The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

NOTA: Este protocolo descreve a coloração indirecta das partículas PM10 com um anticorpo monoclonal (anticorpo monoclonal IgG1 de ratinho, clone MA-3B4) contra Bet v 1, o principal componente antigénio de pólen de bétula, além de uma aloficocianina (APC) marcado com anticorpo secundário (anti -Mouse anticorpo IgG1, clone A85-1) e subsequente análise num citómetro de fluxo. Com outros anticorpos adequados disponíveis, este método pode ser estendido para a detecção de outros antigénios ligados a partículas do ar ambiente. 1. PM10 Sampling <ol><li> Recolhe PM10 do ar ambiente em politetrafluoretileno (PTFE) filtros utilizando um amostrador de baixo volume com um caudal de 2,3 m 3 / hr (Figura 1). A caracterização do dispositivo de amostragem utilizado para as experiências aqui descritas encontra-se em 16. O tempo de funcionamento depende da quantidade necessária de PM10 (normalmente entre 1 e 10 dias). </li><li> No final do tempo de incubação, remover o filtro do amostrador e congelá-lo em-20 ° C até à sua utilização. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Figura 1. Baixa de recolha a volume PM10. Exemplo de um amostrador de volume baixo PM10. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Remoção 2. PM10 e contagem de partículas <ol><li> Deixe o degelo filtro de PTFE por cerca de 5 min. Em seguida, coloque o filtro em um poliestireno limpo placa de Petri (Figura 2A). Dê uma nova placa de Petri para cada filtro, se mais de um filtro é processado. </li><li> Subsequentemente, sobrepor o filtro de PTFE com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Este protocolo é estabelecido para uma concentração de PM10 final do 8x10 6 partículas por ml (veja o passo 3.3). Para se obter, pelo menos, que a concentração de, utilizar o volume seguinte empírica de PBS para sobrepor o filtro com: Se o tempo de recolha de MP10 foi &lt;<html> 2 dias, 2 ml usar. Para tempos de incubação ≥2 dias, use 4 ml. NOTA: De modo a aumentar a concentração de partículas da suspensão de PM10, suspensões de diferentes filtros podem ser reunidas, se esta é apropriada. </li><li> Segure o filtro de PTFE com uma pinça e pincel com uma escova de dentes elétrica com uma cabeça sensível escova para 1 min (Figuras 2B, 2C). Transferir a partícula-PBS-suspensão, suspensão PM10 doravante denominado, a um tubo de reacção limpo. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Figura 2. remoção PM10 com uma escova de dentes eléctrica. Um filtro de politetrafluoroetileno com PM10 amostrado é colocado numa placa de Petri de poliestireno (A) e é coberta com 4 ml de PBS. Então, PM10 é removido com uma escova de dentes elétrica (B: antes de escovar e C: após a escovação durante 1 min).= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol start="4"><li> Medir a concentração de partículas de PM10, por exemplo, por utilização de um contador de partículas. Dilui-se um volume adequado de PM10 suspensão tal como a 50 ul em 10 ml de tampão isotónico de medição, medir três vezes e calcular o número total médio de partículas por ml. Certifique-se de usar um contador de partículas que pode detectar partículas de dimensão relevante. </li></ol> 3. Bet v 1 Coloração <ol><li> Calcular o número de tubos de reacção necessários para a análise da amostra: Pelo menos três são necessários tubos de reacção de: (i) um tubo com apenas amostra (controlo nativo) (ii) um tubo com amostra mais anticorpo secundário (controlo negativo), e ( iii) um tubo com a amostra mais anticorpo primário e secundário (amostra específica). Se medido pela primeira vez, preparar, pelo menos, dois tubos de reacção de (i) (ii),e (iii) ter material suficiente para ajustar adequadamente citômetro configurações (veja o passo 4.1). </li><li> Calcula-se a quantidade de suspensão PM10 requerida para o número de tubos de reacção. Cada tubo de reacção requer 50 ul de suspensão. </li><li> Ajustar a concentração de partículas medido no passo 2.4 para o volume da suspensão no passo 3.2 calculada para uma concentração final de 8x10 6 partículas por ml pela adição de uma quantidade apropriada de PBS. NOTA: A suspensão PM10 restante pode ser congelada a -20 ° C para experiências futuras, embora para este protocolo recentemente preparado suspensão PM10 é recomendado. </li><li> Bloco de ligação inespecífica, completando