이 연구는 FP7 용량 계획 (부여 번호 INFRA-2010-262163)에서 유럽 공동체 연구 인프라에 의해 자금을 조달 QNano 프로젝트 http://www.qnano-ri.eu의 지원을 받았다. 우리는 또한 금융 지원을위한 연구위원회 Formas 감사합니다.

참고 :이 프로토콜에 주어진 모든 매개 변수가 여기에 표시되는 악기와 모델에 대한 유효합니다. 다른 제조업체 나 모델을 사용하는 경우 (텍스트에서 *로 표시) 이러한 매개 변수 중 일부는 다를 수 있습니다. FIB / SEM의 1. 시동 <ol><li> anticontaminator (AC)에 구리 머리 띠를 연결하지 않고도 맞춤형 차가운 nanomanipulator (NM) 팁을 장착합니다. 대신 띠가 선명 단계 (1.2) 동안 충전을 방지하기 위해 절연 포인트 이상 NM의 나머지 부분에 연결되어 있는지 확인하십시오. <ol><li> 높은 진공 및 이미지 NM 팁에 펌프, SEM 실을 닫습니다. </li><li> 끝이 뭉툭한 각부 또는 이전 사용에 의해 오염 된 경우, 이온빔에 의해 깎아 : 팁의 측면을 따라 다각형 밀링 패턴을 선택 밀링 후에, 팁은 1 ㎛ 이하로 내려 테이퍼되도록. </li><li> 팁의 측면이 떨어져 가공되고 나면 수동으로 전체 NM로드 ° (90)에 의해 회전SEM 챔버 외부에서. </li><li> 회전 팁에 적응하고 다른 각도에서 밀링을 반복하는 다각형 밀링 패턴을 조정합니다. </li></ol></li><li> 팁은 1보다 μM로 날카롭게되면 NM 후퇴 및 가스 주입 시스템 (GIS)의 바늘을 삽입; (대신에 보통 175 ㎛ 인) 작동 거리 위의 약 1mm에있을 바늘의 위치를​​ 변경. </li><li> 백금 전구체를 사용하는 경우 (대신 보통 40 ° C의) 24 ~ 26 ° C에서의 작동 온도를 변경합니다. 이 단계는 백금의 크라이 증착 (13)이 필요합니다. </li><li> SEM 챔버를 열고 크라이 샘플 단계와 AC를 장착하여 극저온 모드 FIB / SEM을 준비합니다. </li><li> 삽입 위치에 NM 스위치 및 AC로의 구리 머리 띠를 연결합니다. 실수로 NM 팁을 만지지해야합니다. 이 시스템은 극저온에서의 구리 끈목의 유연성의 손실이 뉴 멕시코의 이동을 방해하지 않도록하기 위해 삽입 된 뉴 멕시코와 냉각MENT. </li><li> 몇 분 동안 건조 질소 가스로 냉각 파이프를 제거. </li><li> 크라이 조정실 및 고진공 메인 샘플 챔버 펌프. </li><li> 두 챔버를 냉각 Dewars에 액체 질소를 추가합니다. 원하는 온도에 도달 할 때까지 기다립니다. </li></ol> 2. 샘플 냉동 <ol><li><ol><li> SEM 전송 홀더 FIB 샘플 두 TEM 격자를 장착합니다. 드라이버로 해당 나사를 조여을 고정합니다. </li><li> 시편의 샘플 스텁 적절한 마운트 표본의 일부를 추가합니다. 시료의 유형에 따라, 시편은 극저온 접착제 또는 클램프로 고정 할 수있다. 최적의 냉동을 보장하기 위해 가능한 한 적은 양을 사용한다. </li><li> 진공 이송 장치 (VTD)에 SEM 전송 홀더를 장착합니다. </li></ol></li><li><ol><li> slushing 스테이션에 액체 질소를 추가하고 질소 비자금을 얻기 위해 펌프 다운. </li><li> SL을 엽니 다ushing 스테이션과 SEM 전송 홀더 플 런지 동결. 다시 끓는가 완료되고 비자금을 얻을 때까지 다시 펌프 다운. 이는 에탄 또는 프로판 슬러시 또는 고압 냉동 샘플의 유리화를 얻기 위해 더 적합한 기법임을 주목해야한다. </li></ol></li><li><ol><li> VTD의 진공 챔버 SEM 전사 홀더를 후퇴 해 밀봉. </li><li> slushing 역 크라이 준비 실 출입구를 환기. </li><li> 크라이 준비 챔버와 펌프의 에어 록으로 VTD 씰을 일치시킵니다. </li><li> 양호한 진공 레벨에 도달하면, VTD 및 외측 출입구의 봉을 열고 에어 록 핀 결합; SEM 전송 홀더를 삽입합니다. 스퍼터링 및 골절에 대한 샘플 위치를 나타내는 제조 챔버의 슬라이딩 접촉에 표식이있다. </li></ol></li><li> 필요한 경우, 샘플 수 : 감기 칼 골절; 높은 온도 (보통 -100을 설정하여 승화6, C); 추위 sputterer에 의해 금 / 팔라듐 또는 백금으로 코팅 (300 V, 10mA, 2 ~ 3 nm의 금 / 팔라듐 캡 60 초) *. 승화는 재결정을 피하도록 유리화 샘플에 사용되어서는 안된다. </li><li><ol><li> TEM 그리드 슬롯의 보호 뚜껑을 열고 차가운 칼을 사용합니다. </li><li> 수신 높이 (16mm의 *)에 샘플 챔버에 찬 단계를 가져온다. </li><li> FIB / SEM에서 HT를 끄고 내부 출입구를 엽니 다. </li><li> 샘플 챔버 내로 SEM 홀더를 전송할 VTD를 사용한다. 방에 조명을 흐리게하는 것은이 단계에서 도움이 될 수 있습니다. </li><li> SEM 홀더 추위 단계가되면, 밀고 회전하여 VTD를 분리합니다. </li><li> VTD 진공 챔버로 VTD로드를 끝까지 후퇴와 내부 출입구, 외부 출입구와 VTD 씰을 닫습니다. 외부 출입구는 이제 VTD 씰을 제거하기 위해 배출 될 수 있습니다. 