하고 위에 설명된대로 작은 절개 (5)합니다. </li><li> 절개에 인접한 정중선에 멸균 생리 젖었 거즈 패드를 놓습니다. 난소 지방 패드를 찾아 조심스럽게 그것을 꺼내와 거즈로 그것을 휴식. 불독 클립과 지방 패드를 고정하여 난소를 안정화. 해부 현미경, 위치에 따라 난소로 부르사 이어지는 수란관 가느다란 관 벤드으로 바늘의 삽입 (30 게이지, G)를 허용합니다. 바늘이 적절한 위치에 삽입하면, 그것은 부르사에 따라 표시되어야합니다. </li><li> 부드럽게 주사기가 주사 사이트에 위치하는 동안 부르사과 난소 사이의 세포 현탁액의 5 μL를 주입하는 주사기의 플런저를 밀어. 이 단계는 두 사람을 필요로합니다. 다른 사람이 바늘의 위치를​​ 유지하는 동안 한 사람이 플런저를 못살게 굴지. 찔린 사이트를 밀봉하기 위해 신속하게 바늘을 제거하지만 부르사와 가느다란 관의 분열 부드럽게 충분하지. 부르사 약간 적절한 주사와 함께 커지는 것으로 나타납니다. </li><li> 불독 클립에서 지방 패드를 출시하고 부드럽게 복막 구멍에 생식 트랙트 지방 패드를 다시 교체하십시오. 하단 안감을 통해 상부 복막 안감을 떼어하여 신체 벽을 부드럽게 닫습니다. 외과 스테이 플스 또는 부상 클립과 함께 피부를 닫습니다. </li><li> 다시는 케이지에 복구 동물을 장소와 저체온증 방지 및 복구 속도를 안전한 열원을 제공합니다. 호흡 속도와 용이성, 근육 톤의 반환하고, 자발적으로 이동할 수있는 능력을 모니터링합니다. 이러한 회복을 향해 진보의 좋은 지표입니다. 스테이 플스이나 상처 클립은 7 일 이상 게시 수술을 제거할 수 있습니다. </li></ol> III. 구강 Gavage 관리 <ol><li> 둥근 팁과 함께 18 ~ 20 G gavage 바늘이나 수유 튜브를 사용하십시오. gavage 바늘이 동물의 머리 끝부분에서 마지막으로 갈비뼈의 거리보다 더 이상이어야합니다. </li><li> 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. 엄지와 손가락으로 어깨를 통해 피부를 쥐고하여 부드럽게 아저씨 동물. 억제하는 방법의 각 측면과 밖으로 연장하는 포어 팔다리에 대한 충분 회사되어야합니다. 동물 바늘에서 파악하지 못할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 목을과 식도를 통해 직선을 형성하여 검지 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당기십시오. 엄지의 안쪽과 동물 등을 지원합니다. </li><li> 부드럽게하고 강제하지 않고, 입 양쪽에 있고 혀 위에 gavage 바늘을 삽입합니다. 단칼에에서 바늘은 입천장에 대한과 식도 아래로 통과해야합니다. 중력 회의 저항하지 않고 바늘을 안내합니다. 어떤 resistan가있다면CE는 바늘을 제거하고 다시 시작합니다. 동물의 개그와 삼키기 반사는 삽입하는 동안 발생 수 있습니다. 그러나, 저항이나 동물로부터 온다있을 수 없습니다. 동물이 바늘은 콧구멍과 가슴의 움직임을 선택하여 장소에있을 때 호흡 있는지 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 천천히 선량 볼륨을 하는걸 주사기의 플런저를 밀어. </li><li> 부드럽게 그것이 식도를 삽입했던 방법과 동일한 각도와 경로에서 gavage 바늘을 제거합니다. </li><li> 5 ~ 10 분 정도의 케이지와 모니터의 호흡과 행동으로 동물을 반환합니다. </li></ol> IV. VIVO 영상에서 우리는 intrabursal 캐비티에 주입 세포의 동작을 모니터링하는 칼리퍼 생명 과학을 사용합니다. 이 시스템을 사용하는 실험은 일반적으로 종양 이식의 시간에서 4 ~ 16 주간의 기간이 있습니다. <ol><li> 1 ML PBS에 5 ~ 20 밀리그램을 분해하고 살균을위한 0.22 μm의 막을 통해 필터링하여 D - luciferin (반딧불 루시페라제의 기판)의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 산소와 isoflurane 가스 모두에 회전에 의해 유도 챔버를 부과합니다. 단지 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 동물이 몇 군데 준비되기 전까지는 isoflurane 유량이 낮은 수준에서 관리하고 있습니다. </li><li> 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. isoflurane 가스 충전 유도 챔버에있는 동물을 놓으십시오. </li><li> 동물 anesthetized 것으로 나타납니다 때 챔버에서 동물을 제거합니다. 30 G 바늘을 사용하여 IP를 통해 사출 준비 luciferin 솔루션 200 μL를 제공합니다. 연구를 통해 luciferin 분사 및 이미징 성능 사이의 시간 일관성을 유지하기 위해 분사 시간을 기록하는 것이 중요합니다. </li><li> 유도 챔버에 luciferin - 주입 동물 돌려 놓으십시오. </li><li> 적절한 설정으로 이미징 시스템을 설정합니다. 최초의 동물 이미지를 인수하기 전에 시스템을 초기화해야합니다. </li><li> 유도 챔버에 가스 흐름을 끄고 이미징 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. </li><li> anesthetized 동물 지느러미 또는 복부 측면을 놓으십시오. 적절한 마취 유도를 유지하기 위해 코 콘에있는 동물들의 코를 배치해야합니다. 동물과 같이 녹색 조명으로 표시 &quot;이자 그리드의 시점&quot;이내에 있는지 확인하십시오. </li><li> 챔버의 문을 닫고 적절한 시간에 이미지를 획득. 시간은 동력학에 의해 결정하실 수 있습니다. </li><li> 이미징 챔버에서 동물을 제거하고 그 케이지에 돌려 놓습니다. &quot;Intrabursal 사출&quot;에 설명된대로 동물들의 복구를 모니터링합니다. </li></ol> V. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. orthotopic 마우스 모델에서 난소 종양 세포의 생체내 이미징에서. 루시페라제 표현 OVCAR5 세포는 바로 난소에 intrabursally 주입하고 시간이 지남에 따라 몇 군데 있었다. 이미지는 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 주사 후 13 일 (왼쪽), 17 일 (중간) 및 22 (오른쪽) 찍은. 도설 측면은 상단 패널에 표시하고 복부 쪽이 낮은 패널에서입니다. 참고 사출 다음과 같은 종양 세포의 복막 확산 22 일. 동물 실험 폭스 체이스 암 센터의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