a suspensão PM10 com albumina de soro bovino (BSA) a uma concentração final de 0,02%, utilizando uma solução de reserva, tal como BSA a 1% preparada com PBS. Vortex brevemente e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada amostra a ser analisada por citometria de fluxo, transferir 50 ul da suspensão do passo 3.4 a ACtubo de reacção magra. Adicionar um anticorpo monoclonal de ratinho contra Bet v 1, a uma concentração final de 0,02 mg / mL para os tubos de reacção designadas por coloração específica, vortex brevemente e incubar durante 60 min à temperatura ambiente. <ol><li> Deixe os tubos de reacção, com a suspensão PM10-BSA designado para o controlo nativo e o controlo negativo também ficar durante 60 minutos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavar todas as amostras pela adição de 500 ul de PBS suplementado com BSA a 0,02% a cada tubo de reacção, brevemente vórtice e centrifuga-se as amostras a 4700 xg, subsequentemente, durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma bomba de vácuo. </li><li> Repita o passo 3.6. </li><li> Determinar a quantidade total de anticorpo anti-IgG1 marcado com APC-secundário necessário: 1 ug de anticorpo dissolvido em 50 ul de PBS suplementado com 0,02% BSA por tubo de reacção. Dilui-se a quantidade apropriada de anticorpo com o respectivo volume de PBS suplementado com 0,02% de BSA. </li><li> Adicionar 50 uL de anticorpo secundário diluído para todos os tubos de reacção excepto para o tubo de reacção designado para o controlo nativo. Suplementar o último com 50 ul de PBS suplementado com 0,02% de BSA. Vortex todas as amostras por alguns segundos. </li><li> Incubar todas as amostras durante 30 min no escuro. </li><li> Repita o passo 3.6 duas vezes. </li><li> Adicionar 50 ul de PBS a cada tubo de reacção, de vórtice e analisar as amostras num citómetro de fluxo. </li></ol> 4. Análise de citometria de fluxo <ol><li> Usando o controle nativo, ajustar as seguintes citômetro parâmetros para otimizar a análise de dados. <ol><li> Ao utilizar o controlador de limite de dispersão para a frente (FSC) apresentada no quadro de controle do dispositivo, definir o limite FSC com o menor valor (200) e começar a análise. </li><li> Ao usar o controlador de tensão de dispersão, ajustar o FSC e dispersão sideward (SSC) dessa forma que todas as partículas PM10 podem ser detectados e que a população de partículas está localizado aproximadamente no the meio do eixo FSC e na metade inferior do eixo SSC. </li><li> Ao utilizar o controlador de tensão de fluorescência, ajustar a tensão de APC e uma outra tensão de fluorescência como isotiocianato de fluoresceína (FITC), o qual não emite no mesmo comprimento de onda como APC, se necessário. Certifique-se de que todas as partículas são visíveis na metade inferior de ambos os eixos de fluorescência. </li></ol></li><li> Consecutivamente, analisar cada uma das amostras, incluindo o controlo nativo e armazenar os dados do FSC, SSC, APC, e FITC de pelo menos 10.000 partículas por amostra. </li><li> Avaliar os dados com o respectivo software. conteúdo alérgeno adsorvida na amostra específica pode ser quantificada de duas formas: <ol><li> Analisar a intensidade de fluorescência APC de todas as partículas (valor médio) como uma medida de Bet v 1 carga sobre todas as partículas PM10. NOTA: Se a amostra específica contida alérgeno, APC intensidade de fluorescência deve aumentar na amostra específica em comparação com o controlo negativo. Em contraste, outro Fluorintensidades escence (por ex., FITC intensidade de fluorescência) não deve alterar significativamente. </li><li> Calcular a percentagem de partículas PM10 com anticorpo ligado anti-Bet v 1. Deste modo, no controlo negativo, definir uma porta em torno das partículas consideradas APC positivo, copiar e colar esse portão para a amostra específica e subtrair a percentagem de partículas APC positivos no controlo negativo a partir da percentagem de partículas de APC positivos na amostra específica. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. 