Name: flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
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The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

참고 :이 프로토콜은 이차 항체를 표지 된 베팅 1 절, 주요 자작 나무 꽃가루 항원 성분, 플러스 알로 피코 (APC)에 대한 단클론 항체와 PM10 입자의 간접 염색 (단일 클론 마우스의 IgG1 항체, 클론 MA-3B4)에 대해 설명 (항 - 마우스의 IgG1 항체, 클론 A85-1) 및 유세포 분석에 후속. 적절한 다른 가능한 항체로,이 방법은 대기 입자에 결합 된 다른 항원의 검출로 확장 될 수있다. 1. PM10 샘플링 <ol><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)의 외기로부터 PM10 수집 2.3 m 3 / 시간 (도 1)의 유량을 갖는 저 부피 샘플러를 사용하여 필터링한다. 여기서 설명하는 실험에 사용되는 샘플러의 특성 (16)에서 발견된다. 시간을 실행하면 필요한 PM10의 양 (보통 사이 일 10 일)에 따라 달라집니다. </li><li> 배양 시간의 끝에서, 샘플러에서 필터를 제거하고, 그것을 동결-20 ° C까지 사용. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> 그림 1. 낮은 볼륨 PM10 샘플러. 낮은 볼륨 PM10 샘플러의 예. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. PM10 제거 및 입자 수 <ol><li> 약 5 분 동안 PTFE 필터 해동을 할 수 있습니다. 그런 다음, 깨끗한 폴리스티렌 페트리 접시 (그림 2A)에 필터를 넣어. 하나 이상의 필터가 처리 될 경우, 각 필터에 대한 새로운 배양 접시를 가져 가라. </li><li> 다음에, 인산 완충 용액 (PBS)와 PTFE 필터를 중첩. 이 프로토콜을 8x10 ml의 당 6 입자의 최종 농도 PM10 설립된다 (단계 3.3 참조). 적어도 그 농도를 얻기 위해 필터와 오버레이 PBS 다음 경험적 볼륨을 사용하여 다음 PM10 콜렉션 시간 이었다면 &lt;<html> 2 일, 2 ml에 사용합니다. 배양 시간 ≥2 일 동안, 4 ml에 사용합니다. 주 :이 적절한 경우 PM10 현탁액의 입자 농도를 증가시키기 위해, 다른 필터의 현탁액 풀링 될 수있다. </li><li> 1 분 동안 민감한 브러쉬 헤드 (도 2B, 2C)와 전기 칫솔 핀셋과 브러시로 PTFE 필터를 잡으십시오. 깨끗한 반응 관에, 입자-PBS-서스펜션, 이하라고 PM10 현탁액을 전송합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> 전기 칫솔도 2 PM10 제거. 샘플링 PM10과 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 필터는 폴리스티렌 배양 접시 (A)에 배치되고, 4 ml의 PBS로 중첩된다. 그런 다음, PM10은 전기 칫솔로 제거 (B : 1 분 동안 칫솔질 후 : 닦고 C 전).= &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="4"><li> 입자 계수기를 이용하여, 예 PM10 입자의 농도를 측정한다. , PM10 현탁액 10 ㎖ 측정 등장 완충액 50 μL 같은 적절한 부피를 희석 세 번 측정 용액 당 입자의 평균 수를 계산한다. 해당 크기의 입자를 검출 할 수있는 입자 계수기를 사용하십시오. </li></ol> 3. 베팅 1 절 염색 <ol><li> 시료의 분석에 필요한 반응 튜브의 수를 계산하는 적어도 세 개의 반응 튜브가 요구된다 : (Ⅰ) 시료 만 (기본 제어) 한 튜브 샘플 플러스 이차 항체 (대조군)과 (ⅱ) 하나의 튜브 및 ( ⅲ) 샘플 플러스 일차 및 이차 항체 (특정 샘플) 하나의 튜브. 처음으로 측정 된 경우, (ⅰ) 적어도 두 개의 반응 관을 준비 (II),및 (iii) 적절히 설정 사이토 조정하기에 충분한 재료를 갖고 (단계 4.1 참조). </li><li> 반응 튜브의 수에 필요한 PM10 현탁액의 양을 계산한다. 각각의 반응 관은 현탁액의 50 μl를 필요로한다. </li><li> PBS를 적당량 첨가하여 용액 당 8x10과 6 입자의 최종 농도는 단계 3.2에서 계산 된 현탁액의 볼륨 단계 2.4에서 측정 된 입자 농도를 조정한다. 