이 마지막 단계는 필요하지 않지만 VTD로드 쉽게 사고로 빠질 수있는 바와 같이 그것이 손상 될 수있는 추천VTD 또는 출입구에. </li></ol></li></ol> 3. 이온 밀링 <ol><li> 두 열에서 높은 긴장의 전원을 켜고 적절한 이미징 매개 변수 (가속 전압 설정 : 전자 빔 10 kV의, 이온 빔 30 kV의, 반점의 크기 : 3, 작동 거리 : 5mm, 이온 빔 전류 : 10 ~ 100을 이미징을위한 PA, 밀링 1-3 NA) *. </li><li> 그 기능을 찾을 수 및 라멜라의 추출하기 전에 샘플의 상태를 문서화하는 이미지를 얻기위한 전자 빔을 사용합니다. </li><li> 추출에 대한 관심 (ROI)의 영역이 확인되면 시료 자체의 지형에도 백금 증착 후 투자 수익 (ROI)의 용이 한 식별을 허용하지 않는 한, 이온 빔 패턴으로 표시합니다. 정밀도가 향상된 경우, 표시가, 깊은 폭 비 SEL 인 크라이 백금 증착 (에 포함 된 후 계속 볼 수 있도록 충분히해야한다 Pettersson의 등. (14)에 의해 기술 된 방법을 사용)를 사실상 시료 표면의 몇 mm 2를 다룰 것입니다. </li><li> 24-26 ° C의 전구체 기체를 가열하고 샘플 표면 위 대략 1 mm의 높이로 GIS 바늘을 삽입 (또한 단계 1.3 참조). </li><li> 전자선 묘화 있지만, 몇 초 동안 가스 밸브를 연다. 극저온의 Pt의 증착 속도는 GIS 니들, 샘플 거칠기 및 사용자 시스템의 거리에 따라, 100 ~ 500 ㎚ / 초 이상이다. 그것은 최적의 매개 변수를 결정하기 위해 몇 가지 테스트 선서를 실행하는 것이 좋습니다. </li><li> 원시 크라이 백금 증착은 매우 거칠고 불 균질하다. 낮은 배율 (예 : 2,000 X)에서 1000 펜실바니아 이온 빔을 사용하여 투자 수익 (ROI)을 통해 예금을 치료. 크라이 증착과는 달리,이 경화성 사이트는 선택적 사항이며 ROI을 수행하여야한다. 이 제 극저온 증착의 목적은 이온빔 손상으로부터 샘플의 표면을 보호하고, 이온 씨닝 13 중에 curtaining을 감소시키는 것이다. </li><li> 에 샘플을 기울52 °면이 이온 빔에 수직이되도록. 투자 수익 (ROI)의 양쪽에 밀 멀리 두 개의 계단식 트렌치. 참호에 대한 일반적인 차원이 추출되는 얇은 판, 수직 방향 (Y) 및 변수를 10 ~ 15 μm의 방향 (X) 병렬로 20 ~ 30 μm의 수 있습니다, 가장 깊은 지점으로, 깊이 (Z)을 경 투자 수익 (ROI)을 닫습니다. 기울기는 45 ~ 55 °이어야한다. 일부 기기에서는 계단식 트렌치는 상단에있는 가장 깊은 지점으로 가공 할 수있다. 이 경우, 투자 수익 (ROI)에서 밀 한 다음 이미지 180 ° 공장 반대편에 두 번째 회전. 재료의 스퍼터 레이트가 알려진 경우 밀링의 깊이가 선택 될 수있다. 대부분의 냉동 수화 샘플은 얼음의 스퍼터링 속도는 7 사용될 수있다. </li><li> 다시 0 °로 샘플을 기울이고 있는지 컷 마크 (그들은 계단식 경사면 공장에 밀링 자국을 남길해야 전체를 얇은 판을 통해 이동하고, 얇은 판의 측면과 밑면을 버려야하는 이온 빔을 사용하여) 이전 단계에서 에드. 샘플의 나머지 부분에 얇은 판을 연결하는 두 개의 작은 다리를 둡니다. </li><li> (이것은 약간의 샘플을 이동 할 수 있습니다) GIS 바늘을 삽입합니다. 그 첨단이 바람직 측에 라멜라와 물리적으로 접촉 할 때까지 NM 책략. 뉴 멕시코는 두 개의 작은 연결하는 교량의 이온 빔보기를 방해하지되어 있는지 확인합니다. </li><li><ol><li> 몇 초간 GIS 밸브를 열고 전자선 연속 촬상하여 크라이 증착을 모니터링한다. </li><li> 백금의 추가적인 1-2 μM 층 크라이 증착되었을 때, 밸브를 닫는다. </li><li> 만 NM은 얇은 판과 접촉하는 점을 중심으로 몇 μm의에서 백금 (단계 2.6 참조) 치료. </li><li> 무료 얇은 판을 잘라 높은 이온 빔 전류를 사용합니다. 이 연결 교량 멀리 분쇄뿐만 아니라 라멜라 및 샘플의 나머지 부분 사이의 새로운 접촉점을 형성 할 수있는 백금의 초과한다. 아직 GIS 바늘을 철회하지 마십시오. </li></ol></lI&gt; <li> 조심스럽게 참호에서 얇은 판을 추출하고 최소 500 μm의 샘플 표면 위를 이동 NM 기동. 만이 단계 후, GIS 바늘을 철회. </li><li> 샘플 단계 몇 mm를 내리고 TEM 그리드 중 하나가 될 때까지 이동은보기에 있습니다. 작업 위치에 격자에 부착 영역을 이동하고 GIS 바늘을 삽입합니다. </li><li><ol><li> 조심스럽게 TEM 그리드에 부착 영역과 물리적 인 접촉에 부착 된 얇은 판을 가지고 NM 기동. 얇은 판, TEM 그리드와 멕시코 사이의 압력 또는 긴장이 없어야합니다. </li><li> 몇 초 크라이 예금 백금의 추가 1 ~ 2 μm의 계층에 대한 가스 밸브를 엽니 다. </li><li> 만 얇은 판과 TEM 격자 사이의 접촉의 점을 중심으로 몇 μm의에서 백금 (단계 2.6 참조) 치료. </li></ol></li><li> 뉴 멕시코의 무료 얇은 판을 잘라 높은 이온 빔 전류를 사용합니다. 