This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer's Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

초파리 (16)의 광학 이미징에 대한 OCM 시스템의 1. 준비 <ol><li> 분광기 및 OCM 시스템 초파리의 하트 비트를 해석 할 수 있도록 적어도 80 프레임 / 초의 프레임 속도를 제공하는 고속의 라인 스캔 카메라를 선택한다. </li><li> 초파리의 핵심 구조를 식별하기 위해 2 ㎛, 축 해상도를 보장하는 광대역 광원을 사용한다. </li><li> 높은 가로 해상도를 얻기 위해 10X 목표를 사용합니다. </li><li> 기준 암부 광속을 반사하고, 시험편의 초점 심도를 확장하는 환형 샘플 아암 광빔을 생성하는 45 ° 막대 거울을 사용한다. </li><li> OCM이 시스템을 제어하고 측정을 수행하는 사용자 컴퓨터 프로그램을 개발한다. </li></ol> 2. 초파리 문화 <ol><li> 표준 비행 음식 준비 <ol><li> 폴리스티렌 유리 병에 ~ 5 ml의 인스턴트 초파리 수식을 넣어종이 슈트의 도움 튜브. </li><li> 제대로 음식을 포화 식으로 ~ 8 ml의 물을 붓고. </li><li> 다른 실험에 대한 표준 비행 음식에 다른 보충제를 추가합니다. 실험 35 페이싱 optogenetic에 대한 모든 - 트랜스 레티 날 (ATR) 음식을 준비 할 때, 100 mM의 ATR를 추출하여 식품 1 ㎜의 ATR 농도를 얻을 수 ml의 8 ~에 물을 용해 할 수있는 피펫을 사용합니다. 균일 용액을 혼합 한 후, 화학식로 용액을 붓고 충분히 교반한다. </li><li> 전자 레인지에 30 초 동안 컵과 열을 15 ml의 물과 함께 ~ 10, 15 믹스, 초파리에서 비만 관련 심장 기능 장애 연구 10 ml의 공식을 높은 지방 다이어트를 준비합니다. 다른 컵에 일부 유기농 엑스트라 버진 코코넛 오일을 넣고 전자 레인지에 90 초 정도 가열한다. </li><li> 충분히 음식 ~ 30/100 및 제 코코넛 오일의 중량 / 부피 비율을 7.5 ml의 코코넛 오일을 추출하고, 제조 된 화학식 섞어음식을 혼합 추출물 ~ 2 ml의 욕실 튜브의 바닥에 넣어. </li><li> 매체가 완전히 포화 될 때까지 1 분 동안 기다립니다. 초파리 대한 생활 조건을 최적화하기 위해 평평한 신중 음식을 압축. 준비된 공식 효모의 8 곡물, 면화의 클러스터와 튜브를 연결 - 6을 추가합니다. </li></ol></li><li> 과일 비행 십자가와 문화 <ol><li> 준비된 표준 플라이 음식 튜브를 타고와 연결면을 제거합니다. 조심스럽게 튜브 (남성과 여성) 성인 파리를 전송하고 즉시면에 튜브를 연결합니다. 면 튜브로부터 빠져 나가는 파리 방지 튜브 벽 사이에 틈이 생기지 않도록하려면면을 확인한다. </li><li> 교차 사육을 위해 25 ° C에서 인큐베이터에서 초파리를 유지합니다. 유전자의 대부분은 활성 및 세포 단백질은 25 ° C 36 ~ 39에서 합성된다. </li><li> 8 손 전송 ㄱ 후 인큐베이터에서 튜브를 꺼내는 Dult 실험 제어를위한 비슷한 나이에 알을 얻기 위해 관 밖으로 날아갑니다. </li><li> 8.5 40, 41 일의 개발 기간이 초파리 개발 표준 온도 25 ° C에서 인큐베이터에서 계란을 계속 배양. 참고 : 온도가 발달 기간 (성인에 계란) 및 다양한 유전자의 발현에 영향을 미친다. </li></ol></li></ol> 3. OCM와 광학 이미징을 수행 <ol><li> 광학 이미징에 대한 마운트 플라이 유충 참고 : 22 초파리 해치의 달걀 - 첫 번째 령 유충 (L1)에 25 ° C에서 24 시간. 두 번째 령 유충은 또 다른 24 시간 후에 나온다. 가장 큰 애벌레 형태는 약 24 시간 후 털갈이 세 번째 령 유충입니다. 