참고 :이 프로토콜에 대한 갓 준비 PM10 서스펜션을 권장하지만 나머지 PM10 현탁액, 미래의 실험 -20 ° C에서 동결 할 수있다. </li><li> 블록 예컨대 1 % BSA를 PBS로 제조 원액을 사용하여, 0.02 %의 최종 농도로 우 혈청 알부민 (BSA)과 PM10 현탁액을 보충하여 비특이적 결합. 소용돌이 간략하고 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 각 샘플은 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 경우, 교류 단계 3.4에서 서스펜션의 50 μl를 전송린 반응 관. 간단히 특정 염색 와류 대해 지정된 반응 튜브에 0.02 μg의 / μL 최종 농도 내기 V 1에 대해 모노클로 날 마우스 항체를 첨가하고 실온에서 60 분 동안 배양한다. <ol><li> 기본 대조군과 음성 대조군은 또한 실온에서 60 분 동안 체류에 지정된 PM10-BSA 서스펜션 반응 튜브하자. </li></ol></li><li> PBS가 실온에서 5 분 동안 4,700 XG에서 샘플이어서 각 반응 관 와류 간단히 원심 0.02 % BSA로 보충 된 500 μl를 첨가하여 모든 샘플을 세척한다. 진공 펌프를 이용하여 조심스럽게 상층 액을 제거한다. </li><li> 단계를 반복 3.6. </li><li> PBS는 반응 관 당 0.02 %의 BSA와 보충 50 μL에 녹인 1 μg의 항체 : 필요 APC 표지 보조 안티 - 마우스의 IgG1 항체의 총량을 결정합니다. 0.02 %의 BSA로 보충 PBS의 각 볼륨 항체의 적절한 양을 희석. </li><li> 기본 제어를 위해 지정된 반응 관을 제외한 모든 반응 튜브로 희석 차 항체의 50 μl를 추가합니다. PBS는 0.02 % BSA로 보충 된 50 μL와 후자를 보완. 소용돌이 몇 초 동안 모든 샘플. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 모든 샘플을 품어. </li><li> 단계를 반복 3.6 배. </li><li> 각각의 반응 관, 소용돌이에 50 μl의 PBS를 추가하고 흐름 cytometer에 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 유세포 분석 <ol><li> 매개 변수 사이토 다음, 기본 컨트롤을 조정 사용하여 데이터 분석을 최적화 할 수 있습니다. <ol><li> 디바이스 제어 보드에 표시되는 전방 산란 (FSC) 임계 컨트롤러를 이용함으로써, 낮은 값 (200)에 FSC 임계 값을 설정하고, 분석을 시작한다. </li><li> 캐터 전압 제어기를 사용함으로써, 모든 PM10 입자를 검출 할 수 있도록하는 방식으로 FSC 및 측방 산란 (SSC)를 조정하여 입자 집단은 일 대략 위치하도록금감위 축 및 SSC 축의 아래쪽의 E 중간. </li><li> 형광 전압 제어기를 사용함으로써, APC 전압이 필요한 경우, APC와 같은 동일한 파장에서 방출하지 않는 형광 염료 (FITC)와 같은 다른 형광 전압을 조정한다. 모든 입자는 모두 형광 축의 하단에 볼 수 있습니다 것을 확인하십시오. </li></ol></li><li> 연속적으로, 기본 컨트롤을 포함하여 각 샘플을 검사하고 샘플 당 최소 10,000 입자의 FSC, SSC, APC 및 FITC 데이터를 저장합니다. </li><li> 각각의 소프트웨어와 데이터를 평가합니다. 특정 시료에 흡착 된 항원의 콘텐츠는 두 가지 방법으로 정량화 할 수있다 : <ol><li> 모든 PM10 입자 위에 내기 V 1 하중 계수로서 모든 입자 (중앙값)의 APC 형광 강도를 분석한다. 참고 : 특정 샘플이 알레르기 항원을 포함하는 경우, APC 형광 강도가 대조군에 비해 특정 샘플 증가한다. 한편, 다른 불소escence 강도 (예., FITC 형광 강도)를 크게 변경하지 않아야합니다. </li><li> 바운드 안티 내기 1 절 항체 PM10 입자의 비율을 계산합니다. 이에 따라, 음성 대조군에 복사하여 특정 샘플에이 문을 붙여 특정 샘플에서 APC 긍정적 인 입자의 비율에서 대조군에 APC 긍정적 인 입자의 비율을 빼기, APC는 긍정적 인 생각 입자 주위에 게이트를 설정합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

