이 작품은 미국 심장 협회 과학자 발달 그랜트 0635480N 및 건강 연구 보조금 AI081220 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다. BIC은 성당 기사단이 눈 재단 연구 기금에 의해 지원됩니다.

개요 프로토콜이 먼저 기생충의 70 %의 살인 (프로토콜 1)로 이어지는 mutagen의 복용량을 정의하기 위해 제공됩니다. 다음 절차는 mutagenized 기생충 수영장 (프로토콜 2, 그림 2)에서 유도 탈출구의 돌연변을 풍부하게하기 위해 제공됩니다. 이것은 농축 수영장에 탈출구 돌연변이의 발생률을 테스트하기 위해, 또는 개별 돌연변이의 출현 표현형 (프로토콜 3) 검증 프로토콜 뒤에있다. 마지막으로, 프로토콜은 희석 (프로토콜 4) 제한하여 풍부한 인구에서 하나의 기생충의 클론을 생성하기 위해 제공됩니다. 1. mutagen의 적정 높은 mutagenic 화합물과 액체와 함께 작업할 때 이러한 이중 장갑과 같은 특별한주의, 사용하십시오. 적절한 처리를 위해 별도로 액체 폐기물을 수집합니다. <ol><li> 갓 lysed tachyzoites 1 ML과 인간 포피의 fibroblast (HFF) 세포와 합류 T25 조직 문화 flasks의 예방 37에 18-25 시간을 재배 °; C % 5 이하 Ed1 매체 (D-MEM 1퍼센트 열 inactivated 태아 소 혈청 0.2 밀리미터 L-글루타민, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신 및 0.25 μg / ML Amphotericin B와 보완의 CO 2 ). 로스 외를 참조하십시오. HFF 세포 및 기생충 21의 일반적인 성장과 미디어. </li><li> 10 분 10 ML 0.1 % 태아 소 혈청 배지 (D-MEM에서 물로 ​​씻어낸 Ed1 1시 10분) 및 (여기에서 &quot;37 ° C 배양기 &#39;라고도 함)에 5 % CO 2 하에서 humidified 37 ° C 배양기에서 떠나지으로 중간 교체 . </li><li> (mutagen 작업 dilutions는 5 2.5 1.25이되고, 각각 10 밀리미터,됩니다) 플라스크에 따라 0, 12.5, 25, 50, 또는 100 μl ENU (DMSO 1 M 주식) 또는 EMS를 (DMSO 1 M 주식) 추가합니다. 각 플라스크 100 μl에 DMSO를 추가합니다. 37 ° C 배양기 4 시간 동안 알을 품다. </li><li> 10 ML 차가운 PBS (4 ° C에서 미리 냉각)로 단일층를 rinsing하여 실온에서 10 초 동안 세 번 씻는다. </li><li> 5 ML PBS를 추가, 고무 경찰관 (세포 SCR을 느슨하게 단일층을 다쳤어요aper), 물리적으로 섬유아 세포 (바늘을 노출하지 않도록 무거운 의무 가위와 바늘이 외부 샤프트를 고정)에서 기생충을 제거 26.5 G 바늘로 긁어 세포를 통과하고, 필터 3.0 μm의 폴리 카보 네이트 필터. 여러 개의 바늘 구절은 숙주 세포에서 기생충을 발표의 효율성을 높일 것입니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 기생충 농도를 세어보세요. 기생충이 계산되기 전에 hemocytomer에서 5 분 동안 기다려야 해. </li><li> Ed1 3 ML 10,000 기생충 (10 ML 33,333 기생충이 필요한 경우) 기생충을 희석. </li><li> 희석 기생충 (10,000 기생충을 포함) 3 ML과 6 잘 접시에 잘 하나를 예방. 순차적으로 잘 첫번째 300 μl를 전송하여 2.7 ML Ed1을 포함 HFF 세포와 6 잘 플레이트 합류 3 우물 이상 10 배 기생충을 희석. 7 일간 37 ° C 배양기에서 그대로 접시를 남겨주세요. </li><li> 미디어를 대기음, 얼룩, 15 3 ML있는 분 / 잘 100 % 에탄올을 수정3 ML로 / 잘 크리스탈 바이올렛 솔루션 (500 ML 1 % 암모늄 oxalate에 반죽한 125 ML 에탄올의 12.5 g 크리스탈 바이올렛) 15 분, 3 ML과 헹굼 / 잘 PBS (1 분)과 공기 건조. 