This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer's Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

초파리 (16)의 광학 이미징에 대한 OCM 시스템의 1. 준비 <ol><li> 분광기 및 OCM 시스템 초파리의 하트 비트를 해석 할 수 있도록 적어도 80 프레임 / 초의 프레임 속도를 제공하는 고속의 라인 스캔 카메라를 선택한다. </li><li> 초파리의 핵심 구조를 식별하기 위해 2 ㎛, 축 해상도를 보장하는 광대역 광원을 사용한다. </li><li> 높은 가로 해상도를 얻기 위해 10X 목표를 사용합니다. </li><li> 기준 암부 광속을 반사하고, 시험편의 초점 심도를 확장하는 환형 샘플 아암 광빔을 생성하는 45 ° 막대 거울을 사용한다. </li><li> OCM이 시스템을 제어하고 측정을 수행하는 사용자 컴퓨터 프로그램을 개발한다. </li></ol> 2. 초파리 문화 <ol><li> 표준 비행 음식 준비 <ol><li> 폴리스티렌 유리 병에 ~ 5 ml의 인스턴트 초파리 수식을 넣어종이 슈트의 도움 튜브. </li><li> 제대로 음식을 포화 식으로 ~ 8 ml의 물을 붓고. </li><li> 다른 실험에 대한 표준 비행 음식에 다른 보충제를 추가합니다. 실험 35 페이싱 optogenetic에 대한 모든 - 트랜스 레티 날 (ATR) 음식을 준비 할 때, 100 mM의 ATR를 추출하여 식품 1 ㎜의 ATR 농도를 얻을 수 ml의 8 ~에 물을 용해 할 수있는 피펫을 사용합니다. 균일 용액을 혼합 한 후, 화학식로 용액을 붓고 충분히 교반한다. </li><li> 전자 레인지에 30 초 동안 컵과 열을 15 ml의 물과 함께 ~ 10, 15 믹스, 초파리에서 비만 관련 심장 기능 장애 연구 10 ml의 공식을 높은 지방 다이어트를 준비합니다. 다른 컵에 일부 유기농 엑스트라 버진 코코넛 오일을 넣고 전자 레인지에 90 초 정도 가열한다. </li><li> 충분히 음식 ~ 30/100 및 제 코코넛 오일의 중량 / 부피 비율을 7.5 ml의 코코넛 오일을 추출하고, 제조 된 화학식 섞어음식을 혼합 추출물 ~ 2 ml의 욕실 튜브의 바닥에 넣어. </li><li> 매체가 완전히 포화 될 때까지 1 분 동안 기다립니다. 초파리 대한 생활 조건을 최적화하기 위해 평평한 신중 음식을 압축. 준비된 공식 효모의 8 곡물, 면화의 클러스터와 튜브를 연결 - 6을 추가합니다. </li></ol></li><li> 과일 비행 십자가와 문화 <ol><li> 준비된 표준 플라이 음식 튜브를 타고와 연결면을 제거합니다. 조심스럽게 튜브 (남성과 여성) 성인 파리를 전송하고 즉시면에 튜브를 연결합니다. 면 튜브로부터 빠져 나가는 파리 방지 튜브 벽 사이에 틈이 생기지 않도록하려면면을 확인한다. </li><li> 교차 사육을 위해 25 ° C에서 인큐베이터에서 초파리를 유지합니다. 유전자의 대부분은 활성 및 세포 단백질은 25 ° C 36 ~ 39에서 합성된다. </li><li> 8 손 전송 ㄱ 후 인큐베이터에서 튜브를 꺼내는 Dult 실험 제어를위한 비슷한 나이에 알을 얻기 위해 관 밖으로 날아갑니다. </li><li> 8.5 40, 41 일의 개발 기간이 초파리 개발 표준 온도 25 ° C에서 인큐베이터에서 계란을 계속 배양. 참고 : 온도가 발달 기간 (성인에 계란) 및 다양한 유전자의 발현에 영향을 미친다. </li></ol></li></ol> 3. OCM와 광학 이미징을 수행 <ol><li> 광학 이미징에 대한 마운트 플라이 유충 참고 : 22 초파리 해치의 달걀 - 첫 번째 령 유충 (L1)에 25 ° C에서 24 시간. 두 번째 령 유충은 또 다른 24 시간 후에 나온다. 가장 큰 애벌레 형태는 약 24 시간 후 털갈이 세 번째 령 유충입니다. 