난소암은 모든 gynecologic malignancies의 한 중 사망의 주요 원인이다. 이 질병의 높은 사망률은 늦은 진단하고 신뢰할 수있는 진단 방법 2의 부족으로 크게 때문입니다. 또한, 기존의 화학 요법은 종종 암 3 chemoresistance 및 재발 발생. 따라서, 소설 치료제가 효과적으로이 질병을 대상으로 필요합니다. 인간 난소암을 대상으로 새로운 치료의 개발에, 이것은 대표적인 동물 모델을 개발하는 것이 중요합니다. orthotopic 동물 모델은 metastases 일반적인 사이트 대표)는 2 종양 형성의 주요 사이트를 재현)는 1 기존의 이종 이식 모델을 통해 장점 (예 : 피하 또는 종양 세포의 intraperitoneal 주사)을하고 있으며, 3)은 종양 세포를 제공합니다 적절한 microenvironment 4, 5, 6, 7, 8과 상호 작용. 설치류는 난소와 주변 수란관과 함께 지속되는 독특한 bursal 멤브레인 있습니다. 설치류의이 독특한 해부학 orthotopically 난소 종양 세포의 주입을 허용합니다. Intrabursally 주입 난소 종양 세포는 따라서 intrabursal 멤브레인 내에서 성장과 종양의 진행으로 복막 구멍에 전파, 인간의 질병에 유사한 동작합니다. 세포 안정 표현 luciferases 또는 형광 단백질의 주입은 또한 실시간으로 종양 세포의 행동을 추적하실 수 있습니다. 발광 생물 및 / 또는 형광 이미징 기술은 가능한 시간과 비침습 방식으로 9, 10, 11에서 공부 종양의 성장, 유통, 그리고 회귀의 연장 기간 동안 반복적으로 종양 세포 이미지 수 있습니다. orthotopic 모델을 확립, 그것은 빠르게 주입시 부르사에서 바늘을 제거하는 것이 중요합니다. 돌발 바늘 물개 찔린 사이트의 제거 및 주입 세포의 누출을 방지합니다. 그러나, 동시에, 운동 부르사 찢어하지 부드럽게해야합니다. 누설은 주사하는 동안 발생하는 경우, 복부에 씨앗으로 세포를 일으킬 가능성이시기 상조가 난소 밖으로 확산 연구, 즉를 혼란시킬 수 있습니다. 이 경우, 특정 동물이 기록되어야하며 사전에 치료하거나 또는 이후 분석에서 제거하는 복막의 여러 종양 사이트의 발전을 위해 따라갔다. 전에 경구 gavage를 수행하기 위해, 그것은 동물의 머리의 끝에서 마지막 늑골을 측정하여 gavage 관의 길이를 확인하는 것이 중요합니다. 그것은 동물의 코에있는 튜브를 표시하는 도움이 마르크 지난 튜브를 전달하지 않습니다. 이 마크 지난 튜브의 삽입은 위장에 천공이 발생할 수 있습니다. 튜브의 길이를 결정하는 것은 20 세 미만 G. 무게 어린 동물 또는 동물과 특히 중요합니다 식도 아래 gavage 바늘의 삽입시, 동물의 저항이나 투쟁도 없을 것입니다. 이 환류로 이어질하고 이후 부정 확한 선량 볼륨을 제공할뿐만 아니라 동물에 스트레스를 추가 할 수처럼 그것은 너무 빨리 솔루션이나 정지를 관리하지 않는 것이 중요합니다. 수시로 비교 이미징 결과를 얻으려면, 그것은 루시페라제 기판 및 이미징의 주입 사이의 시간 일관성을 유지하는 것이 바람직하다. 시간 경과는 기판 주입 후 이미지의 시리즈를 복용하고 신호의 속도론을 관찰하여 결정하실 수 있습니다. 난소암, 약물의 경구 전달하고, 생체내 이미징에의 orthotopic 마우스 모델의 개발 개발 및 난소암의 확산의 더 나은 이해하고 궁극적으로이 치명적인 질환으로 환자의 결과를 향상시킬 수 있습니다 소설 치료 regimens을 평가 필요한 기술입니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