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Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Uma etapa fundamental do protocolo é a utilização de um filtro adequado para a recolha de partículas PM10 de ar ambiente (ver passo 1.1). O filtro tem de ser suficientemente forte para suportar escovagem dos dentes com uma escova de dentes eléctrica, e não todos os materiais de filtro de cumprir este requisito. O protocolo de coloração foi estabelecido com uma concentração de partículas PM10 de 8x10 6 partículas por ml. No entanto, se o material é limitado e agregação de amostras não é apropriado, o método provavelmente irá funcionar bem, mas as concentrações de anticorpos (ver passos 3.5 e 3.8) pode ter de ser ajustada. Bet v 1 de coloração de partículas PM10 não resultou em populações distintas de partículas positivamente e negativamente manchadas. Isto pode ser causado pelas quantidades variáveis ​​de Bet v 1 alérgeno adsorvidos em cada uma das partículas que vão de muito pouco, até um valor alto. Isto poderia resultar na expansão do sinal de APC deslocando assim a população em direcçãopositividade APC. Como é difícil separar o positivo das partículas negativas, dois métodos de quantificação foram utilizadas para determinar as diferenças no conteúdo de Bet v 1 de PM10&gt; 0,5 espécimes: (i) quantificação relativa, medindo a mediana APC intensidade de fluorescência de todas as partículas e (ii) determinação da percentagem de partículas de APC positivos. Em relação ao Bet v 1 carga de partículas de baixa e alta temporada de pólen PM10&gt; 0,5, ambos os métodos revelou resultados semelhantes. Ainda assim, a quantificação relativa por intensidade de fluorescência mediana de todas as partículas é recomendada, pois é independente de colocar o portão e, portanto, provavelmente, menos propenso a erros. Até à data muitos estudos examinar o conteúdo alérgeno em partículas do ar ambiente através da extracção do respectivo alérgeno e quantificação subsequente com ELISA 5,12-14,17. Há uma diferença fundamental entre o procedimento descrito aqui eo quantificatioN com ELISA: ELISA quantifica o antigénio e extraiu-se dissolvido, enquanto que a citometria de fluxo analisa o antigénio ligado à partícula. Por meio de ELISA a Bet v 1 de carga das amostras de MP10 testados (n = 8) foi inferior ao limite de detecção de 1,2 ng / ml (dados não mostrados). Da mesma forma, Buters e outros não identificou Bet v 1 na PM &lt;2,5 mm fração e apenas cerca de 7% no 10 m&gt; PM&gt; 2,5 mm fração, mas mais de 93% no PM&gt; 10 mm fração do ar ambiente 13. Os resultados contrastantes de ELISA, por um lado, e a análise FACS, por outro lado, podem ser causadas por diferenças no método de detecção em combinação com a sensibilidade divergente. Mais pesquisas no entanto é necessário para compreender plenamente essa diferença. Um método para visualizar-partícula ligada antígeno é microscopia eletrônica de varredura 10,14. Por microscopia de varrimento de electrões, Ormstad et ai. Bet v 1 visualizado na superfície das partículas suspensas foscopartículas de fuligem r amostrado na alta temporada de pólen e, em menor medida, as partículas amostradas na baixa temporada de pólen 15. Além disso, a partir de alérgenos do pólen, látex e também P-glucanos foram encontrados para ser adsorvido em partículas de combustão no ar ambiente 10. Este método, no entanto, não permite a quantificação do alergénio ligada à partícula. Com o uso de citometria de fluxo, com ligação a partículas Bet v 1 alérgeno puderam ser quantificados. Assim, a citometria de fluxo pode oferecer uma nova maneira de caracterizar os 10 a 0,5 um fracção biológica de PM10, como com outros anticorpos adequados na mão, este método pode ser estendido para a detecção de outros antigénios em partículas do ar ambiente, por exemplo, bolor, ácaros do pó alérgenos ou LPS. Como partículas PM10 adsorver não só material biológico, mas também produtos químicos e metais com bastante facilidade, ligação inespecífica de anticorpos podem, no entanto, constitui um problema. Se um novo anticorpo é testado, um passo crítico é provar ligam específicaing. Isto pode ser realizado por, por exemplo, bloqueando a capacidade de ligação do anticorpo específico com o antigénio correspondente, antes de corar 11. Como Bet v 1 conteúdo do ar ambiente pode ser diferente da contagem de pólen de bétula 12,13,18, sintomas alérgicos talvez relacionar melhor com o nível de alérgenos do que com pólen contar 14,18. Assim, o método apresentado em conjunto com dados clínicos permite examinar em experimentos futuros se reacções alérgicas para Birch corresponder à carga alérgeno Bet v 1 de PM10&gt; 0,5.