유충의 구조적 특성들은 상이한 발달 단계를 구별하는데 사용될 수있다. 제 령 및 제 령의 입 부분의 크기는 다르다. 입첫 번째 령 유충의 후크가 매우 작고 두 번째 령 유충의 입 고리가 더 크고 구조가 명확하지만, 작은 검은 점 두 쌍처럼 보인다. spiracles 보통 초 령 및 제 령을 식별하는 데 사용된다. 세 번째 령를 들어, 전방 spiracles이 분기되며, 반면에 두 번째 령 유충은 앞쪽에 spiracles을 때리는했다. 어두운 오렌지 링은 세 번째 령 유충의 후부 spiracles의 끝에서 나타나기 시작합니다. <ol><li> 깨끗한 현미경 유리 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 적용합니다. 촬상시의 기포에 의한 반사를 방지하기 위해 테이프 하에서 기포를 배출. </li><li> 애벌레 단계에서 인큐베이터 밖으로 배양 파리와 튜브 중 하나를 수행합니다. </li><li> 미디어에 유충을 확인 깨끗한 조직에 부드러운 브러시와 장소 미디어에서 제거합니다. 젖은 부드러운 브러시로 유충에 붙어 음식을 제거하고 조직에 건조. </li><li> 소독기 이동넓은 필드 현미경의 대물 렌즈에서 조직에 도착하는 거라고. </li><li> 파리의 명확한 뷰를 찾기 위해 현미경의 초점을 조정합니다. 현미경과의 구조적 특성에 의해 유충의 오른쪽 발달 단계를 확인합니다. </li><li> 부드러운 브러쉬를 사용하여 비행을 배치합니다. 몸이 똑바로 지느러미 옆 유리 슬라이드에 장착하기위한 준비를 위쪽으로 향하게 지느러미면이 있는지 확인하십시오. 현미경이 단계를 수행합니다. </li><li> 유충이 테이프에 장착하기 전에 완전히 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 유충은 테이프에 부착되지 않습니다. </li><li> 적당한 압력으로 유리 슬라이드에 양면 테이프에 위치 파리의 지느러미 측면 스틱. 촬영하는 동안 움직임을 비행 이어질 것 즉시 너무 작은 힘을 죽일 수 너무 많은 압력을합니다. </li></ol></li><li> OCM와 애벌레 스테이지 (L2 및 L3)에서 초파리의 광학 이미징 참고 : 심장 튜브의 광범위한 루멘이 fo를 할 수 있습니다싶게 애벌레 단계에서 A8에 A5 사이의 세그먼트에 위치 (그림 1). 횡 OCM M 모드 화상 (2D + 시간) 수축기 및 확장기 분석을 용이하게하기 위해 각각의 유충 중심 관의 A7 세그먼트에서 획득 하였다. <ol><li> 대물 렌즈 아래에서 위로 향하게 지느러미 측면의 y 가로 방향의 OCM 시스템의 조정 샘플 무대에 탑재 된 애벌레를 놓습니다. 시료 대에 작은 구멍을 스테이지면과의 접촉을 피하도록 유충을 배치 할 필요가있다. </li><li> 열매의 중심 관 이미징 빔의 초점면까지의 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 용이 A7 세그먼트를 찾기 위해, 실시간 화상 획득 소프트웨어 단면 OCM 이미지와 중심 관의 구치부를 찾는. A7 세그먼트가 볼 때까지 앞으로 단계를 이동합니다. </li><li> 세트 B 스캔 100 A-스캔 (프레임) (100) B-스캔으로 화상 획득 소프트웨어 파라미터 및 scanneR 전압 ~ 0.28의 x 폭 방향 mm, 및 Y-가로 방향의 V 0을 포함한다. 어두운 천으로 샘플 빔 경로를 차단하여 배경 공제에 대한 배경 잡음 데이터를 수집하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 백 프레임 (3)은 배경 차감을 위해 사용될 수있다. </li><li> B 주사 당 128 A-스캔 4096 B-스캔 스캐너 전압 데이터 수집 소프트웨어의 집합 파라미터들은, Y 가로 방향은 X 가로 방향 ~ 0.28 mm, 0 V를 포함한다. 