우리는이 프로토콜이 기초를 이루고있는 원 발행에 기여한 L. David Sibley와 Asis Khan에게 감사 드린다. 이 연구는 National Institutes of Health의 보조금 AI108721에 의해 지원되었습니다.

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜은 결합되었을 때 T. gondii 에서 약제 내성 유전자를 확인하는 몇 가지 방법을 제시합니다. 두 가지는 특히 프로젝트에 필수적이었고, 상대적으로 노련한 QTL 매핑 방법과 최근에 개발 된 CRISPR / Cas9 유전자 편집 방법이었다. Lander와 Botstein은 1989 년에 영향력있는 논문을 발간하여 유전형 유전자좌와 표현형을 연관시키는 QTL 매핑을 시연했다. 최근에 Dounda와 Charpentier는 Streptococcus pyogenes 22 의 CRISPR / Cas9 편집 시스템을 T. gondii 13 , 17을 비롯한 여러 모델에서 신속하게 유전 도구로 채택했다고 설명했습니다. 두 방법 모두 유용했는데 QTL 매핑은 WGS 기반 SNP 검출을 사용하여 궁극적으로 확인 된 약물 내성 변이를 포함하는 유전자좌를 정의하고 CRISPR / Cas9 편집은<html> SNR1 이 sinefungin 약물 내성 유전자임을 확인합니다. ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8 은 독성 표현형 19 을 조사하기 위해 원래 개발되었지만, 부모의 계통도 VAND 부모에서 sinefungin 내성 인 인과 관계 유전자가 알려지지 않은 부가적인 표현형의 차이를 가져왔다. 이것은 부모의 추가적인 표현형 차이가 관찰 될 때 재사용 될 수 있다는 점에서 십자가의 한 가지 이점을 강조합니다. 이것은 다른 Toxoplasma 십자가 유형 2 x 3 형의 경우였으며, 독성에 관여하는 여러 유전자가 여러 표현형 37 , 38 , 39 , 40 을 매핑하여 발견되었습니다. 지금까지 4 가지 T. gondii 십자가가 기술되어 표현형에 관여하는 유전자를지도 화했다ss = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 모두 유전 적 기초가 알려지지 않은 새로운 표현형을 매핑 할 재사용 가능성이있다. 이 줄을 따라 알려진 세계적인 유전 적 다양성을 나타내는 62 개의 T. gondii 균주에 대한 게놈이 서열화되었다. 흥미로운 표현형이 다른 균주를위한 새로운 풀을이 풀에서 만들 수 있습니다. QTL 매핑의 장점을 강조한 결과, 십자가를 생성하는 것이 사소한 일이 아니라고 말할 필요가 있습니다. 인과 관계 유전자를 확인하는 데 사용할 수있는 다른 방법이 있습니다. 하나의 강력한 기술은 화학적 돌연변이 유발을 사용하여 표현형을 선별 할 수있는 돌연변이를 만듭니다. 원인 유전자를 찾기 위해, 돌연변이 체는 cosmid 라이브러리 44 로 보완 될 수 있거나 유전체 resequencing 방법은 원인 돌연변이 45 를 찾는 데 사용될 수 있습니다. 미주리이것에 관해서는, Coleman et al. 및 Walwyn et al. 이러한 접근 방식의 개요 46 , 47 . 원인이되는 SNF 돌연변이 (Protocol 2와 3)의 확인을 유도하는 많은 단계는 학문적 목적으로 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어로 수행되는 계산 방법에 의존합니다. 각 단계에 대한 자세한 명령이 제공되며 적절한 파일과 함께 실행하면 사용자가 원인 SNF r SNP를 찾는 데 필요한 데이터 세트를 다시 만들 수 있습니다. 명령의 일부 구문은 사용자 기본 설정으로 수정할 수있는 파일 이름 또는 디렉토리 구조 ($ PATH)를 참조합니다. 여기에 제시된 명령이 QTL 분석 및 WGS 기반 SNP 식별을 통해 교차 분석을 할 수있는 방법을 확실히 피할 수는 없지만이 기사에서 설명한 실험을 반복 할 수있을만큼 포괄적이며 사용자가 m<html> 이러한 접근 방식이 단계적으로 활용되는 방식을 잘 알고 있습니다. QTL 매핑 및 WGS 서열 기반 SNP 검출이 후보 SNF r 유전자를 식별하기에 충분했지만, 약물 저항성에서 그 역할을 확인하기 위해서는 추가적인 실험이 필요하다. 이것은 CRISPR / Cas9 유전자 편집을 사용하여 달성 할 수있는 유전자 파괴 또는 녹아웃 기술을 통해 설득력있게 나타낼 수 있습니다. CRISPR / Cas9를 사용하여 indel 돌연변이를 생성하거나 T. gondii 의 표적 유전자에 형질 전환 작 제물을 삽입하는 상세한 방법이 제시되어있다. CRISPR / Cas9가 제공하는 표적 특이성은 전통적인 방법에 비해 유전자 편집의 효율성을 증가시킨다. 