이는 NM 팁이나 샘플의 양쪽을 얻어 분쇄함으로써 달성 될 수있다. t에서그 첫 번째 경우, 팁은 단계 1.2에서 설명한대로 다음 사용 전에 다시 날카롭게해야 할 것이다. </li><li> OPTIONAL :이 단계는 SEM 전사 홀더를 가지고, 액체 질소로 채워진 듀어에서 O / N을 저장하는 VTD를 사용하는 것이 가능하다. 이 전송 및 O / N 스토리지는 라멜라의 표면 상에 얼음 형성이 발생할 가능성이 액체 질소는 습한 공기에 노출되는 경우에 얼음 결정이 이미 존재 및 / 또는 경우에; 그러나 이러한 오염은 비교적 짧은 시간에 다음 단계에서 제거 될 것이다. 이전 단계를 완료하는 데 몇 시간을 촬영 할 수 있습니다으로 다음과 같은 단계 이후에 같은 저장 O / N 권장되지 않기 때문에 (승화 제외 얼음 오염을 제거 할 수있는 방법이 없을 것 같은, 그것은 그렇게하는 것이 적절 될 수있는 샘플의 유리화가 유지 될 경우)를 수행 할 수 없다. </li><li> 52 °에 샘플을 기울여 투명성 7 전자 얇은에 이온 빔을 사용합니다. 그것은 높은 roug로 시작하는 것이 좋습니다그녀 빔 전류는 부피를 제거하고, 결국 또한 가속 전압을 감소시키는 낮은 빔 전류로 표면을 연마 미세 진행한다. 얇은 판의 최종 두께는 시료의 조성에 따라, 100 ~ 200 kV의 TEM의 미세 구조 분석을위한 100 ~ 200 nm 이하 또는 300 kV의 TEM의 단층 촬영을 위해 최대 500 나노해야한다. 엷게하는 동안, 시료의 내부 응력은 라멜라가 컬 또는 굴곡 될 수 있습니다. 그러한 경우에, 박형화 영역이 제한되어야한다. 이것은도 11 및도 12에 예를 들어 일어났다. </li></ol> TEM 4. 알아내는 전송 <ol><li><ol><li> 몇 분 동안 건조 질소 가스 크라이 환승역 플러시. </li><li> TEM AC의 듀어와 크라이 전송 스테이션에 액체 질소를 추가합니다. </li><li> 크라이 전송 스테이션의 해당 슬롯에 크라이 전송 TEM 홀더를 삽입뿐만 아니라 그것의 듀어를 입력합니다. 각로드 될 때까지 기다립니다onent가 원하는 온도 (약 15 분)에 도달했습니다. 가능하면, 크라이 전사 TEM 홀더의 제어기는 전송하는 동안 온도를 모니터에 연결되어야한다. 그것은 (온도 센서가 위치한) TEM 홀더의 선단이 크라이 환승역에 접촉되며, 따라서 TEM 홀더의 나머지보다 훨씬 빠르게 식혀 것을 인식하는 것이 중요하다. 그것은 따라서 냉각하는 전체 크라이 전송 TEM 홀더에 필요한 시간을 미리 측정하고, 시스템이 시간의 최소 금액에 대한 thermalize 할 수 있다는 것을 권장합니다. </li><li> 액체 질소 극저온 잔을 채우고 그 안에 담가 : 원하는 온도에 자신의 팁을 냉각하기 위해 TEM 샘플 클램핑 툴, 드라이버 및 핀셋. 조작자의 손에 감기 화상을하지 않도록하고 모든 공구가 제대로 타단에 절연되어야한다. </li></ol></li><li> 외부 출입구에 VTD 일치합니다. 추위 사슴을 가지고전송 높이 (16mm의 *)에 전자. 하이 텐션을 끕니다. </li><li><ol><li> VTD 씰, 외부 출입구와 내부 출입구를 엽니 다. </li><li> 시계 방향으로 밀고 회전하여 SEM 전송 홀더에 고정합니다 VTD로드를 사용합니다. </li><li> 크라이 프렙 챔버에 SEM 전사 홀더를 후퇴. </li><li> TEM 그리드의 보호 뚜껑을 닫습니다 차가운 칼을 사용합니다. 이는 전송 중에 가능한 얼음 오염을 감소시킬 필요가있다. </li><li> VTD의 진공 챔버에 샘플을 이동 VTD로드를 사용합니다. </li><li> airlocks 및 인감을 닫습니다. </li></ol></li><li> 외부 출입구를 배출하고 VTD를 분리합니다. 크라이 전송 스테이션의 SEM 포트에 VTD 일치합니다. 건조 질소로 세척하는 동안, VTD의 씰을 열고 크라이 환승역 듀어에 SEM 전송 홀더를 밀어 스테이션의 핀을 사용합니다. </li><li><ol><li> 크라이 전송 스테이션의 수준이 충분히 높지 않도록 충분한 액체 질소 추가다만 견본 잠수함합니다. </li><li> 뚜껑을 열고 자리에 TEM 그리드를 유지하고 해당 나사를 느슨하게 이전에 냉각 된 드라이버를 사용합니다. </li><li> TEM 그리드를 선택하고 TEM 홀더에 배치하기 이전에 냉각 핀셋을 사용합니다. </li><li> TEM 홀더에 TEM 그리드를 고정 냉각 hexring를 사용합니다. </li><li> 크라이 전송 TEM 홀더의 셔터를 닫습니다. 샘플 전사 공정은 매우 중요하고 작은 TEM 샘플의 가시성을 감소시키는 질소 가스에 의해 방해 될 수있다. </li><li> 펌핑 시스템에서 크라이 전송 스테이션을 분리하고 함께 크라이 전송 TEM 홀더의 히터 컨트롤러, TEM 근처에 수송한다. </li><li> TEM의 출입구에 백업 라인을 펌프에 TEM의 터보 분자 펌프를 시작합니다. </li><li> -70 °의 틸트 *에 TEM 샘플 단계를 설정합니다. </li><li> 건조 질소 가스에 의해 퍼지 하나만 사이클, 기밀실 (30-60 초)에 대한 펌핑 최단 시간을 설정한다. </리&gt; </ol></li><li> 크라이 전송 TEM 홀더에 보호 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다. 