약 30 초 동안 0.28 X 0.57 mm (2)를 커버하는 영역에 즉시 심장 튜브의 A7 세그먼트에 걸쳐 가로 M 모드 이미지를 수집하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 촬상 광 플라이 심장의 긴 노출을 방지하기 위해, 데이터 저장 과정에서 어두운 천을 사용하여 이미징 빔을 차단. </li><li> 심장 재미 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 5 회 측정을 반복ction. </li><li> B 주사 당 400 A-스캔 800 B-스캔 스캐너 전압 화상 획득 소프트웨어 파라미터 설정은 X 가로 방향 ~ 1.7 mm를 커버하고, Y 가로 방향으로 4 ~ mm한다. 전체 과일 파리가 이미지화 할 수 있도록 양방향으로 무대를 이동합니다. 3 차원 초파리의 이미지를 얻기 위해 하나의 데이터 집합을 획득하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 3D 플라이 구조 아미라 3D 소프트웨어를 사용하여 표현 될 수있다 </li><li> 측정 된 파리를 묻혀 살짝 유리 슬라이드에서 제거 젖은 부드러운 브러시를 사용합니다. 지속적인 개발을위한 별도의 튜브로 이동합니다. 다음 발달 단계를 통해 종 연구를위한 튜브를 레이블. </li></ol></li><li> 번데기의 단계에서 이미지 초파리 참고 : 모든 과일 파리는 PD1에서 PD5에 이미징 꺼냈다. 도 1b에 유충 회로도에 도시 된 바와 같이, 넓은 관강은 번째의 세그먼트 A8 A5 유지PD1까지 전자 심장 튜브. PD2에서 원추형 챔버는 A4 세그먼트에 A1 사이에서 발생하기 시작한다. 일관된 이미지를 수집하고 심장의 분석을 용이하게하기 위해, 횡 M 모드 이미지 PD1에서 A7 세그먼트로부터 수득하고,도 1B에 표시된 바와 같이, PD2 후 A1 세그먼트에서. <ol><li> PD1에서 이미지 초파리 참고 : 초파리는 짧은 시간 창 흰색 puparium해야합니다 - PD1 동안 (0, 1 시간). 이 시간 창은 높은 투명성이 OCM 영상에 대한 높은 빛의 침투에 이르게하기 때문에 조기 번데기의 광학 이미징을 수행하기에 적합합니다. <ol><li> 그들은 번데기가 될 때 초파리는 튜브 벽에서 찾을 수있는 바와 같이, 젖은 부드러운 브러시로 PD1에서 이미지에 대한 개별 튜브에서 번데기를 제거하고 몸에 붙어있는 음식이있는 경우 브러시와 번데기를 청소합니다. </li><li> 직접 젖은 브러시로 작은 유리 슬라이드에 초파리를 탑재하고 위로 향하게 지느러미 측면을 유지 (그림 1a </str옹&gt;). 유리 슬라이드는이 단계에서 영상이 완료되면 튜브로 다시 맞게 충분히 작은 있는지 확인합니다. </li><li> 즉시 본체의 측면에서 과도한 물을 제거합니다. </li><li> 상단에 초파리를 유지하면서 OCM 시스템의 샘플 무대에서 유리 슬라이드를 넣습니다. 유충 측정에 설명 된 것과 동일한 전략을 이용하여 비행 마음의 A7 세그먼트의 명확한 실시간으로 이미지를 찾을 수 있습니다. </li><li> 섹션 3.2에서와 같이, 데이터 수집 소프트웨어의 동일한 매개 변수를 설정하고, 이미지 A7 세그먼트에서의 하트 비트 횡 M 모드 및 3D 이미지를 획득. </li><li> 촬영 후, 다시 연속 배양 용 튜브에 번데기와 유리 슬라이드를 배치하기 위해 트위터를 사용합니다. </li></ol></li><li> PD5의 단계에 PD2에서 이미지 초파리 주 : 시험편 더 불투명 번데기 단계 동안지기 때문에, 촬상 장치의 투과 깊이가 감소된다. <ol><li> 신중 유리 S를 제거하는 집게를 사용하여LIDE은 이미징을위한 튜브에서 PD2에서 비행 장착. PD2에서 시험편 쉘 황색이되고 본체 PD1 (도 1)에 비해 덜 투명해진다. </li><li> OCM 시스템의 샘플 무대에 슬라이드를 넣습니다. </li><li> OCM이 시스템의 이미징 빔의 초점면에 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 실시간 단면 OCM 이미지 심장 튜브의 앞쪽 끝을 찾을 수 있습니다. 