또한 이것은 효율적으로 증가하여 이전에 수정하기 어려운 유전 연구를 위해 비 실험실 변형 균주를 사용할 수있게되었습니다. 초기 단계에 있지만, CRISPR / Cas9는 이미 유전자 손상을 일으키는 데 사용되어왔다유용한 유전자가 될 것으로 기대되는 T. gondii의 유전자 녹아웃 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 를 만든다 . 미래의 많은 다른 연구들에 대해서. SNR1 불 활성화가 sinefungin 내성을 일으킨다는 발견은 SNR1 유전자좌가 유전자 도입 또는 유전 적 보완을위한 유망한 장소가되게한다. SNR1 유전자좌로 도입 유전자의 통합을 유도하기 위해 CRISPR / Cas9 매개 유전자 타겟팅을 사용하는 성공을 극대화하기 위해서는 다음 측면을 고려해야한다빨간색 실험 디자인 중. 첫째, 변형 마커의 효율을 높이기 위해 형질 전환 구조체에 선택 마커를 포함시키는 것이 좋습니다. 선별 마커가 포함되면 양성 및 음성 선발을 모두 사용할 수있어 이중 선별 된 기생충의 거의 100 %가 SNR1 유전자좌에 통합 된 GOI로 형질 전환됩니다. 대조적으로, 형질 전환 구조물이 추가적인 선택 가능한 형질을 포함하지 않고 SNR1 유전자좌에서 음성 선택에 의존하는 경우 성공적인 형질 전환의 효율은 크게 CRISPR 플라스미드 및 형질 전환 구조물의 동시 형질 전환 효율에 달려있다. 둘째, CRISPR / Cas9 매개 된 부위가 아닌 상 동성 DNA 단편의 특이 적 통합이 보체 및 형질 전환에 자주 사용 되더라도 삽입 방향은 양 방향이 가능할 경우 보장 할 수 없다는 점에 유의해야한다. 이것은 프로포즈를 일으킬 수있다.몇 가지 응용 프로그램에 ms. 예를 들어, 유전자 대립 유전자가 다른 돌연변이를 보완하기 위해서는 모든 대립 유전자가 같은 방향으로 삽입되도록하는 것이 어렵고, 방향의 불일치로 인해 표현의 차이가 생길 수 있습니다. 이러한 유형의 적용을 위해서는 SNR1 유전자좌와 상 동성이있는 서열을 가진 DNA 구조체가 권장되며 이는 적절한 통합 방향을 유도 할 것이다 ( 그림 6 ). 셋째, 형질 감염 중에 CRISPR 플라스미드와 형질 전환 DNA 분자 사이의 비율은 성공적 형질 전환 균주 건설에 중요합니다. 이 비율은 선택 전략에 따라 조정해야합니다. 다음 지침을 권장합니다 : 1) 유전자 변형 구조체에 약물 내성 마커가 포함되어 있고 해당 약물이 유전자 변형 기생충 생성에 사용 된 유일한 선택 인 경우, 즉 sinefungin을 사용하지 않는 경우, 유전자 변형 구조물과 CRISPR plasm 사이의 권장 몰비id는 1 : 5입니다. 이 경우 더 많은 CRISPR 플라스미드를 사용하면 트랜스 제닉 구조물을받는 기생충도 CRISPR 플라스미드를 받게 될 가능성이 높아 지므로 약물 내성 기생충은 CRISPR 표적화 사이트에 마커를 삽입 할 가능성이 더 높습니다. 그 비율이 역전된다면 형질 전환 체를받는 대부분의 기생충은 CRISPR 플라스미드를 얻지 못할 것이다. 결과적으로, 대다수의 약물 내성 기생충은 CRISPR / CAS9 매개 부위 - 특이 적 삽입과 관련이없는 무작위 적 통합을 통해 트랜스 제닉 구조물을 얻는다. 2) 유전자 변형 구조체가 약물 내성 마커를 포함하고 해당 약물이 유전자 변형 기생충을 선택하기 위해 sinefungin과 함께 사용되는 경우, 유전자 변형 구조체와 CRISPR 플라스미드 사이의 제안 된 몰비는 1 : 1이다. 이 전략은 형질 전환 균주 건설의 최고 효율을 제공합니다. 3) 형질 전환 체가 선택 가능한 생산자를 포함하지 않고, 음성 선택에 의지 할 경우트랜스 제닉 기생충을 얻기 위해 sinefungin 단독으로, 트랜스 제닉 구조물과 CRISPR 플라스미드 사이에 제안 된 몰비는 5 : 1이다. 이 디자인의 이론적 근거는 위의 첫 번째 지침과 동일합니다. Protocol 5에서 pyrimethamine과 sinefungin이 모두 선택 되었기 때문에 DHFR * mini 유전자와 CRISPR plasmid를 표적으로하는 SNR1 사이의 비율은 1 : 1로 설정되었습니다. 종합 해 보면, 여기에 설명 된 방법은 SNR1 2 를 식별 한 원래의 출판물에서 전달할 수 없었던 수준의 세부 사항을 가지고 있습니다. 이러한 프로토콜; 특히, 명령 줄 구문, 활용되는 프로그램의 순차적 레이아웃 및 CRISPR / Cas9의 사용은 표현형을 담당하는 새로운 유전자를 식별하기위한 미래의 노력을 지원해야합니다.