프로토콜의 중요한 단계는 대기에서 PM10 입자의 수집을위한 적절한 필터를 사용하는 것이다 (단계 1.1 참조). 필터는 전기 칫솔 칫솔질 견딜만큼 튼튼해야하고, 모든 필터 재료는 이러한 요건을 충족. 염색 프로토콜 ml의 당 8x10과 6 입자의 PM10 입자 농도가 설립되었다. 재료가 제한되고 샘플 풀링 적절하지 그러나 경우, 메소드는 아마 잘 작동되지만, 항체 농도가 조절 될 수있다 (단계 3.5 및 3.8 참조). PM10 입자의 베팅 1 절 염색 긍정적 및 부정적 스테인드 입자의 별개의 집단 발생하지 않았다. 이것은 최대 아주 작은에서 많은 양에 이르기까지 입자의 각 흡착 내기 V 1 알레르기 항원의 다양한 양의에 의해 발생 될 수 있습니다. 이는 따라서 인구를 향해 시프트 APC 신호의 확장을 초래할 수APC 양성. 모든 입자의 평균 APC 형광 강도를 측정하여 (I)의 상대적인 정량 : 그것은 음의 입자의 양을 분리하는 것이 곤란하기 때문에, 두 개의 정량 방법은 PM10&gt; 0.5 시험편 배팅 V 한 내용의 차이를 결정하기 위해 사용 된 및 (ⅱ) APC 대상 입자의 비율을 결정하는 단계를 포함한다. 저 높은 꽃가루 시즌 PM10&gt; 0.5 입자의 베팅 1 절 부하에 대해서는 두 방법 모두 비슷한 결과를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이 때문에 게이트를 배치의 독립과 같이 아직도, 모든 입자의 평균 형광 강도에 의해 상대 정량을 권장 아마 덜 오류가 발생하기 쉬운. 지금까지 많은 연구 ELISA 5,12-14,17와 각각의 알레르겐과 이후의 정량화를 추출하여 대기 입자상 물질의 알레르기 항원 함량을 검사합니다. 여기에 기술 된 절차와 quantificatio 간의 기본적인 차이가N ELISA에 : 유동 세포 계측법은 입자 - 결합 된 항원을 분석하면서 ELISA는 추출 용해 항원 정량화. ELISA를 통해 테스트 PM10 샘플의 BET V 1 부하 (N = 8) 1.2 ng를 / ㎖의 검출 한계 미만이었다 (데이터는 보이지 않음). 마찬가지로, Buters 등은 PM &lt;2.5 μm의 분수와 10 μm의에서 약 7 %&gt; PM&gt; 2.5 μm의 일부지만, PM 대기 13&gt; 10 μm의 비율에 93 % 이상에 더 베팅 1 절을 확인하지 않습니다. 한편, 다른 한편으로는 FACS 분석에 대한 ELISA의 대조 결과를 발산 감도와 결합 검출 방법의 차이에 의해 야기 될 수있다. 또한 연구 그러나 완전히 차이를 이해하는데 필요하다. 방법은 입자 - 결합 항원은 전자 현미경을 스캔 10,14 시각화된다. 전자 현미경을 스캔하여, Ormstad 외. 부유 입자 매트의 표면 상에 가시 내기 V 1r에 매연 입자는 높은 꽃가루 시즌과 낮은 꽃가루 시즌 15 샘플 입자에 조금 적게 샘플링. 또한, 화분, 라텍스, 또한 β 글루칸에서 알레르겐은 대기 (10)에서 연소 된 입자에 흡착되는 것으로 밝혀졌다. 그러나,이 방법은 입자 - 결합 항원의 정량화를 허용하지 않는다. 유동 세포 계측법을 사용하여, 입자 결합 내기 1 절 알러지 유발 물질은 정량 할 수있다. 따라서, 한편으로 다른 적절한 항체로 PM10의 10-0.5 μm의 생물학적 부분을 특성화하는 새로운 방법을 제공 할 수 유세포,이 방법은 대기 입자, 예를 들면, 곰팡이, 진드기의 다른 항원의 검출로 확장 될 수도 알레르기 또는 LPS. PM10 입자를 아주 쉽게 또한 화학 및 금속뿐만 아니라 생체 물질을 흡착하지만 같이, 항체의 비특이적 결합하지만, 문제를 제기 할 수있다. 새로운 항체를 시험하는 경우 중요한 단계는 특정 바인딩을 증명하는 것이다ING. 이것은 11 염색 전에 대응하는 항원과 특이 적 항체의 결합을 차단하는 능력, 예를 들어, 수행 될 수있다. 14, 18를 계산 내기 V로 주변 공기의 한 내용이 자작 나무 꽃가루 수 12,13,18과 다를 수 있습니다, 알레르기 증상은 아마도 꽃가루보다 알레르기 수준이 더 상관 관계가 있습니다. 따라서, 임상 데이터와 함께 제시된 방법은 자작 나무에 알레르기 반응이 PM10&gt; 0.5의 베팅 1 절 알레르겐 부하에 해당하는지 여부 미래의 실험에서 검사 할 수 있습니다.