심장 튜브의 A1 세그먼트를 찾기 위해 다시 후방 방향으로 ~ 50 μm의 이동합니다. 참고 : 심장 개발 (PD2)의이 시점에서, 원추형 챔버는 매우 작은되며 박동되지 않을 수 있습니다. </li><li> 이전 발달 단계와 동일한 방법을 이용하여 횡 A1 세그먼트로부터 M 모드 데이터 세트뿐만 아니라, 3 차원 데이터를 수집한다. </li><li> 연속 배양주의 깊게 튜브로 다시 슬라이드를 넣습니다. 주 : PD3에서, 쉘의 시험편의 색 PD2 단계에서보다 더 어둡다. PD4 단계에서, 검은 색 줄무늬가 캘리포니아n은 표본의 쉘 내부에 관찰 될 수있다. 다른 사람이 PD5로 진화하면서 일부 파리, 다음 날에이 단계에서 성인으로 개발할 것입니다. PD5 단계에서, 검은 색 줄무늬가 더욱 분명 초파리에서 볼 수 있습니다. 이 파리는 다음 날 성인이 될 것입니다. </li></ol></li></ol></li><li> 성인 단계에서 이미지 초파리 주 : 성인 단계에서 암수 파리 상기 본체의 크기 및 하복부의 컬러에 의해 구별 될 수있다. 남성은 작고 어두운 색의 하복부에있는 동안 여성 성인, 큰 크기를 가지고있다. <ol><li> 초파리가 성인으로 발전 할 때 인큐베이터에서 튜브를 꺼내, 그리고 성인이 ~ 45 ml의 빈 유리 병에 도착 전송합니다. </li><li> , 마취에 지팡이의 흡수 끝 (~ 1cm 길이, 2 ~ 3 mm 직경)를 찍어 유리 병에 지팡이를 넣어 바로 연결면 아래와로 마취 끝을 유지하는면의 클러스터와 튜브를 연결 anes3 분 동안 비행을 thetize. 마취의 지속 시간은 비행의 크기에 따라 달라집니다 및 분 3.5-2.5 사이에 다를 수 있습니다 (예 : 분 3 여성, 최소 2.5 남성 또는 3.5). </li><li> 양면 테이프의 조각 유리 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 등쪽면이 위를 향 부드러운 브러시를 사용하여 유리 슬라이드 상에 마취 비행 이동합니다. </li><li> 트위터를 사용하여 날개를 분리하고 즉시 수정 및 이미징의 심장 영역을 노출하는 현미경 테이프의 날개 스틱. </li><li> 이미지 플라이 마음의 A1 세그먼트에서 파리 (그림 1). 실험의 끝에, 플라이 희생 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 분석 (16) <ol><li> 화상 파일 화상 획득 소프트웨어에 수집 된 2D 및 3D 이진 파일을 변환 매트랩 프로그램을 개발한다. </li><li> creat에하는 횡 M 모드 이미지에서 심장 튜브 영역과 마법의 지팡이 알고리즘을 식별 할 수 ImageJ에를 사용하여각 횡 M 모드 이미지의 심장 지역의 개 마스크입니다. 세그먼트 마스크 영역과 수축기 및 이완기의 위치를 ​​식별하는 피크 발견 알고리즘을 사용한다. 가로 M 모드 이미지의 시간 의존 심장 직경의 변화를 계산합니다. </li><li> 상기 취득 시간 의존성 심장 직경에 기초하여, 예컨대 HR 심장 활동주기 (CAP), 말기 직경 (EDD), 단부 수축기 직경 (ESD), 말기 영역 (EDA)와 심장 파라미터를 계산하고 (수축기 면적 종료 ESA). 소수 단축 (FS)와 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> 플라이 심장의 구조 개발을 시각화하기 위해 3D OCM 이미지를 분석 ImageJ에 사용합니다. </li></ol>