숙주 범위는 기생충의 유행 정도를 결정합니다. 일부 기생충은 발견 된 영역을 제한하는 매우 구체적인 호스트 요구 사항을 가지고 있으며 일부는 일반 주의자입니다. 그 중 한 명은 Toxoplasma gondii ( T. gondii) 입니다. 이 기생충은 모든 포유 동물과 많은 새들을 감염시킬 수 있기 때문에 전 세계적으로 발견됩니다. 인간도 감염되기 쉽고 전세계 인구의 약 1/3이 감염된 것으로 추정됩니다. 다행히 강력한 면역 반응은 일반적으로 기생충의 성장을 조절하지만 면역계가 손상된 상황에서 기생충은 확인되지 않고 성장하여 질병을 일으킬 수 있습니다 (종종 뇌염). 또한이 기생충은 이전에 감염되지 않은 여성이 면역 기억이 부족하여 기생충의 확산을 제한하기 때문에 임신 중에 감염된 경우 선천적 인 질병을 일으킬 수 있습니다. 또한 시력 손실을 초래할 수있는 안구 독소증의 부담이 있습니다 1 . 이 reaso 들어ns T. gondii 는 연구의 초점이되었고, Apicomplexan 기생충에 대한 모델로 연구를 위해 개발 된 많은 분자 방법으로 인해 연구 대상이되었습니다. 여기에 설명 할 두 가지 방법은 QTL (Quantitative Trait Locus) 매핑 및 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 유전자 편집입니다. QTL 매핑과 CRISPR / Cas9 편집은 이전 연구에서 T. gondii 병독성 유전자를 확인 및 / 또는 특성화하기 위해 사용 된 전진 및 역 유전 접근법입니다. 여기에서 이들 방법을 결합하여 sinefungin 내성 (SNF r ) 유전자, TgME49_290860 및 이의 ortholog ( SNR1로 표시 ) 2 의 기능을 확인하고 확인합니다. T. gondii 는 다양한 중간 숙주를 감염시킬 수 있지만, 생명주기를 완료하기 위해서는 felid의 장 상피 세포를 통과시켜 감염시켜야합니다. 고양이는 기생충의 결정적인 숙주입니다.exial stage가 생성되고 감수 분열을 통한 유전 재조합이 일어난다. QTL 연구를 수행하려면 유전 적 십자가를 만들어야하며, Toxoplasma 의 경우 이것은 표현형 형질이 다른 두 가지 기생충 균주, 즉 모계 얼룩을 고양이를 통해 재조합 자손 3 을 생산하는 것입니다. 고양이에게 먹이기 전에 부모의 계통은 별도의 약물에 내성을 갖게되어 자손 4 의 이중 약물 선택으로 재조합 체를보다 효율적으로 확인할 수 있습니다. 이 목적을 위해 T. gondii 에는 세 가지 약물이 사용되었습니다. 저항성 유전자 5 가 우라실 포스 포리보실 트랜스퍼 라제 ( FUR ), 저항성 유전자 6 이 아데노신 키나아제 ( AK ), 저항성 유전자가 알려지지 않은 시네 파인 신 (SNF)이 7 인 아데노신 아라 비노 시드 (ARA). 몇 가지 유전 적 십자가가T. gondii에 대해 생성되었지만 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)을 사용하여 ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross의 24 자손 만 genotyped 하였다. 이것은 VAND 부모가 약물에 민감한 VAND (VAND-SNF s ) 균주 의 화학적 돌연변이 유발에 저항하여 sinefungin 내성을 갖도록이 십자가를 사용하여 SNF 내성 유전자를 매핑하고 식별 할 수있는 가능성을 열었고, VAND 참조 게놈은 VAND- 따라서 SNF s 균주는 자손 Wine과 VAND-SNF 의 참조 게놈 사이의 모든 다형성을 식별 할 수있게 해줍니다. 그 유전 적 부모 VAND-SNF r 돌연변이는 자손의 sinefungin 내성을 일부 변이 시켰습니다. SNF r 자손에서 원인 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)을 확인하기 위해 여러 컴퓨터 기반 오픈 소스 리소스를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. ME49-부모와 자손의 WGS 정렬을 사용하여 유전자 크로스 오버의 게놈 위치를 정확하게 검출하는 REDHORSE 소프트웨어 세트 9 가 개발되었습니다. 이 맵핑 정보는 R 통계 프로그래밍 소프트웨어에서 &#39;qtl&#39;패키지 10 과 호환되는 데이터 세트를 포맷하기 위해 표현형 데이터 (자손의 SNF r) 와 결합 될 수있다. QTL 스캔은 QTL 스캔이 실행되어 표현형. QTL 유전자좌 내에 위치한 인과적인 SNP를 확인하기 위해 VarScan mpileup2snp 변형 호출 프로그램 12를 사용하여 SNP를 호출 할 수있는 Bowtie 2 정렬 프로그램 11 을 사용하여 자손의 WGS 읽기를 개별적으로 sinefungin에 민감한 VAND 게놈에 맞출 수 있습니다. 