대기 오염은 최근 수십 년간 1-3에서 관찰 호흡기 알레르기의 증가 빈도와 심각도의 중요한 환경 적 원인으로 간주되고있다. 또한, 먼지 4,5 일반적인 알러지 유발 물질의 분포에 대한 관심이 있었다. 자작 나무 꽃가루는 꽃가루 알레르기를 유발 할 수 있습니다뿐만 아니라 알레르기 성 천식 6-8의 중요한 트리거 할 수 있습니다. 항목 자작 나무 꽃가루 하부 호흡기를 입력 또는 크기 (직경 22 μm의)의 결과로서 PM10에서 발견 될 가능성이 없다. 그러나 베팅 1 절, 주요 자작 나무 꽃가루 알레르기 성분, 같은 자작 나무 꽃가루 알레르기는 꽃가루 파열 구 이후에 출시 될 수 있으며, 하부 호흡기기도를 따라서 가능, 대기 입자 (10)에 결합 입력 할 수 있습니다. 실제로,이 꽃가루 알레르기 proband (11) basophiles의 체외 활성화에 의해 입증 된 바와 같이 PM10은 생물학적 활성 알레르기가있는 것으로 나타났다 </suP&gt;. PM10 샘플에 베팅 1 절 알레르기 항원 함량은 ELISA 12-14로 각각의 알레르겐과 이후의 정량화를 추출하여 연구되어왔다. ELISA 법으로 용해 알레르겐을 측정했지만, 알레르겐 - 로딩 된 입자의 양이 아직 알려지지. 주사 전자 현미경은 알레르기로드 입자를 밝혀 있지만, 정량 10, 15를 허용하지 않았다. 이 연구는 주변 공기 샘플에 베팅 1 절로드 PM10 입자의 비율을 정량화하는 유동 세포 계측법 사용한다. 유량의 검출 한계로 인해뿐만 초과 0.5 μm의 조사가 가능 입자 사이토. PM10의&gt; 0.5 μm의 비율은 더 PM10으로&gt; 0.5로 언급 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>Teflon filter</td><td>Pall Life Sciences, USA</td><td>R2PL047</td><td>47 mm, 1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>low volume sampler</td><td>Sven Leckel Ingenieur B&amp;uuml;ro GmbH, Germany</td><td>LVS3</td><td>air flow of 2.3 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;/hr</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Biochrom, Germany</td><td>L1825</td><td>without Ca/Mg, low endotoxin</td></tr><tr><td>electrical toothbrush&amp;nbsp;</td><td>Braun, Germany</td><td>Oral-B Vitality Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>Casy cell counter&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System GmbH, Germany</td><td>Model TTC</td><td>range of detectable particle size: 0.7 &amp;micro;m to 45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td></tr><tr><td>FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>3-laser, 8-color (4-2-2)</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva Software v6.1.3&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td><td>Indoor Biotechnologies, UK</td><td>&amp;nbsp;MA-3B4</td><td>clone MA-3B4</td></tr><tr><td>APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>560089</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>SPSSTM software version 18&amp;nbsp;</td><td>PASW Statistics 18, Hongkong, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Gosselin, France</td><td>BP50-02</td><td>D 55&amp;nbsp;mm, H 15&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>FACS Tube&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>REF 352054</td><td>5 ml Polystyrene</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche&lt;br/&gt; Germany</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Blank Tubes</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>4140</td><td>1.4 ml, PP</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Heraeus, Thermo Scientific</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td><td>Model 158 320</td><td>Inetrgra Vacusafe</td></tr><tr><td>recombinant Bet v 1a antigen&amp;nbsp;</td><td>Indoor Biotechnologies, UK</td><td>LTR-BV1A-1</td><td>Concentration: 2.0 mg/ml</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