The authors declare no conflicts of interests related to the current study.

애벌레와 성인 단계에서 400 BPM 주위 최대 HR과 초파리의 빠른 심장 박동, 심장 diastoles 및 systoles (경험을 바탕으로 더 이상 80 프레임 / 초)를 해결하기 위해 높은 이미징 속도를 필요로한다. 작기 때문에 심실 크기 및 마이크론 스케일 심장 벽의 두께 (5-10 μm의) 높은 공간 분해능 (2 ㎛의보다 나은) 중심 관 구조를 해결하기위한 요구된다. 본 연구에서는, 고해상도 및 고속 초고 OCM 시스템 격자 ...

작은 동물의 마음의 종단 연구는 유전자와 관련된 선천성 심장 결함 1,2 인간 관련 심혈관 질환의 다양한 이해에 기여한다. 지난 수십 년 동안, 이러한 마우스 3,4-, 5,6- 제노, 제브라 7,8 조류 9 및 초파리 10-16와 같은 다양한 동물 모델에서의 연구와 관련된 인간의 심장 개발을 수행하는데 사용되어왔다. 마우스 모델 널리 정상 및 비정상 심장 개발 및 인간 심장 3,4과의 유사성으로 인해 심장 결함 표현형을 연구하기 위해 사용되었다. Xenopus의 배아 때문에 쉬운 취급 및 부분 투명 5,6에 심장 개발의 연구에서 특히 유용합니다. 배아와 제브라 피쉬 모델의 초기 유충의 투명성 심장 개발 7,8 쉽게 광학 관찰 할 수 있습니다. 조류 모델은 발달 심장 연구의 일반적인 될 수 있습니다 becaus전자 심장 쉽게 알 껍질과 인간 9 조류 마음의 형태 학적 유사성을 제거한 후 액세스 할 수 있습니다. 초파리 모델은 마음의 종 방향 연구를 수행하기에 이상적 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 초파리의 심장 관은 심장의 광 액세스 및 관찰 편의를 제공하는 등의 표면 아래 ~ 200 μm의이다. 또한, 많은 분자 메커니즘 및 유전 경로는 초파리와 척추 동물 사이에 보존되어있다. 인간의 질환 유전자의 75 % 이상의 orthologs은 널리 유전자 연구에 사용 11,13 만든 초파리에서 밝혀졌다. 또한, 짧은 수명과 낮은 유지 보수 비용을 가지며, 일반적으로 발생 생물학 연구 14-16 검체 모델로 사용되고있다. 이전 보고서는 그 예로서 초파리 심장 기능을 모니터링하기위한 프로토콜을 묘사artbeat. 그러나, 해부 절차는 17, 18를 요구했다. 광학 이미징 인해 비 침습 자연 동물에서 심장 개발을 시각화 할 수있는 효과적인 방법을 제공합니다. 다른 광학 이미징 양식은 두 광자 현미경 (19), 공 초점 현미경 (20, 21), 빛 시트 현미경 (22), 및 빛 간섭 단층 촬영 16,23-26으로 수행 동물 심장 연구에 적용되었습니다. 비교적으로, 간섭 단층 촬영 살아있는 동물에 중요한 높은 해상도 및 초고 촬상 속도를 유지하면서, 조영제를 사용하지 않고, 작은 동물 하트 큰 촬상 깊이를 제공 할 수있다. 또한의 OCT 시스템 개발의 저비용 시험편 광학 이미징 기술이 대중화되었다. 간섭 단층 성공적 초파리의 길이 연구에 사용되었다. OCT를 심장 형태 학적 및 기능적 촬상 심장 구조를 연구하기 위해 수행 된 사용하여 FUNC적인 유전자의 역할 및 심장 개발하는 동안 돌연변이 모델에서 심장 혈관 결함의 메커니즘. 예를 들어, 연령에 따라 심장 기능의 감소는 OCT 27 초파리에서 다운 규제 안지오텐신 전환 효소 관련 (ACER) 유전자로 확인되었다. 유전자 관련 심근 병증의 표현형은 10월 28-33를 사용하여 초파리에서 입증되었다. 연구 사용 10월은 초파리 (34)의 중심에 인간의 SOX5 유전자의 기능적 역할을 한 것으로 보입니다. 간섭 단층 비해 OCM 더 가로 해상도를 제공하기 위해 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈를 사용한다. 