이러한 SNP를 사용하여, QTL 유전자좌는 SNF r에 존재하는 다형성을 검색 할 수 있지만SNF 의 자손에서 유전자의 코딩 영역에서 확인 된 인과적인 SNP로, 후보 SNF r 유전자의 유전 적 변형이 SNF s 변형에서 수행되어 약물 내성 기능을 검증 할 수있다. CRISPR / Cas9 게놈 편집 시스템은 최근 Toxoplasma 13 에 설립되었으며,이 기생충의 복잡한 생물학 탐구, 특히 비 실험실 변형 계통의 유전 연구에 중요한 도구가 추가되었습니다. WT Toxoplasma 세포에서 매우 활성 인 Non-Homologous End Joining (NHEJ) 활성으로 인해, 외인성으로 도입 된 DNA가 매우 높은 빈도로 게놈에 무작위로 통합되기 때문에 표적 게놈 변형을 달성하기가 어렵습니다. 궤적 특이 적 변형의 성공률을 증가시키기 위해, 상이한 접근법이 동종 재조합의 효율을 증가시키고 / 시키거나e NHEJ 활동 15 , 16 . 이러한 접근법 중 하나는 CRISPR / Cas9 시스템입니다. 다른 방법과 비교하여 CRISPR / Cas9 시스템은 사이트 별 수정 사항을 효율적으로 적용 할 수 있으며 13 , 17 , 18을 쉽게 디자인 할 수 있습니다. 또한 기생충 13 , 19 의 추가 변형없이 Toxoplasma 균주에서 사용할 수 있습니다. CRISPR / Cas9 시스템은 Streptococcus pyogenes 의 적응 면역 체계에서 유래되었으며,이를 파지 20 , 21 , 22 와 같은 이동 유전 요소의 침입을 방어하는 데 사용합니다. 이 시스템은 RNA 유도 DNA 엔도 뉴 클레아 제 효소 Cas9를 이용하여 이중 가닥 DNA 브레이크 (DSB)를 표적에 도입하고,짧은 indel 돌연변이를 통해 표적 유전자를 불 활성화시키는 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ에 의해, 또는 설계된대로 정확하게 표적 유전자를 변경시키기위한 상 동성 직접 재조합에 의해 야기된다. 표적 특이성은 표적 DNA와 100 % 상 동성을 갖는 개별적으로 설계된 20nt 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA (gRNA)라는 작은 RNA 분자에 의해 결정됩니다 22 . gRNA 분자는 또한 특정 Protospacer Adjacent Motif (PAM, 서열은 &#39;NGG&#39;)를 포함하는 표적 사이트로 핵산 분해를 유도하는 Cas9에 의해 인식 된 시그니처를 포함한다 25 , 26 . 따라서, gRNA 분자와 PAM 서열은 함께 작용하여 게놈에서 Cas9 절단 부위를 결정한다. 하나는 쉽게 절단을위한 다른 사이트를 대상으로 gRNA 시퀀스를 변경할 수 있습니다. CRISPR / Cas9 시스템이 Toxop에서 처음 개발되었을 때Lasas에서, Cas9 핵산 분해 효소를 발현하는 단일 플라스미드와 gRNA 분자를 사용하여 표적 부위 13 , 17에 DSB를 도입 하였다. CRISPR / Cas9 시스템은 동종 재조합에 의해서뿐만 아니라 외인성 DNA의 비 상동 적 통합을 통해서 현장 특이적인 게놈 변형의 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다. 그것은 NHEJ 활동을 포함하는 야생형 계통에서 이것을합니다. 따라서이 시스템은 효율적인 게놈 편집을 위해 본질적으로 모든 Toxoplasma 균주에서 사용할 수 있습니다. 전형적인 실험에서, 표적 특이 적 CRISPR 플라스미드 및 표적을 변형 시키는데 사용 된 DNA 단편은 기생충 내로 동시에 형질 감염된다. 표적을 변형시키는 데 사용 된 DNA 단편이 표적 궤적에 상 동성 서열을 포함하면 상 동성 재조합을 이용하여 CRISPR / Cas9에 의해 도입 된 DSB를 수복하여 표적을 정확하게 변형시킬 수있다. 다른 한편, int생성 된 DNA 단편은 상 동성 서열을 포함하지 않으며, 여전히 CRISPR / Cas9 표적화 사이트에 통합 될 수있다. 후자는 흔히 선별 마커를 삽입하거나 네거티브 선발을 허용하는 유전자좌를 보완하기 위해 유전자를 파괴하는 데 사용됩니다 13 . 여기 SNR1 유전자좌는 CRISPR / Cas9가 어떻게 유전자 파괴 및 형질 전환 기생충의 생성에 사용될 수 있는지를 보여주기위한 예입니다.