상온에서 모든. </li><li> plaques 백작과 mutagen의 농도가 노출된 기생충 (70 %는 복용량을 죽이는 : 그림 1 참조)의 30 %의 생존을 달성하는 데 필요한 선택합니다. 70 %의 살인의 복용량은 역사적으로 14를 사용하고 게놈 당 미만 100 점 돌연변이 (파렐, Marth, Gubbels 외., 원고 제출) 유도된되었습니다. </li></ol> 2. 탈출구의 돌연변이 농축 (그림 2) <ol><li> 70 %의 살인을 유도 mutagen 투약을 사용하여 위에서 설명한대로 돌연변이 유발을 수행합니다. 호스트 세포의 새로운 플라스크에서 한 구절을위한 mutagenized 인구 철. </li><li> 10 ML Ed1의 mutagenized 인구에서 120,000 갓 lysed 기생충과 T25, HFF 합류 조직 배양 플라스크를 감염. 5 % CO 아래 35 ° C 배양기에서 12 시간 동안 품어2 humidified ( &quot;35 ° C 배양기&quot;라고 hereon에서). </li><li> 미디어를 대기음 25 밀리그램 / ML dextran 황산 (DS) 13과 보충 10 ML Ed1 매체를 추가 후 10 ML 차가운 PBS로 10 초 린스합니다. 5% CO 2와 humidified ( &quot;40 ° C 배양기&quot;라고 hereon에서)에서 40 ° C 배양기에서 26 시간 알을 품다. </li><li> 탈출구 강화의 작업 솔루션을 준비합니다. 25 MG / ML DS로 보충 10 ML HBSSc을 포함한 15 ML 팔콘 튜브의 작동 농도에서 선택의 탈출구 유도를 희석. 37 ° C waterbath 30 분 사전 따뜻한 dilutions. 근무 농도에 대한 표 1을 참조하십시오. </li><li> 기생충에 감염된 flasks에서 매체를 대기음 미리 예열 탈출구의 유도 솔루션을 추가합니다. 표 1에 표시된 시간 동안 37 ° C 배양기에서 품어. </li><li> 미디어를 대기음 10 ML 차가운 PBS로 10 초 린스 후 (PDTC 25 밀리그램 / ML DS와 50 μm의 pyrrolidine dithiocarbamate과 보완 10 ML Ed1을 추가 광고PBS 100 MM PDTC 주식의 D 5 μl) 13. 35 ° C 배양기에서 5 시간 알을 품다. </li><li> 미디어를 대기음 10 ML PBS (실온)에 한 번 10 초 씻어 다음 10 ML Ed1 매체를 추가하십시오. 매일 흔들 flasks : 기생충은 단일층를 파괴 때까지 35 ° C 배양기로 다시 flasks 놔. 이것은 복구 7 일 주위 소요됩니다. </li></ol> 3. 탈출구를 assays에 의한 돌연변이 phenotypes의 유효성 검사 농축 화면을 수행하고 HFF 세포에서 한 구절에 대한 풍부한 인구를 성장 후 phenotypes는 탈출구 분석 11,13에 의해 확정해야합니다. 이 분석은 또한 규정 4 이후 단일 클론의 유효성을 검사하는 데 사용해야합니다. <ol><li> coverslips (물론 당 1 ML Ed1 중간)에 성장 합류 HFF 세포를 포함하는 24 잘 플레이트로 잘 인당 20,000 기생충의 예방. 24 시간 동안 40 ° C 배양기로 전송 후 35 ° C 배양기에서 8 시간을 품어. </li><li> 한 ML / 잘 PBS (1 씻으상온, 0 초). 한 ML의 탈출구를 inducers (단지 부정적인 제어 DMSO를 포함), 사전 예열 및 HBSSc에 희석하고 표 1에 설명되어있는 시간에 대한 부화를 추가합니다. </li><li> 미디어를 대기음 1 ML / 상온에서 15 분뿐만 100 % 메탄올로 고정시킨다. </li><li> autofluorescent 단백질을 표현하는 부모 기생충이 돌연변이 유발에 사용한다면, # 3.5 13 단계로 진행합니다. 