유동 세포 계측법은 널리 0.5 직경 수십 ㎛을 크기 범위에있는 세포 또는 박테리아 등의 현탁 물질을 정량화하기 위해 사용하는 방법이다. 전방 및 측방 산란 특성의 특성에 더하여, 그 각 구성을 검출하기 위해 항체와 같은 형광 표지 마커의 사용을 가능하게한다. 간접 항체 염색법을 사용하여, 자작 나무 꽃가루 알레르기를 정량화하기 위해 세포 계측법 여기에 사용된다 흐름 흡입 입자상 물질 (PM10, 입자 크기 직경이 ≤10 μm의)에 직경 0.5 μm의 10의 입자를 -loaded (정확하게 1 절 내기). 흡착 알러지 유발 물질의 운반 가능성이 그들이 알레르기 반응을 트리거 할 수있는 하부 호흡기, 그들을 수송으로 PM10 입자 작용할 수있다. 지금까지 PM10의 알레르겐의 함량은 효소 결합 면역 분석법 (ELISA를) 주사 전자 현미경을 이용하여 연구되었다. ELISA는 입자를 용해하지 측정-bound 알레르겐. 알레르겐 - 로딩 입자를 시각화 별도로이를 정량화 할 수있다 유세포 수 사형 전자 현미경에 비해. 주변 공기의 알레르기 항원 함량은 자작 나무 꽃가루 카운트에서 벗어날 수 있듯이, 알레르기 증상은 아마도 꽃가루 개수보다 알레르겐 노출 더 상관 관계가 있습니다. 임상 데이터와 함께, 제시된 방법은 알레르기 반응 꽃가루 항원이 PM10 입자&gt; 0.5 μm의의 베팅 1 절 알레르기 콘텐츠와 관련된 자작 나무할지 여부를 미래의 실험에서 테스트 할 수있는 기회를 제공합니다.