유충의 구조적 특성들은 상이한 발달 단계를 구별하는데 사용될 수있다. 제 령 및 제 령의 입 부분의 크기는 다르다. 입첫 번째 령 유충의 후크가 매우 작고 두 번째 령 유충의 입 고리가 더 크고 구조가 명확하지만, 작은 검은 점 두 쌍처럼 보인다. spiracles 보통 초 령 및 제 령을 식별하는 데 사용된다. 세 번째 령를 들어, 전방 spiracles이 분기되며, 반면에 두 번째 령 유충은 앞쪽에 spiracles을 때리는했다. 어두운 오렌지 링은 세 번째 령 유충의 후부 spiracles의 끝에서 나타나기 시작합니다. <ol><li> 깨끗한 현미경 유리 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 적용합니다. 촬상시의 기포에 의한 반사를 방지하기 위해 테이프 하에서 기포를 배출. </li><li> 애벌레 단계에서 인큐베이터 밖으로 배양 파리와 튜브 중 하나를 수행합니다. </li><li> 미디어에 유충을 확인 깨끗한 조직에 부드러운 브러시와 장소 미디어에서 제거합니다. 젖은 부드러운 브러시로 유충에 붙어 음식을 제거하고 조직에 건조. </li><li> 소독기 이동넓은 필드 현미경의 대물 렌즈에서 조직에 도착하는 거라고. </li><li> 파리의 명확한 뷰를 찾기 위해 현미경의 초점을 조정합니다. 현미경과의 구조적 특성에 의해 유충의 오른쪽 발달 단계를 확인합니다. </li><li> 부드러운 브러쉬를 사용하여 비행을 배치합니다. 몸이 똑바로 지느러미 옆 유리 슬라이드에 장착하기위한 준비를 위쪽으로 향하게 지느러미면이 있는지 확인하십시오. 현미경이 단계를 수행합니다. </li><li> 유충이 테이프에 장착하기 전에 완전히 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 유충은 테이프에 부착되지 않습니다. </li><li> 적당한 압력으로 유리 슬라이드에 양면 테이프에 위치 파리의 지느러미 측면 스틱. 촬영하는 동안 움직임을 비행 이어질 것 즉시 너무 작은 힘을 죽일 수 너무 많은 압력을합니다. </li></ol></li><li> OCM와 애벌레 스테이지 (L2 및 L3)에서 초파리의 광학 이미징 참고 : 심장 튜브의 광범위한 루멘이 fo를 할 수 있습니다싶게 애벌레 단계에서 A8에 A5 사이의 세그먼트에 위치 (그림 1). 횡 OCM M 모드 화상 (2D + 시간) 수축기 및 확장기 분석을 용이하게하기 위해 각각의 유충 중심 관의 A7 세그먼트에서 획득 하였다. <ol><li> 대물 렌즈 아래에서 위로 향하게 지느러미 측면의 y 가로 방향의 OCM 시스템의 조정 샘플 무대에 탑재 된 애벌레를 놓습니다. 시료 대에 작은 구멍을 스테이지면과의 접촉을 피하도록 유충을 배치 할 필요가있다. </li><li> 열매의 중심 관 이미징 빔의 초점면까지의 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 용이 A7 세그먼트를 찾기 위해, 실시간 화상 획득 소프트웨어 단면 OCM 이미지와 중심 관의 구치부를 찾는. A7 세그먼트가 볼 때까지 앞으로 단계를 이동합니다. </li><li> 세트 B 스캔 100 A-스캔 (프레임) (100) B-스캔으로 화상 획득 소프트웨어 파라미터 및 scanneR 전압 ~ 0.28의 x 폭 방향 mm, 및 Y-가로 방향의 V 0을 포함한다. 어두운 천으로 샘플 빔 경로를 차단하여 배경 공제에 대한 배경 잡음 데이터를 수집하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 백 프레임 (3)은 배경 차감을 위해 사용될 수있다. </li><li> B 주사 당 128 A-스캔 4096 B-스캔 스캐너 전압 데이터 수집 소프트웨어의 집합 파라미터들은, Y 가로 방향은 X 가로 방향 ~ 0.28 mm, 0 V를 포함한다. 