비 형광 단백질을 표현하는 기생충은 상위 라인으로 사용된다면, 비교 - 빠른 상온 11시 1 분 동안 얼룩과 고정 coverslips을 얼룩. </li><li> 상온에서 24 잘 판에 1 ML / 잘 PBS로 5 분 씻으십시오. </li><li> 형광 단백질을 표현하는 기생충의 경우 : 신속 ddH 2 O (수영)에서 coverslip을 씻어 형광 신호를 보호하기 위해 gelmount 밑에 슬라이드에 탑재합니다. 비교 - 빠른 묻은 기생충의 경우, 100 % 에탄올에 10 초 씻어 및 슬라이드에 장착하기 전에 공기가 건조 해. </li><li> 으로 (형광) 현미경 사용40-60x 목적은 vacuoles의 비율 (그림 4 참조) 세포내 체재 vacuoles 적어 넣은 egressed 계산됩니다. </li></ol> 4. 희석을 제한함으로써 탈출구의 돌연변이 복제 프로토콜 3을 사용 농축 탈출구 돌연변이 인구의 표현형 검증 후, polyclonal 인구가 하나의 기생충의 클론을 얻기 위해 복제해야합니다. <ol><li> hemocytometer에서 기생충 인구 백작과 Ed1 매체 ML 당 500 기생충의 농도로 희석. </li><li> HFF 세포의 합류 단일층를 포함 384 자 판에서는 멀티 채널 pipet을 사용하여 40 μl / 잘 Ed1의 매체와 매체를 교체하십시오. 다른 이름으로 그림 5와 같이, 네 polyclonal 인구는 다음과 같이 접시 당 복제하실 수 있습니다 pipet 40 μl / 잘 우물 C3-C12, 우물에 돌연변이 C13-C22, 우물 H3-H12에 돌연변이 3, 돌연변이로 희석 돌연변 1 우물 H13-H22로 4 (우물의 최종 부피는 이제 80 μl입니다.) 코는 멀티 채널 pipet, pipet을 사용하여ution 위아래로 5 번 다음, 시작 행의 아래에 행 (행 C에서 D 또는 행 높이까지 전까지) 40 μl를 전송합니다. 행 G (뮤턴트 1, 2) 또는 행 N (돌연변이 3과 4)를 통해이 두 배 시리얼 dilutions을 계속합니다. 마지막 행에서 추가로 40 μl를 폐기하십시오. 번호판을 방해하지 않고 7-10일 동안 35 ° C 배양기에서 품어. </li><li> 단일층에 &#39;구멍&#39;으로 보이는 한 plaques의 존재를위한 10-20x 목표로 거꾸로 현미경에 우물을 확인합니다. </li><li> 하나의 상패와 돌연변이 최대 4 개의 우물을 선택하고 HFF 세포와 조직 배양 플라스크의 합류로 기생충을 전송하고 Ed1 매체로 가득. 35 ° C 배양기에서 기생충 철, 세포외 기생충을 분산하기 위해서 매일 flasks를 흔들. 이것은 일반적으로 칠일 소요됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 오랜 기간 동안 저장할 때 mutagens ENU와 EMS는 안정되지 않습니다. 따라서,의 mutagenic 능력을 테스트주식 재현성 결과를 얻기위한 필수적인 조건입니다. 일반적인 적정 결과 및 ENU 및 EMS 모두 곡선을 죽이고는 그림 1에 표시됩니다. 그러나, 그것은 적절한 복용량이 사용되었음을 확인할 수있는 모든 돌연변이 유발 실험을위한 플라크의 assays를 수행하는 것이 좋습니다. mutagenized 기생충 인구의 다양성을 유지하기 위해서는 가능한 빨리 탈출구 돌연변이 화면을 진행하는 것이 중요합니다. 일반적으로 새로운 플라스크에 기생충 중 하나 통로가 살아남은 기생충은 화면과 함께 진행하기 전에 복구할 수 있도록 수행됩니다. 그것은 이렇게하면 돌연변이 분열을 초래할 것을 염두에 보관해야합니다. 따라서 그것은 모든 절차를 완료한 후 격리 여러 clonal 뮤턴트 정확히 같은 유전자형을 포함하는 제외 수 없습니다. 