과거에서, ortholog 인간 주기성 유전자 dCry / dClock 입을로 인한 심장 기능 장애는 비만 유도 인간 이해 맞춤 OCM 시스템 (15, 16),뿐만 아니라 초파리 심근증에 고 지방식이의 효과를 사용하여 연구되어왔다 심장 질환. (15) 여기에, 일전자 실험 프로토콜은 두 번째 령 (L2), 세 번째 령 (L3), 번데기 1 일 (PD1), 번데기 2 일 (PD2), 번데기 3 일에서 초파리의 심장 형태 학적 및 기능적 변화의 길이 방향 연구 (PD3)를 요약 , 번데기 4 일 인간과 관련된 선천성 심장 질환의 연구를 촉진하기 위해 OCM을 사용하여 (PD4), 번데기 5 일 (PD5), 성인 (그림 1). 이러한 HR 및 CAP 등 심장 기능 매개 변수를 정량적으로 심장 개발 기능을 나타 내기 위해 다른 발달 단계에서 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>Custom OCM imaging system</td><td>Developed in our lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>my Temp Mini Digital Incubator</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>AmScope</td><td>200PCS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>RITE AID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Drosophila Formula</td><td>CAROLINA</td><td>formula 4-24</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>ActiveDry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>SONY</td><td>WILD M420</td><td></td></tr><tr><td>Brush</td><td>Loew-Cornell</td><td>245B</td><td>being used to move specimens</td></tr><tr><td>Labview software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezer</td><td>Wiha</td><td>AA SA</td><td>to fix the fruit fly wings</td></tr><tr><td>FlyNap</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>4,224,898</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>MU18837</td><td></td></tr><tr><td>Organic Extra Coconut Oil</td><td>Spring Valley</td><td>13183</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>CapitolBrand</td><td>M3504-E</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Drosophila&lt;/i&gt; Vials</td><td>SEOH</td><td>8401SS</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>R2500</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (ocm)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