약 30 초 동안 0.28 X 0.57 mm (2)를 커버하는 영역에 즉시 심장 튜브의 A7 세그먼트에 걸쳐 가로 M 모드 이미지를 수집하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 촬상 광 플라이 심장의 긴 노출을 방지하기 위해, 데이터 저장 과정에서 어두운 천을 사용하여 이미징 빔을 차단. </li><li> 심장 재미 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 5 회 측정을 반복ction. </li><li> B 주사 당 400 A-스캔 800 B-스캔 스캐너 전압 화상 획득 소프트웨어 파라미터 설정은 X 가로 방향 ~ 1.7 mm를 커버하고, Y 가로 방향으로 4 ~ mm한다. 전체 과일 파리가 이미지화 할 수 있도록 양방향으로 무대를 이동합니다. 3 차원 초파리의 이미지를 얻기 위해 하나의 데이터 집합을 획득하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 3D 플라이 구조 아미라 3D 소프트웨어를 사용하여 표현 될 수있다 </li><li> 측정 된 파리를 묻혀 살짝 유리 슬라이드에서 제거 젖은 부드러운 브러시를 사용합니다. 지속적인 개발을위한 별도의 튜브로 이동합니다. 다음 발달 단계를 통해 종 연구를위한 튜브를 레이블. </li></ol></li><li> 번데기의 단계에서 이미지 초파리 참고 : 모든 과일 파리는 PD1에서 PD5에 이미징 꺼냈다. 도 1b에 유충 회로도에 도시 된 바와 같이, 넓은 관강은 번째의 세그먼트 A8 A5 유지PD1까지 전자 심장 튜브. PD2에서 원추형 챔버는 A4 세그먼트에 A1 사이에서 발생하기 시작한다. 일관된 이미지를 수집하고 심장의 분석을 용이하게하기 위해, 횡 M 모드 이미지 PD1에서 A7 세그먼트로부터 수득하고,도 1B에 표시된 바와 같이, PD2 후 A1 세그먼트에서. <ol><li> PD1에서 이미지 초파리 참고 : 초파리는 짧은 시간 창 흰색 puparium해야합니다 - PD1 동안 (0, 1 시간). 이 시간 창은 높은 투명성이 OCM 영상에 대한 높은 빛의 침투에 이르게하기 때문에 조기 번데기의 광학 이미징을 수행하기에 적합합니다. <ol><li> 그들은 번데기가 될 때 초파리는 튜브 벽에서 찾을 수있는 바와 같이, 젖은 부드러운 브러시로 PD1에서 이미지에 대한 개별 튜브에서 번데기를 제거하고 몸에 붙어있는 음식이있는 경우 브러시와 번데기를 청소합니다. </li><li> 직접 젖은 브러시로 작은 유리 슬라이드에 초파리를 탑재하고 위로 향하게 지느러미 측면을 유지 (그림 1a </str옹&gt;). 유리 슬라이드는이 단계에서 영상이 완료되면 튜브로 다시 맞게 충분히 작은 있는지 확인합니다. </li><li> 즉시 본체의 측면에서 과도한 물을 제거합니다. </li><li> 상단에 초파리를 유지하면서 OCM 시스템의 샘플 무대에서 유리 슬라이드를 넣습니다. 유충 측정에 설명 된 것과 동일한 전략을 이용하여 비행 마음의 A7 세그먼트의 명확한 실시간으로 이미지를 찾을 수 있습니다. </li><li> 섹션 3.2에서와 같이, 데이터 수집 소프트웨어의 동일한 매개 변수를 설정하고, 이미지 A7 세그먼트에서의 하트 비트 횡 M 모드 및 3D 이미지를 획득. </li><li> 촬영 후, 다시 연속 배양 용 튜브에 번데기와 유리 슬라이드를 배치하기 위해 트위터를 사용합니다. </li></ol></li><li> PD5의 단계에 PD2에서 이미지 초파리 주 : 시험편 더 불투명 번데기 단계 동안지기 때문에, 촬상 장치의 투과 깊이가 감소된다. <ol><li> 신중 유리 S를 제거하는 집게를 사용하여LIDE은 이미징을위한 튜브에서 PD2에서 비행 장착. PD2에서 시험편 쉘 황색이되고 본체 PD1 (도 1)에 비해 덜 투명해진다. </li><li> OCM 시스템의 샘플 무대에 슬라이드를 넣습니다. </li><li> OCM이 시스템의 이미징 빔의 초점면에 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 실시간 단면 OCM 이미지 심장 튜브의 앞쪽 끝을 찾을 수 있습니다. 