그들의 phenotypes (예 차동 탈출구의 유도 인자의 민감한 부분)가 아니라면, 그것은 돌연변이 유발마다 하나의 탈출구의 돌연변를 분리하는 것이 좋습니다 동일한 돌연변이 여러 번 분리 방지하려면서로 매우 다른. 반면에, 원하는 표현형와 돌연변이 격리되지 않은 모든 화면에서 결과를 표시합니다. 특히 칼슘 2 +-ionophore A23187 내성 표현형는 희귀하고 하나의 탈출구를 돌연변이 격리를 위해 여러 돌연변이 유발 실험과 스크린을 필요로합니다. 따라서 그것은 병렬로 5-10 돌연변이 유발 및 스크린 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 화면의 농축 능력이 다른 비율의 야생 타입의 기생충으로 알려진 탈출구의 돌연변를 혼합하여 테스트되었다. 이러한 믹스는 화면으로 받게되었으며 농축 인구의 돌연변이 표현형의 발병률이 평가되었다. 세포질 YFP을 표현 야생 형 세포질 RFP을 표현 기생충과 돌연변이 라인을 사용하면 그런 일이 빠르게 13 유동세포계측법 (그림 3)에서 작성할 수 있습니다. 결과는 돌연변이 phenotypes가 일상적 10,000 야생 - 타입 P 당 1 탈출구 돌연변이 기생충으로 시작하여 80 % 순도로 풍부 수있다는 것을 보여줄arasites 13. 그러나, 언제 탈출구 돌연변 : 야생 형 기생충 시작 비율이 1:100,000 기생충이며, 고립된 인구 (1:100) 탈출구의 돌연변이에만 1~2%입니다. 따라서 화면의 농축 능력은 1000 배입니다. 화면은 일반적으로 70 %가 가능한되어있는 120,000 기생충의 접종으로 시작하기 때문에, 우리는 일반적으로 농축의 두 라운드를 수행합니다. 격리된 기생충은 농축 라운드 사이에 성장하고 있습니다. 야생 형 기생충 : 1:1,000,000 탈출구 돌연변이로 시작하는 경우에도이 절차는 100 % 돌연변 인구로 안내합니다. phenotypes를 확인하고 특성화하기위한 탈출구 분석은 개별 vacuoles의 차별을 허용 숙주 세포 감염의 다수가 필요합니다. 개별 기생충이 주변에 흩어져으로 탈출구의 높은 비율과 조건을 분석하는 경우에 특히 중요합니다. 그림 4에 나타난 바와 같이 egressed 집단이 잘 분리되지 않은 경우,이 비율을 과소 평가하기 쉽다한 공포 두명 egressed vacuoles를 세어 탈출구니다. 탈출구 및 침입 관련 프로세스이며, 어떤 온도에 민감한 phenotypes는 낮은 온도에서 가벼운 표현형를 표시하기 때문에, 모든 뮤턴트 비슷한 침략의 효율성을해야합니다. 이러한 돌연변 따라서 그들의 탈출구의 표현형의 정확한 평가를 위해 충분히 높지 공포 밀도를 얻기 위해 몇 배 높은 복용량에 주사해야합니다. 또한, 일부 탈출구를 inducers 효율적으로 네 기생충 이하를 포함하는 vacuoles의 탈출구를 자극하지 않습니다. 따라서 그것은 탈출구 분석을 시작할 때 vacuoles 여덟 기생충 이상을 포함하는 것이 중요합니다. 저희 연구실에서는 화면 뮤턴트 다른 탈출구 강화에 대해 특정 탈출구 확장기와 격리. 그들의 교차 반응을 프로 파일링하여 돌연변이 다른 클래스로 그룹화 할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 탈출구의 돌연변이 온도에 민감한 될 것입니다. 탈출구를 inducers가 intracellula의 출시 이전 단계를 실행과 고립 특정 돌연변이에R 칼슘 2 + 이외의 온도에 민감한 phenotypes하는 경향이 있습니다. 이것은 신호가 세포내 칼슘 2 +의 출시에 converges 전에 빠져나갈을 일으킬 수 병렬 경로 때문입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> 1 그림. 화학 mutagen 투약 적정. A. 플라크의 assays 다양한 EMS의 농도와 더불어 지적 당 기생충의 다양한 숫자를 사용하여 6 판에서 잘 수행했습니다. 