크라이 전송 역에서 TEM 홀더를 제거하고 (액체 질소는 TEM 홀더 듀어 밖으로 유출 할 것이다) 기울어 진 고니 오 미터에 삽입합니다. 펌핑 사이클이 시작됩니다. 사이클이 완료되면, 0 °로 다시 기울일 측각기를 설정하고, 그것을 측각기로 회전하지 않도록 동시에, T​​EM 홀더를 잡아. TEM 내부에 완전히 삽입합니다. 이 단계 동안, 크라이 전사 TEM 홀더의 온도를 모니터링하기 위해 히터 제어기에 연결되어야한다. TEM에 샘플 홀더를 삽입하는 절차는 다른있는 TEM 사이에 차이가있을 수 있습니다. 그것은 따라서 적절한 절차를 얻기 위해 TEM 제조업체에 문의하는 것이 좋습니다. </li><li> 크라이 전송 TEM 홀더 듀어 리필. 수용 가능한 수준에 도달하기 위해 TEM의 진공 기다립니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 실온에서 재료 과학에서 사용되는 표준 FIB / TEM 샘플 준비의 극저온에 오히려 간단 적응이다. 샘플 표면이 불균일 한 경우 curtaining가 발생할 수 있지만,이 방법은, 기계적인 변형과 칼 마크 (microtomy의 주요 단점)의 자유 TEM 샘플을 생성한다. 그것은 매끄럽고 특색이 13이 될 때까지이 경화 캡핑 층 (이 작업 편에 사용 하였다), 극저온의 증착에 의해 감소 될 수있다. 매우 경도가 다른 구성 요소와 샘플들이 제조 동안 스트레스 하에서 분해 할 위험없이도 제조 할 수있다. 내부 응력은 여전히​​ 얇은 라멜라이 섹션의 크기가 감소되어야하는 경우, 구부러 지거나 휘지 발생할 수있다. 다른 방식에 비해 단점으로 인해 이온 빔과 샘플의 이온의 주입을 가능에 노출 생물학적 구조를 변경하는 가능성이다. 이러한 단점은 또한 샘플 prepar 대한 RT에서 발생할재료 과학 15 ATION. 이들은 이온 (500 ~ 1,000 V)에 대한 낮은 가속 전압에서 최종 폴리싱 단계와 씨닝을 완료하여 감소 될 수있다. 이 매우 부드러운 연마 단계는 얇은 판의 손상 층을 제거합니다. 때문에 극저온 증착 (3.5, 3.10 및 3.13 단계)의 특성, 샘플의 큰 부분이되어 원래의 표면의보기를 방해, 적용됩니다. 이 단계 3.3에서 제시된대로 여러 마킹이 사용되지 않는 것이 곤란, ROI를 추적하도록 할 수있다. 단계 공기와 접촉하는 4.5 및 4.7 얇은 라멜라 위험 중. 이것은 아마도 중요한 기능을 왜곡의 시점, 샘플의 표면 상에 얼음 결정을 형성하기 위해 공기에 수분을 야기으로 피해야한다. 그 단계는 가능한 한 빨리 수행되어야하지만, 동시에 전송 중에 부주의는 시료의 손실이 발생할 가능성이 그것을자기. 그것은 사용자가 실제 샘플에 대한 시도가 이루어지기 전에 빈 TEM 격자를 사용하여 이러한 단계를 연습하는 것이 좋습니다. 재료 과학, FIB 악기 상용화 10 년 내 TEM 샘플 준비의 주요 방법이되었다. 그것은 거의 모든 시료에 사용될 수 있기 때문에, 시료의 종류에 제조 기술을 조정할 필요성을 제거한다. 우리는 강력하게 같은이, 극저온의 온도에서 분석 절차 덕분에 일어날 수 있으리라 생각합니다. 큰 샘플에의 응용은 아직도 알아내는 보존 유리화 된 상태에서 그들을 할 수있는 능력에 따라, 그러나 3,5 동결 등의 플 런지 동결 또는 고압 등의 기술은이 문제에 대한 최적의 솔루션이 될 증명할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 cryo-FIB/SEM 기계 SEM 분석에 의해 높은 정밀도로 식별 된 샘플의 특정 영역에서 TEM 샘플을 생성하기 위해 사용된다. 생물학적 시료의 전자 현미경 (스캔 또는 전송) 분석 연구 및 진단에 사용되는 일상적인 기술이다. SEM 오히려 빠르고 고용하고 해석하기 쉽지만, 정보는 샘플 표면에서 및 1.5 nm의 범위의 해상도를 얻을 수있다. TEM은 더 높은 해상도를 가지고 있지만, 구현하기가 더욱 어렵고, 이미지 분석은 이하 간단하며 대량 정보가 획득되는 반면, 샘플 (약 500 nm 두께 이하의) 투명도 전자 얇아 져야한다. 또 다른 문제는 그 악기의 진공 요구 사항이 거의 수분을 함유 한 시료에 의해 허용되지 않는 것입니다. 대부분의 경우, 생물학적 시료는 화학적으로 (중합체, 예를 들어, 물을 대체) 고정 또는 건조 할 수도있다. 에 두 경우 모두, 큰 변화시편의 형태와 구조는 발생하기 쉽다. 수화 표본의 극저온 TEM 준비는 최소한의 화학적 변화를 유도하고 얼음의 유리화가 1-6을 얻을 수있다 특히, 자신의 고유 상태로 가능한 한 샘플을 가까이 생산하고 있습니다. FIB는 널리 많은 장점 7 TEM 샘플을 준비하는 데 사용됩니다. 몇 가지 이름을하려면 거의 수직 입사에 고 에너지 이온의 자료를 사용하는 관련 차동 밀링 환율의 영향을 최소화; 대부분의 샘플에서 추출 된 영역은 서브 마이크론의 정밀도로 선택 될 수있다; 물질의 미량이 추출된다. 일부 최근의 기술 개발은 극저온 2,8-10에서 TEM 샘플 준비를 위해 또한 FIB를 사용 가능하게했다. 이러한 슬라이스 라멜라의 기계적 변형의 부족과 같은 부드러운 물질 샘플에 주로 사용 크라이 microtomy 11,12의 전통적인 제조 방법에 비해 여러 가지 이점이있다하드 / 소프트 인터페이스 또는 구성 요소와 복합 샘플을 준비하는 칼 마크와 가능성의 부재.