<table><tbody><tr><td>T25 flasks</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt; ME49 strain</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt;VAND strain</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (No Sodium Bicarbonate)</td><td>Life Sciences</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) Premium Grade</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper for Flasks</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Blunt needles 22 G x 1&quot;</td><td>BRICO Products</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore Filter 3.0 &amp;micro;m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Filter Holder 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&amp;nbsp;</td><td>The R Foundation</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr><tr><td>J/qtl</td><td>The Churchill Group</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>John Hopkins University</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr><tr><td>VarScan</td><td>Washington University, St Louis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>MUMmer</td><td>JCVI &amp;amp; Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt; CRISPR plasmid to cut the UPRT gene</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>&lt;em&gt;T. gondii&lt;/em&gt; CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene</td></tr><tr><td>pUPRT::DHFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>Template for &lt;em&gt;DHFR*&lt;/em&gt; mini gene</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triposhpate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathione (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvette&amp;nbsp; 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>6-well TC plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC plate</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 12 mm round</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>96-well TC plate</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrimethamine</td><td>TCI AMERICA</td><td>P2037-1G</td><td>Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol</td></tr></tbody></table>

qtl mapping and crispr/cas9 editing to identify a drug resistance gene in toxoplasma gondii

과학적 지식은 본질적으로 사용 가능한 기술과 방법에 연결됩니다. 이 기사에서는 Apicomplexan 기생충 Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하고 검증 할 수있는 두 가지 방법, 즉 Whole Genome Sequence (WGS) 기반 유전지도를 사용한 Quantitative Trace Locus (QTL) 매핑 방법과 그 방법 (CRISPR) / Cas9 기반 유전자 편집. QTL 매핑의 접근법은 게놈 영역 (들)과 표현형 사이에 상관 관계가 있는지를 테스트 할 수있게합니다. 재조합 십자가의 자손을 기반으로 한 유전지도 인 QTL 스캔을 수행하기 위해서는 두 가지 데이터 세트가 필요하며 그 십자가의 자손 각각에서 평가 가능한 정량화 가능한 표현형이 필요합니다. 이러한 데이터 세트는 표현형과 관련된 중요한 유전자좌를 확인하기 위해 QTL 스캔을 생성하는 R / qtl 소프트웨어와 호환되도록 포맷됩니다. 검색을 크게 줄일 수 있지만가능성있는 후보자의 후보자 인 QTL은 인과 관계 유전자를 식별 할 필요가있는 다수의 유전자를 포함하는 영역에 걸쳐있다. 자손의 WGS를 갖는 것은 유전자 수준에서 원인 약 저항성 돌연변이를 확인하는 데 중요했습니다. 일단 확인되면, 후보 돌연변이는 약물에 민감한 기생충의 유전자 조작에 의해 확인 될 수 있습니다. T. gondii 를 유 전적으로 수정하는 가장 쉽고 효율적인 방법은 CRISPR / Cas9 시스템입니다. 이 시스템은 단일 플라스미드로 암호화 된 단지 2 가지 구성 요소, 게놈 타겟에 상보적인 20bp 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA (gRNA) 및 표적에서 이중 가닥 DNA 브레이크 (DSB)를 생성하는 Cas9 엔도 뉴 클레아 제로 구성되며, 수리는 브레이크 사이트 주변의 서열의 삽입 또는 결실을 허용한다. 이 기사는 sinefungin 저항성을 담당하는 유전자를 확인하고 형질 전환 기생충을 구축하기 위해 CRISPR / Cas9 기반 게놈 편집 도구를 사용하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