PM10&gt; 0.5 입자에 베팅 1 절 알레르기 흡착는 사이토의 흐름에 간접적 인 항체 염색 및 후속 분석에 의해 정량 하였다. 높은 꽃가루 시즌에서 PM10 샘플 템플릿을 역임. 단계 3.1에 기재된 바와 같이, 음성 대조군은 이차 항체를 전용 (도 3a)에 표시된 APC 배양 PM10 입자로 이루어져 있었다. 안티 베팅 1 절 항체 플러스 이차 항체로 염색 PM10 입자는 알레르기로드 입자 (그림 3B)를 표시. 단계 4.3에 기재된 바와 같이, 알레르겐 부하를 정량화하는 두 가지 방법을 사용 하였다 : 한편, 모든 입자의 APC 형광 강도 중앙값은 특정 샘플의 대조군 대 (137) 및 (904) 인 분석 하였다. 한편, 결합 된 항 - 내기 V 1 항체와 입자의 백분율을 측정 하였다 : 게이트는 음성 대조군에서 APC 대상 입자 주변에이어서 하였다 CO얼룩덜룩 및 특정 샘플에 붙여. 음성 대조군으로, PM10&gt; 0.5 입자의 3 %가 APC 양성으로 간주 하였다. 가양 입자의이 비율은 따라서 77.5 %의 APC 긍정적 인 PM10의 결과로 특정 샘플에서 긍정적 인 입자의 비율&gt; 특정 샘플에서 0.5 입자에서 제외되었다. 관찰 방지 베팅의 결합 1 절 항체가 특정 것을 증명하기 위해, 결합 용량은 염색하기 전에 해당 항원과 차단되었습니다. 베팅 1 절 긍정적 인 PM10&gt; 0.5 입자 (그림 3C)의 비율에 의해 정량화 경우, APC의 형광 강도에 의해 정량화, 84 %의 경우는 69 %로 반 내기 1 절 항체의 결합을 감소. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> 그림 3. 입자 바인딩 1 알레르기가 높은 포에서 PM10 샘플의 유동 세포 계측법. APC의 형광 강도에 의해 가시화 될 수있다 내기 V단지 APC로 염색 llen 시즌, 그리고 재조합 내기 1 절 항원 차 항체를 차단 한 후 이차 항체 (B)에 표시된 항 내기 V 1 차 항체 및 이후 APC와 염색 차 항체 (A)를 표지 (C ). 게이트 P의 APC +는 APC의 긍정적 인 생각 입자의 주위에 설정된 (빨간색으로 표시) 및 각각의 비율이 주어진다. 이 수치가 약간 (11)에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이 방법은 높은에서 낮은 꽃가루 시즌 PM10&gt; 0.5 시료의 흡착 내기 1 절 내용의 양의 차이를 나타 내기 위해 채택 할 수 있는지 여부를 테스트하려면 높은 13 PM10 샘플과 낮은 꽃가루 시즌 6 PM10 샘플을 분석 하였다. 그림 4은 APC 형광 강도 및 베팅 1 절 긍정적 인 PM10&gt; 낮은 꽃가루 시즌 PM10 샘플에 비해 높은 꽃가루 시즌 PM10 샘플의 0.5 입자의 비율에 유의 한 차이를 보여줍니다. 두 정량화 방법은 이에 유사한 결과를 보였다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> 저 높은 꽃가루 시즌 그림 4. PM10 샘플 (1. 낮은 꽃가루 시즌 PM10은 가을 / 겨울 2013 년 표본 (N = 6), 높은 꽃가루 시즌 PM10 5 월 2012 2013 년 한 흡착 내기 V의 자신의 양에 차이가 N = (13)). (A) PM10의 APC 형광 강도&gt; 높은 꽃가루 시즌 0.5 입자는 낮은 꽃가루 시즌 (평균 / 최소 / 최대 높은 꽃가루 시즌보다 훨씬 높았다 : 796/313/1097, 평균 / 최소 / 최대 낮은 꽃가루 계절 : 197 / 277분의 85). (B) PM10 높은 꽃가루 시즌 significan 포함낮은 꽃가루 시즌 PM10보다 TLY 더 내기 1 절 양성 PM10이&gt; 0.5 입자 (평균 / 최소 / 최대 높은 꽃가루 시즌 : 45.2 / 18.5 / 74.5, 평균 / 최소 / 최대 낮은 꽃가루 계절 : 11.8 / 4.4 / 19.8). 박스 플롯은 각각 중간 값 (박스의 내부 선), 25 및 75 백분위 수 (박스의 하부 및 상부 테두리)과 최소값과 최대 값 (수염)를 보여줍니다. *** 낮은 꽃가루 시즌 대 P &lt;0.001, 맨 휘트니 U 테스트. 이 수치가 약간 (11)에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