<table><tbody><tr><td>Strata DB 235</td><td>FEI</td><td></td><td>FIB/SEM</td></tr><tr><td>Omniprobe 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Nanomanipulator</td></tr><tr><td>Alto 2500</td><td>Gatan</td><td></td><td>Cryo preparation chamber</td></tr><tr><td>Cryo-holder model 626</td><td>Gatan</td><td></td><td>Cryo transfer TEM holder</td></tr><tr><td>Tecnai F30</td><td>FEI</td><td></td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

여기에서 우리는 아스 페르 길 루스 니제르 포자 크라이 TEM 시료를 준비하는 데 사용되는 프로토콜을 제시하지만, 쉽게 미생물 또는 솔루션의 수에 대한 적응 될 수있다. 우리는 사용자 정의 내장 크라이 전송 역 및 수정 크라이 SEM 준비 챔버 (2)를 사용합니다. 포자는 액체 질소의 비자금에 뛰어 들다 - 냉동 및 관심 영역을 선택 크라이 SEM에서 관찰, 문화에서 가져옵니다. 얇은 라멜라는 다음 TEM 그리드에 연결된 이후에 투명성을 전자 얇아, FIB를 사용하여 추출한다. 그리드는 크라이 TEM 홀더 및 고해상도 TEM 연구에 전사된다. 냉각 nanomanipulator 팁과 크라이 환승역 도입 덕분에,이 프로토콜은 TEM 샘플의 일상적 사용 FIB 준비의 극저온까지 간단 적응이다. 이와 같이 기존의 기기는, 셋업 및 절차에 대한 변형의 양이 적은 이점이있다; 그것의 I구현하기가 쉽다; 그것은 원칙 크라이 TEM 샘플 준비와 동일한에서 응용 프로그램의 넓은 범위를 가지고 있습니다. 하나의 한계는 오염을 방지하거나 최소화하기 위해 중요한 단계에서 표본의 숙련 된 처리가 필요한 것입니다.