이 기사에서는 약물 내성을 일으키는 유전자를 확인하기 위해 연속적으로 사용할 수있는 몇 가지 방법에 대해 자세히 설명합니다 ( 그림 1 ). ME49-FUDR r X VAND-SNF r 십자가의 24 자손은 의정서 1에 기술 된대로 sinefungin에 대한 저항성에 대한 평가를 받았다. 유전지도와 자손의 SNF r 표현형을 이용하여 QTL 스캔을 R / qtl - 프로토콜 2 ( 그림 2 ). 이것은 대략 1 Mbp에 걸친 염색체 IX에 하나의 중요한 피크를 초래했습니다. 인과 돌연변이가있는 것은이 지역에있다. 원인 돌연변이를 확인하기 위해 Bowtie2 - Protocol 3.1을 사용하여 자손에서 WGS 읽기를 VAND-SNF 의 참조 게놈에 정렬하고, VarScan mpileup2snp - Protocol 3.2를 사용하여 SNP를 호출했으며 VAND 게놈의 QTL 위치를 MUMmer- Protoc3.3. QTL 유전자좌 내의 자손 SNP를 추출하여 SNF r 자손이 SNP를 가지고 SNF가없는 패턴을 찾았는데, 이것은 자손 SNP가 VAND-SNF 레퍼런스 게놈과 비교하여 얻어 졌기 때문에 가능하다 ( 그림 3 ) . 하나의 SNP만이 SNR1 이라는 추정 아미노산 수송 체 유전자에서 조기 종료 코돈을 초래하는이 패턴과 일치했다. SNR1 이 SNF r 내성 유전자임을 확인하는 것은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 수행 하였다. T. gondii 유전자 편집을 위해 조작 된 새로운 CRISPR / Cas9 플라스미드는 프로토콜 4 ( 그림 4A )에서 확인 된 SNF r 돌연변이 근처의 SNR1 유전자를 표적으로하는 gRNA를 포함하도록 만들어졌다. SNR1 표적화 CRISPR / Cas9 플라스미드를 SNFs WT 기생충 균주 내로 전기 천공시키고, 저항성 돌연변이 체를 컬트0.3 μM sinefungin에서 측정 하였다. CRISPR / Cas9 플라스미드를 표적으로하는 UPRT로 전기 천공 시켰을 때 어떠한 SNF r 기생충도 수득되지 않았다. 몇몇 SNF r CRISPR 돌연변이 체를 클로닝하고 SNR 1 gRNA 표적 주위의 영역을 서열 분석 하였다. 각각의 돌연변이는 SNR1 유전자의 암호화 서열을 파괴하는 indel을 가지고있다 ( 그림 4B ). 이 방법은 NHEJ ( 그림 5) 또는 HR ( 그림 6 ) - 보충 파일 2 를 통해 SNR1 유전자좌에 표적 생성물 을 삽입하는 데에도 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> 그림 1 : 프로토콜에 설명 된 실험을위한 도식 워크 플로. ME49-FUDR r X VAND-SNF r 십자 표시를 사용하여 SNF r 유전자를 확인하고 확인하는 주요 단계는 t에 요약 된 적절한 프로토콜그의 기사. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> 그림 2 : SN / R 표현형에서 QTL 스캔을 실행하기위한 R / qtl 명령. 프로토콜 2에서 설명 된 명령은 qtl 패키지를 사용하여 R로 실행됩니다. 대표적인 명령과 플롯이 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> 그림 3 : 인과 SNP의 위치. 자손 WGS 읽기는 Bowtie 2를 사용하여 VAND-SNF 의 참조 게놈에 맞추어졌고, VarScan과 함께 SNP가 호출되었으며,<html> MUMmer로 식별되는 VAND QTL 유전자좌. QTL 유전자좌 내에 위치한 SNP를 스프레드 시트로 가져와 인과 관계의 SNP를 확인했다. SNF r 자손 (황색), SNF s 자손 (녹색), SNF r SNP (적색) ( 데이터 파일 3 참조). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> 그림 4 : SNR1 을 SNF r 유전자로 확인 CRISPR / Cas9를 사용. ( A ) CRISPR / Cas9는 SNR1 유전자좌에서 indel 돌연변이 (녹색)를 유도했다. ( B ) 두 개의 다른 SNR1 특이 CRISPR 플라스미드 (각각 C5 및 C6)에 의해 야기 된 SNR1의 대표 돌연변이. RH는 WT strain이고 C5와 C6은 SNF r 돌연변이이다. (B는 참고 문헌s = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> 그림 5. CRISPR / Cas9를 이용한 삽입 돌연변이 유발. ( A ) CRISPR / Cas9 매개 사이트 - 특정 통합에 의해 SNR1 유전자좌에 보완 또는 형질 전환 유전자 삽입. 삽입 된 DHFR * 미니 유전자의 2 가지 가능한 배향 및 동정을 위해 사용 된 프라이머, F1 / 2 및 R1 / 2는 진단용 PCR에서 사용되는 올리고의 프라이밍 위치를 나타낸다. ( B ) 한 snr1 :: DHFR * 클론, RH의 진단 PCR은 WT 컨트롤로 사용됩니다. GRA1p의 PCR은 게놈 DNA의 품질을 주형으로하는 대조군으로 포함됩니다. 별표는 비특이적 인 띠가있는 레인을 나타낸다 (그림 5B는 참조 번호ce 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="도 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> 도표 6 : CRISPR / Cas9를 사용하여 유전자 녹아웃. T. gondii의 CRISPR / Cas9 매개 동종 유전자 대체를위한 고전적인 디자인. 삽입 된 도입 유전자의 방향은이 경우 고정됩니다. F1 / R1, F2 / R2 및 F3 / R3은 진단용 PCR에 사용되는 올리고의 프라이밍 부위를 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 데이터 파일 1 : ME49-FUDR r X VAND-SNF r 크로스 파일 f또는 R / qtl, &quot;csv&quot;형식으로 사용하십시오. format = &quot;csv&quot;옵션으로 R / qtl에로드 할 수있는 하나의 .csv 파일. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 데이터 파일 2 : (chrid txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt 및 phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r R / qtl에서 사용하기위한 크로스 파일, &quot;gary&quot;형식. 6 개의 .txt 파일은 R / qtl에서 &quot;gary&quot;형식으로로드 할 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 데이터 파일 3. SNF 전체에 Progeny SNP가있는 스프레드 시트 <strong&gt; QTL 로커스. 자손 SNP가있는 워크 시트 1 개와 부모의 표현형 데이터와 십자가의 자손이있는 두 번째 워크 시트가 들어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 1 : 추가 프로토콜 세부 사항. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 2 : 프로토콜 5 - 유전 적 보완 또는 형질 전환 균주 건설을위한 SNR1 유전자 좌 에서 음성 선택의 이용 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a></a>