여기서는 유동 세포 계측법에 의해 알레르겐 - 로딩 입자를 정량 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 주변 미립 입자 흡착 알레르겐의 담체로서 작용할 수있다. 우리는 유동 세포 계측법, 방법은 널리 직경이 0.5㎛가 이러한 알레르겐 - 로딩 입자를 측정 할 수있다&gt; 부유 물질을 특성화하는 데 사용 여기 나타낸다.

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K 조회수.  Federal Environment Agency.  여기서는 유동 세포 계측법에 의해 알레르겐 - 로딩 입자를 정량 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 주변 미립 입자 흡착 알레르겐의 담체로서 작용할 수있다. 우리는 유동 세포 계측법, 방법은 널리 직경이 0.5㎛가 이러한 알레르겐 - 로딩 입자를 측정 할 수있다> 부유 물질을 특성화하는 데 사용 여기 나타낸다. 

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

연구

생체공학

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

알레르기 항원 유도 천식의 Murine 모델

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

면역학 및 감염병학

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

구성 및 다른 환경 조건에서 Bioaerosols의 유통 분석

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

환경과학

Visualizing Field Data Collection Procedures of Exposure and Biomarker Assessments for the Household Air Pollution Intervention Network Trial in India

Here, we present a visual representation of standard procedures to collect population-level data on personal exposures to household air pollution (HAP) from two different study sites in a resource-constrained setting of Tamil Nadu, India. Particulate matter PM2.5 (particles smaller than 2.5 microns in aerodynamic diameter), carbon monoxide (CO), and black carbon (BC) were measured in pregnant mothers (M), other adult women (OAW), and children (C) at various times over a 4 year period. In addition, stove usage monitoring (SUMs) with data-logging thermometers and ambient measurements of air pollution were carried out. Furthermore, the feasibility of collecting biological samples (urine and dried blood spots [DBSs]) from study participants at the field sites was successfully demonstrated. Based on findings from this and earlier studies, the methods used here have enhanced the data quality and avoided issues with household air pollution and biological sample collection in resource-constrained situations. The procedures established may be a valuable educational tool and resource for researchers conducting similar air pollution and health studies in India and other low- and middle-income countries (LMICs).

We detail the consistent, high-quality procedures used throughout air and biological sampling processes at Indian field sites during a large randomized controlled trial. Insights gathered from the oversight of applications of innovative technologies, adapted for exposure assessment in rural regions, enable better field data collection practices with more reliable outcomes.

인도의 가정용 대기 오염 개입 네트워크 시험을 위한 노출 및 바이오마커 평가의 현장 데이터 수집 절차 시각화

Here, we present a visual representation of standard procedures to collect population-level data on personal exposures to household air pollution (HAP) ...

<meta charset="utf8"></head><body>유도 가래 분석을 통한 폐 대식세포의 탄소 정량화

Measuring Carbon Content in Airway Macrophages Exposed to Carbon-Containing Particulate Matters

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with sputum, rendering macrophages and particles visible and quantifiable under light microscopy. Notably, elemental carbon within the mammalian body originates exclusively from external contaminants. Consequently, the carbon content in airway macrophages (CCAM) serves as a valid exposure biomarker, accurately estimating individual exposure to carbon-containing particulate matter (PM). This article delineates a protocol involving sputum collection, preservation, processing, slide preparation, and staining, as well as macrophage photo acquisition and analysis. After removing the macrophage nuclei, the proportion of cytoplasm area occupied by carbon particles (PCOC) was calculated to quantify carbon content in each macrophage. The results indicate an elevation in CCAM levels after exposure to carbon-containing PM. In summary, this non-invasive, precise, reliable, and standardized method enables the direct measurement of carbon particles within target cells and is utilized for large-scale quantification of individual CCAM through induced sputum.