인간의 암 치료에 반응이 좋은 orthotopic 동물 모델로 표현됩니다. 본 논문은 난소암의 orthotopic 마우스 모델, 생체내 이미징 시스템에 사용 실시간으로 약물 치료에 대한 응답으로 종양 세포의 행동 구두 약물 전달 및 모니터링을 통해 암 치료의 발전을 설명합니다. 이 orthotopic 모델에서 루시페라제을 표현하는 난소 종양 세포는 각 난소가 포함되어 있습니다 마우스 부르사에 직접 주사하여 몸에 붙이기도 적용됩니다. D - luciferin, 반딧불 루시페라제의 기판의 주사시, 루시페라제 - 표현 세포 bioluminescence 신호를 생성합니다. 이 신호는 생체내 이미징 시스템에 의해 감지하고 개별 동물에 종양의 성장, 유통, 그리고 회귀 모니터링의 비침습 방법을 허용합니다. 구두 gavage를 통해 약물 관리 10 ML / 위장에 직접 전달하는 kg의 체중의 최대 먹이지 볼륨을 허용하고 긴밀하게 임상 치료에서 약물 전달 유사합니다. 따라서, 기술, 여기에 난소암, 약물의 경구 전달하고, 생체내 이미징에의 orthotopic 마우스 모델의 개발을 설명하는 인간의 난소 암 치료 이해하는 데 유용합니다이 질병을 대상으로 향상됩니다.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해 감시<em&gt; 생체내에</em&gt; 이미징 시스템입니다.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

대장암의 Orthotopic 마우스 모델

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

연구

생물학

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

이미징에서 스텐트 - Restenosis : 저렴한, 신뢰성 및 빠른 잠복기 모델

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

mtHyper7을 사용한 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 과산화물 이미징

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 연구의 발전 - 세포 내 분석을 위한 mtHyper7 바이오센서 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...