심장 튜브의 A1 세그먼트를 찾기 위해 다시 후방 방향으로 ~ 50 μm의 이동합니다. 참고 : 심장 개발 (PD2)의이 시점에서, 원추형 챔버는 매우 작은되며 박동되지 않을 수 있습니다. </li><li> 이전 발달 단계와 동일한 방법을 이용하여 횡 A1 세그먼트로부터 M 모드 데이터 세트뿐만 아니라, 3 차원 데이터를 수집한다. </li><li> 연속 배양주의 깊게 튜브로 다시 슬라이드를 넣습니다. 주 : PD3에서, 쉘의 시험편의 색 PD2 단계에서보다 더 어둡다. PD4 단계에서, 검은 색 줄무늬가 캘리포니아n은 표본의 쉘 내부에 관찰 될 수있다. 다른 사람이 PD5로 진화하면서 일부 파리, 다음 날에이 단계에서 성인으로 개발할 것입니다. PD5 단계에서, 검은 색 줄무늬가 더욱 분명 초파리에서 볼 수 있습니다. 이 파리는 다음 날 성인이 될 것입니다. </li></ol></li></ol></li><li> 성인 단계에서 이미지 초파리 주 : 성인 단계에서 암수 파리 상기 본체의 크기 및 하복부의 컬러에 의해 구별 될 수있다. 남성은 작고 어두운 색의 하복부에있는 동안 여성 성인, 큰 크기를 가지고있다. <ol><li> 초파리가 성인으로 발전 할 때 인큐베이터에서 튜브를 꺼내, 그리고 성인이 ~ 45 ml의 빈 유리 병에 도착 전송합니다. </li><li> , 마취에 지팡이의 흡수 끝 (~ 1cm 길이, 2 ~ 3 mm 직경)를 찍어 유리 병에 지팡이를 넣어 바로 연결면 아래와로 마취 끝을 유지하는면의 클러스터와 튜브를 연결 anes3 분 동안 비행을 thetize. 마취의 지속 시간은 비행의 크기에 따라 달라집니다 및 분 3.5-2.5 사이에 다를 수 있습니다 (예 : 분 3 여성, 최소 2.5 남성 또는 3.5). </li><li> 양면 테이프의 조각 유리 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 등쪽면이 위를 향 부드러운 브러시를 사용하여 유리 슬라이드 상에 마취 비행 이동합니다. </li><li> 트위터를 사용하여 날개를 분리하고 즉시 수정 및 이미징의 심장 영역을 노출하는 현미경 테이프의 날개 스틱. </li><li> 이미지 플라이 마음의 A1 세그먼트에서 파리 (그림 1). 실험의 끝에, 플라이 희생 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 분석 (16) <ol><li> 화상 파일 화상 획득 소프트웨어에 수집 된 2D 및 3D 이진 파일을 변환 매트랩 프로그램을 개발한다. </li><li> creat에하는 횡 M 모드 이미지에서 심장 튜브 영역과 마법의 지팡이 알고리즘을 식별 할 수 ImageJ에를 사용하여각 횡 M 모드 이미지의 심장 지역의 개 마스크입니다. 세그먼트 마스크 영역과 수축기 및 이완기의 위치를 ​​식별하는 피크 발견 알고리즘을 사용한다. 가로 M 모드 이미지의 시간 의존 심장 직경의 변화를 계산합니다. </li><li> 상기 취득 시간 의존성 심장 직경에 기초하여, 예컨대 HR 심장 활동주기 (CAP), 말기 직경 (EDD), 단부 수축기 직경 (ESD), 말기 영역 (EDA)와 심장 파라미터를 계산하고 (수축기 면적 종료 ESA). 소수 단축 (FS)와 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> 플라이 심장의 구조 개발을 시각화하기 위해 3D OCM 이미지를 분석 ImageJ에 사용합니다. </li></ol>