<meta charset="utf8"></head><body>탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

This article describes a detailed experimental protocol for measuring the carbon content of airway macrophages with the aim of assessing the internal exposure dose at the level of individual particulate matter exposure.

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with ...

A Component-resolved Diagnostic Approach for a Study on Grass Pollen Allergens in Chinese Southerners with Allergic Rhinitis and/or Asthma

Sensitization to grass pollen imposes a global risk for allergic airway diseases. Although prevention relies on local investigation of the pollen allergens, data on this topic are limited in southern China. Any available data were obtained by self-report questionnaires, skin prick tests, and total or specific IgE tests using crude extracts. For many reasons, these methods are unreliable. Serum sIgE reactivity to Bermuda grass, Timothy grass, and Humulus scandens allergens in a cohort of patients from Greater Guangzhou (southern China&#39;s largest city and its outskirts) with allergic rhinitis and/or asthma were examined using a fully-automated immunoassay analyzer as a component-resolved diagnostics (CRD) tool.
For the first time, a considerably high prevalence of Bermuda grass sIgE positivity was demonstrated in Chinese southerners with allergic rhinitis and/or asthma. In these patients, a subtle prevalence of sensitization to Timothy grass and Humulus scandens was also noted, which may arise from cross-reactivity, as the latter two are not common in the region. This was also supported by the detection of allergen components.
Fully-automated immunoassay analyzers may offer satisfactory consistency between regions, laboratories, and institutions and over time. The automaticity of the instrument may enable a standardized detection that would not have been readily revealed before the advent of CRD.
This is a study that uses a CRD approach to investigate sensitization to grass pollen allergens in southern China. It adds to current evidence in the literature. Future studies are needed to validate these findings. However, although CRD is a useful tool, the findings made with the fully-automated immunoassay analyzer should not substitute for other laboratory investigations, clinical evaluations, and physician expertise.

This work describes a protocol that uses a component-resolved approach to study sensitization to grass pollen allergens in a cohort of patients from southern China with allergic rhinitis and/or asthma.

알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 중국 남부의 잔디 꽃가루 알레르겐에 대한 연구를위한 성분 분석 진단법

Sensitization to grass pollen imposes a global risk for allergic airway diseases. Although prevention relies on local investigation of the pollen ...

의학

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses and microbial substances that induce innate immune responses. These allergen-associated microbial components play an important role in regulating the development of type 2 inflammatory conditions such as allergic asthma. However, the underlying mechanisms remain largely undefined. The protocol presented here determines the structural characteristics and in vivo activity of allergen-associated immunostimulatory RNA. Specifically, common allergens are examined for the presence of double-stranded RNA (dsRNA) species that can stimulate IFN responses in lungs and restrain&#160;the development of severe lung eosinophilia in a mouse model of HDM-induced allergic asthma. Here, we have included the following three assays: Dot blot to show the dsRNA structures in total RNA isolated from allergens including HDM species, RT-qPCR to measure the activities of HDM RNA in interferon stimulating genes (ISGs) expression in mouse lungs and FACS analysis to determine the effects of HDM RNA on the number of eosinophils in BAL and lung, respectively.

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) often contain microbial substances that activate innate immune responses to regulate allergic inflammation. The protocol presented here demonstrates the identification of dsRNA species in HDM allergens and characterization of their immunogenic activities in modulating eosinophilic lung inflammation.

호산성 폐 염증을 조절하는 HDM 알레르겐의 면역원성 RNA 종의 식별 및 특성화

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

요약

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Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

알레르기 항원 유도 천식의 Murine 모델

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

구성 및 다른 환경 조건에서 Bioaerosols의 유통 분석

인도의 가정용 대기 오염 개입 네트워크 시험을 위한 노출 및 바이오마커 평가의 현장 데이터 수집 절차 시각화

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 중국 남부의 잔디 꽃가루 알레르겐에 대한 연구를위한 성분 분석 진단법

호산성 폐 염증을 조절하는 HDM 알레르겐의 면역원성 RNA 종의 식별 및 특성화