A poluição do ar está sendo considerado como uma importante causa ambiental do aumento da incidência e gravidade das alergias respiratórias observadas nas últimas décadas 1-3. Além disso, houve um interesse crescente na distribuição de alergénios comuns em 4,5 poeira. Pólen de vidoeiro pode provocar a febre do feno, mas também pode ser um gatilho importante da asma alérgica 8/6. pólen de bétula todo não é susceptível de entrar no tracto respiratório inferior ou pode ser encontrada em PM10, como um resultado do seu tamanho (22 um de diâmetro). No entanto, alérgenos de pólen de bétula como Bet v 1, o principal componente do pólen de bétula alérgeno, pode ser liberado após a ruptura pólen 9 e pode se ligar a partículas no ar ambiente 10, assim, possivelmente, entrar nas vias respiratórias inferiores. De facto, tem sido mostrado que a MP10 pode conter alérgenos biologicamente activos como demonstrado pela activação in vitro de basófilos de um pólen probando alérgica 11 </sup&gt;. Bet v conteúdo 1 alérgeno no MP10 tem sido estudada por extrair o respectivo alérgeno e quantificação subsequente com ELISA 12-14. Com a técnica de ELISA, o alérgeno dissolvido foi medida, mas a quantidade de partículas carregadas com alérgeno ainda permanecia desconhecida. Microscopia eletrônica de varredura revelou partículas carregadas de alérgenos, mas não permitem a quantificação 10,15. Este estudo emprega citometria de fluxo para quantificar a proporção de partículas PM10 Bet v 1-carregados em amostras do ar ambiente. Devido ao limite de detecção do citómetro de fluxo apenas partículas maiores do que 0,5 um pode ser examinado. O&gt; 0,5 m fração de PM10 será ainda referido como PM10&gt; 0,5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Citometria de fluxo é um método amplamente utilizado para quantificar os sólidos em suspensão, tais como células de bactérias ou em um intervalo de tamanho de 0,5 a algumas dezenas de micrómetros de diâmetro. Além de uma caracterização das propriedades de dispersão para a frente e lateralmente, que permite a utilização de marcadores fluorescentes rotulados como anticorpos para detectar respectivas estruturas. Utilizando coloração com anticorpo indirecta, por citometria de fluxo é utilizada aqui para quantificar alergénio de pólen de bétula (precisamente Bet v 1) -loaded partículas de 0,5 a 10 um de diâmetro de partículas inaláveis ​​(PM10, tamanho de partícula ≤10 um de diâmetro). partículas PM10 podem actuar como transportadoras de alérgenos adsorvidas possivelmente transportá-los para o tracto respiratório inferior, onde pode desencadear reacções alérgicas. Até agora, o conteúdo alergênico de PM10 foi estudado por meio de enzima ligada immunosorbent (ELISA) e microscopia eletrônica de varredura. ELISA mede a não dissolvido e a partículaalérgeno -bound. Em comparação com microscopia eletrônica de varredura, que podem visualizar partículas carregadas de alérgenos, citometria de fluxo pode ainda quantificá-los. Como conteúdo alergênico de ar ambiente pode desviar-se contagem de pólen de bétula, sintomas alérgicos talvez relacionar melhor com a exposição a alérgenos do que com contagem de pólen. Em conjunto com os dados clínicos, o método apresentado oferece a oportunidade de testar em experiências futuras se reacções alérgicas ao pólen de bétula antigénios estão associados ao teor de alérgeno de Bet v 1 de partículas PM10&gt; 0,5 uM.