The authors declare no conflicts of interests related to the current study.

애벌레와 성인 단계에서 400 BPM 주위 최대 HR과 초파리의 빠른 심장 박동, 심장 diastoles 및 systoles (경험을 바탕으로 더 이상 80 프레임 / 초)를 해결하기 위해 높은 이미징 속도를 필요로한다. 작기 때문에 심실 크기 및 마이크론 스케일 심장 벽의 두께 (5-10 μm의) 높은 공간 분해능 (2 ㎛의보다 나은) 중심 관 구조를 해결하기위한 요구된다. 본 연구에서는, 고해상도 및 고속 초고 OCM 시스템 격자 ...

작은 동물의 마음의 종단 연구는 유전자와 관련된 선천성 심장 결함 1,2 인간 관련 심혈관 질환의 다양한 이해에 기여한다. 지난 수십 년 동안, 이러한 마우스 3,4-, 5,6- 제노, 제브라 7,8 조류 9 및 초파리 10-16와 같은 다양한 동물 모델에서의 연구와 관련된 인간의 심장 개발을 수행하는데 사용되어왔다. 마우스 모델 널리 정상 및 비정상 심장 개발 및 인간 심장 3,4과의 유사성으로 인해 심장 결함 표현형을 연구하기 위해 사용되었다. Xenopus의 배아 때문에 쉬운 취급 및 부분 투명 5,6에 심장 개발의 연구에서 특히 유용합니다. 배아와 제브라 피쉬 모델의 초기 유충의 투명성 심장 개발 7,8 쉽게 광학 관찰 할 수 있습니다. 조류 모델은 발달 심장 연구의 일반적인 될 수 있습니다 becaus전자 심장 쉽게 알 껍질과 인간 9 조류 마음의 형태 학적 유사성을 제거한 후 액세스 할 수 있습니다. 초파리 모델은 마음의 종 방향 연구를 수행하기에 이상적 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 초파리의 심장 관은 심장의 광 액세스 및 관찰 편의를 제공하는 등의 표면 아래 ~ 200 μm의이다. 또한, 많은 분자 메커니즘 및 유전 경로는 초파리와 척추 동물 사이에 보존되어있다. 인간의 질환 유전자의 75 % 이상의 orthologs은 널리 유전자 연구에 사용 11,13 만든 초파리에서 밝혀졌다. 또한, 짧은 수명과 낮은 유지 보수 비용을 가지며, 일반적으로 발생 생물학 연구 14-16 검체 모델로 사용되고있다. 이전 보고서는 그 예로서 초파리 심장 기능을 모니터링하기위한 프로토콜을 묘사artbeat. 그러나, 해부 절차는 17, 18를 요구했다. 광학 이미징 인해 비 침습 자연 동물에서 심장 개발을 시각화 할 수있는 효과적인 방법을 제공합니다. 다른 광학 이미징 양식은 두 광자 현미경 (19), 공 초점 현미경 (20, 21), 빛 시트 현미경 (22), 및 빛 간섭 단층 촬영 16,23-26으로 수행 동물 심장 연구에 적용되었습니다. 비교적으로, 간섭 단층 촬영 살아있는 동물에 중요한 높은 해상도 및 초고 촬상 속도를 유지하면서, 조영제를 사용하지 않고, 작은 동물 하트 큰 촬상 깊이를 제공 할 수있다. 또한의 OCT 시스템 개발의 저비용 시험편 광학 이미징 기술이 대중화되었다. 간섭 단층 성공적 초파리의 길이 연구에 사용되었다. OCT를 심장 형태 학적 및 기능적 촬상 심장 구조를 연구하기 위해 수행 된 사용하여 FUNC적인 유전자의 역할 및 심장 개발하는 동안 돌연변이 모델에서 심장 혈관 결함의 메커니즘. 예를 들어, 연령에 따라 심장 기능의 감소는 OCT 27 초파리에서 다운 규제 안지오텐신 전환 효소 관련 (ACER) 유전자로 확인되었다. 유전자 관련 심근 병증의 표현형은 10월 28-33를 사용하여 초파리에서 입증되었다. 연구 사용 10월은 초파리 (34)의 중심에 인간의 SOX5 유전자의 기능적 역할을 한 것으로 보입니다. 간섭 단층 비해 OCM 더 가로 해상도를 제공하기 위해 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈를 사용한다. 과거에서, ortholog 인간 주기성 유전자 dCry / dClock 입을로 인한 심장 기능 장애는 비만 유도 인간 이해 맞춤 OCM 시스템 (15, 16),뿐만 아니라 초파리 심근증에 고 지방식이의 효과를 사용하여 연구되어왔다 심장 질환. (15) 여기에, 일전자 실험 프로토콜은 두 번째 령 (L2), 세 번째 령 (L3), 번데기 1 일 (PD1), 번데기 2 일 (PD2), 번데기 3 일에서 초파리의 심장 형태 학적 및 기능적 변화의 길이 방향 연구 (PD3)를 요약 , 번데기 4 일 인간과 관련된 선천성 심장 질환의 연구를 촉진하기 위해 OCM을 사용하여 (PD4), 번데기 5 일 (PD5), 성인 (그림 1). 이러한 HR 및 CAP 등 심장 기능 매개 변수를 정량적으로 심장 개발 기능을 나타 내기 위해 다른 발달 단계에서 분석 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="515">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Custom OCM imaging system</td>
			<td style="width:136px;">Developed in our lab</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">my Temp Mini Digital Incubator</td>
			<td style="width:136px;">Benchmark</td>
			<td style="width:95px;">H2200-HC</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Cover glass</td>
			<td style="width:136px;">AmScope</td>
			<td style="width:95px;">200PCS</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Cotton Ball</td>