이 작품에서 우리는 사용했다 : nanomanipulator와 크라이 준비 챔버가 장착 된 듀얼 빔 FIB / SEM을; 크라이 전송 홀더 TEM; 프로토 타입을 알아내는 전송 역. anticontaminator (AC)는 크라이 조정실의 블레이드와 nanomanipulator (NM)의 끝이와 Gatan에 의해 수정되었다. 표준 크라이 프렙 챔버에 대해, AC 블레이드 NM 팁에 대한 더 큰 히트 싱크를 제공하는 것이 크다. 또한, AC는 NM 팁의 열 교환을위한 구리 머리 띠를 연결하는 클램프가 장착되어 있습니다. FIB / SEM의 공압은 NM가 될 수 있도록 수정 된 샘플 챔버가 배출 된 경우에도 삽입 된 상태로 유지. 이는이 연구에서 사용 된 파라미터가 제일 위에 나열된 기기에 적합 주목해야한다; 이러한 매개 변수는 다른 유형의 장비로 작업 할 때 조절 될 필요가있다. 이 프로토콜을 사용하여 작업하는, 저온 학을 처리하기위한 일반적인주의 사항은, 액체 질소 진공 시스템은해야다음 될 수있다. 이 방법은 용액 또는 나노 입자를 포함하는 고분자 매트릭스에서, 선충에 단세포 유기​​체에 이르기까지, 좋은 결과 샘플의 다른 유형에서 테스트되었습니다. 절차의 여러 단계의 예는 A.에도 1-12에 도시되어있다 니제르 포자 산화 오스뮴 및 과망간산 칼륨으로 염색. 포자 먼저 추출 사이트를 식별 할 수 있습니다 (그림 1) SEM에 의해 촬영된다. 이 경우, 어떠한 포자의 단면은 충분하지만, 행 서브 마이크로 미터 정밀도로 추출 ROI의 위치를​​ 예를 들면, 세포막으로부터 특정 거리에서 특정 세포를 슬라이스하는 것이 가능하다. 그 기능이 확인되면, 크라이 편 증착의 제 1 단계는 이온 밀링에서 빔 손상으로부터 시료를 보호하기 위해, (도 2)에 구현된다. 이 샘플은 첫 단계 O를 진행하는 52 °로 기울어 져F 밀링 (도 3) : 얇은 판의 양측에 두 개의 트렌치 스퍼터링. 샘플을 기울이면 더욱 대량으로 연결하는 두 개의 작은 다리 (그림 4)를 남겨두기 위하여 가공된다. 냉각 nanomanipulator는 얇은 판에 접촉 (그림 5)과 백금의 다른 크라이 증착들을 함께 연납 (그림 6)하게된다. 작은 연결 교량은 다음 멀리 분쇄 NM은 TEM 그리드의 부착 면적이 백금의 최종 크라이 증착 (그림 8) 납땜 (그림 7), 근처에 얇은 판으로 이동합니다. NM이어서 이온빔 투명도 (도 10 및 11)를 위해 전자 박판화 라멜라 (도 9)로부터 분리된다. 얇은 판은 마지막으로 TEM (그림 12)로 전송되는 경우 고해상도 이미징, 분광기, 단층 촬영 및 기타 CA의 기술N 사용될 수. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> 그림 1. A. 포자의 극저온-SEM 이미지 백금 증착하기 전에 니제르. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> 그림 2. 백금 증착 후 그림 1 만 치료 전에 같은 지역. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> 그림 2와 같은 지역의 그림 3. 극저온-SEM 이미지, 트렌치 밀링, 백금 증착 및 경화 후, 52 º 기울어 진행(3.7 단계 참조). <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> 리프트 아웃에 대한 준비가 그림 4. 얇은 판. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> 그림 5. 차가운 nanomanipulator 팁 라멜라와 접촉한다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> 그림 6. 두 번째 백금 크라이 증착 nanomanipulator와 얇은 판을 함께 납땜하는 데 사용됩니다. <iSRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot;/&gt; : FO 내용 너비 = &quot;5 인치&quot;FO MG 고도는 = &quot;그림 7&quot; 그림 7. 차가운 nanomanipulator는 TEM 그리드의 부착 영역에 얇은 판을 전송하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> 그림 8. 크라이 증착 TEM 그리드에 얇은 판을 부착 한 번 더 사용됩니다. <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> 그림 9. 얇은 판은 nanomanipulator 무료 잘라 이제 저장 또는 투명 전자에 얇게 하나에 대한 준비가되어 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.내 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> 그림 10. 숱의 중간 단계를 단면에서 보이는 몇 가지 포자. <img alt="그림 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> . 최종 숱이 후 샘플의 11 극저온-SEM 이미지를 그림; 다른 포자의 대부분은 얇은 판 컬하기 시작했기 때문에 멀리 분쇄되어야했다. <img alt="그림 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> 그림 12. 얇은 판의 복합 크라이 TEM 사진을. 알 스텁의 일부가 포함되어 있습니다얇은 판 (검은 색 화살표)에서.