Bet v 1 alérgeno adsorção de PM10&gt; 0,5 partículas foi quantificado por coloração com anticorpo indirecta e subsequente análise num citómetro de fluxo. Uma amostra de PM10 de alta temporada de pólen serviu como modelo. Tal como indicado no passo 3.1, o controlo negativo consistiu de partículas de PM10 incubadas com anticorpo secundário marcado com APC única (Figura 3A). PM10 partículas coradas com anti-Bet v 1 de anticorpo mais anticorpo secundário exibido o alérgeno carregado partículas (Figura 3B). Tal como descrito no passo 4.3, foram usadas duas formas de quantificar a carga alérgeno: Por um lado, o valor da mediana da intensidade de fluorescência de todas as partículas da APC foi analisada sendo 137 para o controlo negativo e 904 para a amostra específica. Por outro lado, determinou-se a percentagem de partículas com o anticorpo ligado anti-Bet v 1: Um portão foi definido em torno das partículas de APC positivos no controlo negativo e subsequentemente copied e colado na amostra específica. No controlo negativo, 3% das partículas PM 10&gt; 0,5 foram considerados positivos APC. Esta percentagem de partículas de falsos positivos foi subtraída a partir da percentagem de partículas positivas na amostra específica resultando em 77,5% de PM10 positivo APC&gt; 0,5 partículas na amostra específica. Para provar que o anticorpo de ligação do anti-Bet v 1 observada era específica, a capacidade de ligação foi bloqueada com o antigénio correspondente antes da coloração. Isto diminuiu a ligação do anticorpo anti-Bet v 1 em 69%, se quantificada pela APC intensidade de fluorescência, e por 84%, quantificados por se percentagem de Bet v 1 PM10 positivo&gt; 0,5 partículas (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Figura 3. Bet v 1 alérgeno pode ser visualizada por citometria de fluxo. A APC intensidade de fluorescência de uma amostra de alta PM10 po de partículas ligadasllen estação coradas apenas com o APC anticorpo secundário marcado com (A), coradas com o anti-Bet v 1 de anticorpo primário e, subsequentemente, com o APC anticorpo secundário marcado com (B), e depois o bloqueio do anticorpo primário com o recombinante Bet v 1 de antigénio (C ). A APC porta P + foi criado em torno das partículas consideradas APC positiva (exibido em vermelho) e respectivas percentagens são dadas. Este número foi ligeiramente modificada a partir de 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Para testar se este método poderia ser adotada para revelar diferenças na quantidade de adsorvida Bet v 1 conteúdo de PM10&gt; 0,5 amostras de alta e de baixa temporada pólen, 13 MP10 de alta e 6 MP10 de baixa temporada de pólen foram analisados. Figura 4mostra diferenças significativas na intensidade de fluorescência APC e na proporção de Bet v 1 PM10 positiva&gt; 0,5 partículas de MP10 de alta temporada de pólen em comparação com MP10 de baixa temporada de pólen. Ambos os métodos de quantificação mostrou decide resultados semelhantes. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Figura 4. MP10 de baixa e alta temporada de pólen diferem na sua quantidade de adsorvida Bet v 1. Baixo PM10 temporada de pólen foi coletado no outono / inverno 2013 (n = 6), alta pólen PM10 em Maio de 2012 e de 2013 (n = 13). (A) A intensidade de fluorescência APC de PM10&gt; 0,5 partículas de alta temporada de pólen foi significativamente maior do que de baixa temporada de pólen (mediana / min / max alta temporada de pólen: 796/313/1097; mediana / min / max baixa temporada de pólen: 197 / 85/277). (B) PM10 da alta temporada de pólen contido significanTLY mais Bet v PM10 1-positivo&gt; 0,5 partículas do que PM10 de baixa temporada de pólen (mediana / min / max alta temporada de pólen: 45,2 / 18,5 / 74,5, mediana / min / max baixa temporada de pólen: 11,8 / 4,4 / 19,8). Os diagramas de caixa mostram valores medianos (linha interna da caixa), 25. e 75. percentis, respectivamente (bordas superior e inferior da caixa) e valores mínimos e máximos (filamentos). *** P &lt;0,001 versus baixa temporada de pólen, Mann Whitney U. Este número foi ligeiramente modificada a partir de 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar partículas carregadas de alérgenos por citometria de fluxo. partículas de material particulado ambiental podem agir como portadores de alérgenos adsorvidos. Mostramos aqui que a citometria de fluxo, um método largamente usado para caracterizar os sólidos em suspensão&gt; 0,5 um de diâmetro, pode ser usado para medir estas partículas carregadas com alérgeno.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K visualizações.  Federal Environment Agency.  Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar partículas carregadas de alérgenos por citometria de fluxo. partículas de material particulado ambiental podem agir como portadores de alérgenos adsorvidos. Mostramos aqui que a citometria de fluxo, um método largamente usado para caracterizar os sólidos em suspensão> 0,5 um de diâmetro, pode ser usado para medir estas partículas carregadas com alérgeno. 

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Imunologia e Infecção

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Análise em multiescala do crescimento bacteriano tratamentos de estresse

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...