길이 심장 이미징 OCM 실온에서 24B-GAL4 / + 균주와 초파리를 사용하여 수행 하였다. 측정 L2, L3에서 수행하고, PD4에 PD1에서 8 시간 간격으로, 성인 1 일 (AD1)는 변형 과정 (표 1)를 추적 할 수 있었다. 유충, 번데기 초, 늦은 번데기 및 성인 파리는 그림 1A에서 볼 수 있듯이 유리 슬라이드에 장착했다. 애벌레와 성인 파리의 심장의 세그먼트 기능은 그림 1B의 개략적 ?...

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Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

drosophila-preparation-longitudinal-imaging-heart-function-vivo-using

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

10.8K 조회수.  Lehigh University. Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

연구

생체공학

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

신경과학

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

발생학

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

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The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

생물학

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

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We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Novel And Efficient Method for Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila hearts before imaging is a meticulous time-intensive process that requires advanced training and motor skills. To address these challenges, we present an innovative protocol that utilizes cryosectioning for the fluorescence imaging of Drosophila heart tissue. The protocol has been demonstrated in imaging the adult Drosophila heart but could be adapted for developmental stages. The method enhances both the efficiency and accessibility of fluorescence staining while preserving the integrity of the tissue. This protocol simplifies the process without compromising the quality of imaging, thereby reducing the dependency on technicians with highly developed training and motor skills. Specifically, we replace complex techniques, such as capillary vacuum suction, with more straightforward methods like tissue embedding. This approach allows for the visualization of cardiac structures with greater ease and reproducibility. We demonstrate the utility of this protocol by effectively detecting key cardiac markers and&#160;achieving high-resolution fluorescence and immunostaining imaging that unveils intricate details of heart morphology and cellular organization. This method provides a robust and accessible tool for researchers exploring Drosophila cardiac biology, facilitating detailed analyses of heart development, function, and disease models.

The Drosophila heart sectioning and fluorescence imaging protocol simplifies studying heart structure and pathologies. This approach involves straightforward sectioning, staining, and imaging, bypassing the technical expertise needed for traditional dissection. It enhances accessibility, making Drosophila a more widely usable model for cardiac-related research within the broader scientific community.

Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning을 위한 새롭고 효율적인 방법

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila ...

유전학

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular organization and genomic investigations to behavioral studies. Due to the accumulated scientific knowledge, in recent years, Drosophila was brought to the field of modeling human diseases, including heart disorders. The presented work describes the experimental system for monitoring and manipulating the heart function in the context of a whole live organism using red light (617 nm) and without invasive procedures. Control over the heart was achieved using optogenetic tools. Optogenetics combines the expression of light-sensitive transgenic opsins and their optical activation to regulate the biological tissue of interest. In this work, a custom integrated optical coherence tomography (OCT) imaging and optogenetic stimulation system was used to visualize and modulate the functioning D. melanogaster heart at the 3rd instar larval and early pupal developmental stages. The UAS/GAL4 dual genetic system was employed to express halorhodopsin (eNpHR2.0) and red-shifted channelrhodopsin (ReaChR), specifically in the fly heart. Details on preparing D. melanogaster for live OCT imaging and optogenetic pacing are provided. A lab-developed integration software processed the imaging data to create visual presentations and quantitative characteristics of Drosophila heart function. The results demonstrate the feasibility of initiating cardiac arrest and bradycardia caused by eNpHR2.0 activation and performing heart pacing upon ReaChR activation.

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

The present protocol describes the generation of Drosophila melanogaster expressing eNpHR2.0 or ReaChR opsins in the heart for OCT imaging and optogenetic heart pacing. Detailed instructions for Drosophila OCT imaging and heart beating modulation, including the simulation of restorable heart arrest, bradycardia, and tachycardia in live animals at different developmental stages, are reported.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

요약

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마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

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에 잔 심장을 떠올리 Drosophila

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심장 기능의 영상 및 광유전학적 제어를 위한 초파리 멜라노가스터 모델 개발

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