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Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

cryo-electron-microscopy-specimen-preparation-means-focused-ion

Research

JoVE Journal

Biology

26.5K 조회수.  Uppsala University.  극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다. 

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

연구

신경과학

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could easily be adapted for other biological samples. The basic principles for preparing samples, milling, and viewing lamellae are common to all instruments and the protocol can be followed as a general guide to on-grid cryo-lamella preparation for cryo-electron microscopy (cryoEM) and cryo-electron tomography (cryoET). Electron microscopy grids supporting the cells are plunge-frozen into liquid nitrogen-cooled liquid ethane using a manual or automated plunge freezer, then screened on a light microscope equipped with a cryo-stage. Frozen grids are transferred into a cryo-scanning electron microscope equipped with a focused ion beam (cryoFIB-SEM). Grids are routinely sputter coated prior to milling, which aids dispersal of charge build-up during milling. Alternatively, an e-beam rotary coater can be used to apply a layer of carbon-platinum to the grids, the exact thickness of which can be more precisely controlled. Once inside the cryoFIB-SEM an additional coating of an organoplatinum compound is applied to the surface of the grid via a gas injection system (GIS). This layer protects the front edge of the lamella as it is milled, the integrity of which is critical for achieving uniformly thin lamellae. Regions of interest are identified via SEM and milling is carried out in a step-wise fashion, reducing the current of the ion beam as the lamella reaches electron transparency, in order to avoid excessive heat generation. A grid with multiple lamellae is then transferred to a transmission electron microscope (TEM) under cryogenic conditions for tilt-series acquisition. A robust and contamination-free workflow for lamella preparation is an essential step for downstream techniques, including cellular cryoEM, cryoET, and sub-tomogram averaging. Development of these techniques, especially for lift-out and milling of high-pressure frozen samples, is of high-priority in the field.