			<td style="width:136px;">RITE AID</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Instant Drosophila Formula</td>
			<td style="width:136px;">CAROLINA</td>
			<td style="width:95px;">formula 4-24</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Yeast</td>
			<td style="width:136px;">ActiveDry</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Microscope</td>
			<td style="width:136px;">SONY</td>
			<td style="width:95px;">WILD M420</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Brush</td>
			<td style="width:136px;">Loew-Cornell</td>
			<td style="width:95px;">245B</td>
			<td style="width:117px;">being used to move specimens</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Labview software</td>
			<td style="width:136px;">National Instruments</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Image J</td>
			<td style="width:136px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Matlab</td>
			<td style="width:136px;">Mathworks</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Tweezer</td>
			<td style="width:136px;">Wiha</td>
			<td style="width:95px;">AA SA</td>
			<td style="width:117px;">to fix the fruit fly wings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">FlyNap</td>
			<td style="width:136px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:95px;">4,224,898</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M</td>
			<td style="width:136px;">Scotch</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Pipette</td>
			<td style="width:136px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:95px;">MU18837</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:168px;">Organic Extra Coconut Oil</td>
			<td style="width:136px;">Spring Valley</td>
			<td style="width:95px;">13183</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:136px;">CapitolBrand</td>
			<td style="width:95px;">M3504-E</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Drosophila Vials</td>
			<td style="width:136px;">SEOH</td>
			<td style="width:95px;">8401SS</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">All-trans-retinal</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:95px;">R2500</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (ocm)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

길이 심장 이미징 OCM 실온에서 24B-GAL4 / + 균주와 초파리를 사용하여 수행 하였다. 측정 L2, L3에서 수행하고, PD4에 PD1에서 8 시간 간격으로, 성인 1 일 (AD1)는 변형 과정 (표 1)를 추적 할 수 있었다. 유충, 번데기 초, 늦은 번데기 및 성인 파리는 그림 1A에서 볼 수 있듯이 유리 슬라이드에 장착했다. 애벌레와 성인 파리의 심장의 세그먼트 기능은 그림 1B의 개략적 ?...

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Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

drosophila-preparation-longitudinal-imaging-heart-function-vivo-using

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

10.8K 조회수.  Lehigh University. Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

비디오: Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

전체 심장 이미징에 대한 형광 광 프로젝션 Tomography에 대한 출생 정규화

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...