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QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하는 데 유전지도를 기반으로하는 QTL 매핑을 사용하는 방법과 게놈 타겟을 효율적으로 편집하는 CRISPR / Cas9 시스템으로 어떻게 검증 할 수 있는지에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 약물 내성 유전자.

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

16.2K 조회수.  Huazhong Agricultural University.  Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하는 데 유전지도를 기반으로하는 QTL 매핑을 사용하는 방법과 게놈 타겟을 효율적으로 편집하는 CRISPR / Cas9 시스템으로 어떻게 검증 할 수 있는지에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 약물 내성 유전자. 

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Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

연구

유전학

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

면역학 및 감염병학

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

<meta charset="utf8"></head><body>말라리아 기생충에서 키나아제 재배선 식별: 화학 유전학 접근법

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more pronounced for target genes belonging to the multigene family. Plasmodium falciparum protein kinases belonging to the CDPK family are essential for blood stage development. As such, CDPKs are considered good targets for the development of anti-malarial compounds. The chemical genetics approach has been historically used to elucidate the function of protein kinases in higher eukaryotes. It requires the substitution of gatekeeper residue for another amino acid with a different side chain through genetic manipulation. Amino acid substitution at the gatekeeper position modulates the activity of a protein kinase and changes its susceptibility to a specific class of compounds known as bumped kinase inhibitors (BKIs) that help in the functional identification of the target gene. Here, we have exploited the chemical genetics approach to understand compensatory mechanisms evolved by a mutant parasite harboring a hypomorphic allele of cdpk1. Overall, our approach helps in identifying compensatory pathways that may be simultaneously targeted to prevent the development of drug resistance against individual kinases.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Identifying comcomcomatory pathways in Malaria Parasites Containing Hypomorphic Allele of Essential Protein Kinases

Chemical genetics involves the substitution of a gatekeeper residue with an amino acid containing a different side chain at the target locus. Here, we have generated a mutant parasite containing a hypomorphic allele of cdpk1 and identified compensatory pathways adopted by the parasite in the mutant background.

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