Using focused ion beam milling to produce vitreous on-grid lamellae from plunge frozen biological samples for cryo-electron tomography.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

생화학

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

공학

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires a thin layer of vitreous ice containing the biomolecules of interest. Despite numerous technological advances in recent years that have propelled single-particle cryoEM to the forefront of structural biology, the methods by which specimens are vitrified for high-resolution imaging often remain the rate-limiting step. Although numerous recent efforts have provided means to overcome hurdles frequently encountered during specimen vitrification, including the development of novel sample supports and innovative vitrification instrumentation, the traditional manually operated plunger remains a staple in the cryoEM community due to the low cost to purchase and ease of operation. Here, we provide detailed methods for using a standard, guillotine-style manually operated blot-and-plunge device for the vitrification of biological specimens for high-resolution imaging by single-particle cryoEM. Additionally, commonly encountered issues and troubleshooting recommendations for when a standard preparation fails to yield a suitable specimen are also described.

This manuscript outlines the blot-and-plunge method to manually freeze biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Nanoscale Characterization of Liquid-Solid Interfaces by Coupling Cryo-Focused Ion Beam Milling with Scanning Electron Microscopy and Spectroscopy

Physical and chemical processes at solid-liquid interfaces play a crucial role in many natural and technological phenomena, including catalysis, solar energy and fuel generation, and electrochemical energy storage. Nanoscale characterization of such interfaces has recently been achieved using cryogenic electron microscopy, thereby providing a new path to advancing our fundamental understanding of interface processes.
This contribution provides a practical guide to mapping the structure and chemistry of solid-liquid interfaces in materials and devices using an integrated cryogenic electron microscopy approach. In this approach, we pair cryogenic sample preparation which allows stabilization of solid-liquid interfaces with cryogenic focused ion beam (cryo-FIB) milling to create cross-sections through these complex buried structures. Cryogenic scanning electron microscopy (cryo-SEM) techniques performed in a dual-beam FIB/SEM enable direct imaging as well as chemical mapping at the nanoscale. We discuss practical challenges, strategies to overcome them, as well as protocols for obtaining optimal results. While we focus in our discussion on interfaces in energy storage devices, the methods outlined are broadly applicable to a range of fields where solid-liquid interface play a key role.

Cryogenic Focused Ion Beam (FIB) and Scanning Electron Microscopy (SEM) techniques can provide key insights into the chemistry and morphology of intact solid-liquid interfaces. Methods for preparing high quality Energy Dispersive X-ray (EDX) spectroscopic maps of such interfaces are detailed, with a focus on energy storage devices.

Cryo-Focused Ion Beam Milling과 주사 전자 현미경 및 분광법을 결합하여 액체-고체 인터페이스의 나노스케일 특성화

Physical and chemical processes at solid-liquid interfaces play a crucial role in many natural and technological phenomena, including catalysis, solar ...

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

생물학

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

TEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample preparation for cryoEM requires preserving specimens in a thin layer of vitreous ice, typically suspended within the holes of a fenestrated support film. However, all commonly used sample preparation approaches for cryoEM studies expose the specimen to the air-water interface, introducing a strong hydrophobic effect on the specimen that often results in denaturation, aggregation, and complex dissociation. Further, preferred hydrophobic interactions between regions of the specimen and the air-water interface impact the orientations adopted by the macromolecules, resulting in 3D reconstructions with anisotropic directional resolution. 
Adsorption of cryoEM specimens to a monolayer of graphene has been shown to help mitigate interactions with the air-water interface while minimizing the introduction of background noise. Graphene supports also offer the benefit of substantially lowering the required concentration of proteins required for cryoEM imaging. Despite the advantages of these supports, graphene-coated grids are not widely used by the cryoEM community due to the prohibitive expense of commercial options and the challenges associated with large-scale in-house production. This paper describes an efficient method for preparing batches of cryoEM grids that have nearly full coverage of monolayer graphene.

저자 스포트라이트: Enhancing CryoEM Resolution Using Graphene-Coated Grids 

Here, we describe a protocol for applying a single monolayer of graphene to electron microscopy grids and how to prepare them for use in cryoEM structure determination.