하얀 반점은 HFF의 단일층에 형성된 기생 plaques입니다. B, EMS (B)와 ENU (C)의 다양한 복용량에 노출시 기생충 C.의 생존 곡선. 서바이벌은 플라크의 assays에 의해 평가되었다. 70 %의 살인을 유도 복용량은 돌연변이 유발 실험을 위해 선택됩니다. 세 독립적인 실험의 평균은 + / - 표준 편차가 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <stroNG&gt; 그림 2. 시간 진행은 X 축으로 표시됩니다 반면, 탈출구 돌연변이 농축 화면의 도식 표현. 온도는 y 축은에 표시됩니다. 그린 기생충 빨간색 기생충이 야생 형 기생충을 반영 탈출구 돌연변이 기생충을 반영합니다. 탈출구의 유도에 의한 조건 및 자극의 변화의시기는 상단에 표시되며 온도 프로파일을 반영 파란색 라인에 화살표로 표시됩니다. Eidell 외에서 채택했다. 13. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> 그림 3. 탈출구 돌연변 phenotypes의 전형적인 농축. 다양한 비율 (X 축)에 야생 형 기생충에 혼합 탈출구의 돌연변이의 농축 결과. 화면 후 어른이 인구의 탈출구 돌연변 phenotypes의 비율은 y 축은에 꾸몄다되고 유동세포계측법 (탈출구 돌연변이 기생충은 세포질 YFP을 표명하여 평가되었다 야생 형 기생충은 싸이를 표현) RFP toplasmic. 세 독립적인 실험 결과는 빨강, 파랑, 녹색의 데이터 요소로 표시됩니다. Eidell 외에서 채택했다. 13. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> 4 그림. 탈출구 분석의 일반적인 결과입니다. . 화살표 4-8 기생충을 포함하는 네 가지 그대로 vacuoles을 표시합니다. B는. 화살표 네 개의 독립적인 egressed vacuoles을 반영 흩어진 기생충 네 가지 그룹을 표시합니다. 탈출구는 부정적인 컨트롤 ()로 A23187 (B) 또는 DMSO에 의해 유도되었다. 기생충은 세포질 YFP 22 표현. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> 그림 5. clonal 기생충 라인. 포 polyclonal 인구 (빨강, 파랑, 노랑, 녹색)을위한 시리얼 희석은 순차적으로 HFF 세포와 단일 384 잘 플레이트 합류로 희석한다. 행 C와 나는 당 잘 열 기생충을 받고가 각각 행 H와 N,까지 (40 μl + 40 μl) 희석 2 배. 회색의 그늘 잘마다 기생충의 감소 수를 나타냅니다. 일반적으로 단일 클론은 행 DF와 JL에서 발견된다. <table border="1"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 재고 </td><td> 근무 농도 </td><td> T25 (10 ml) 쇼핑에 필요한 μl </td><td> 배양 시간 (분) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> DMSO의 1 M </td><td> 5 MM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 190 입증 </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> DMSO 2 MM </td><td> 1 μm의 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin에 * </td><td> DMSO 2 MM </td><td> 10 μm의 </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * nigericin가 풍부하게 사용하실 수 없습니다기생충 같은, 표준 화면 nigericin의 자극을 생존하지 않는다만이 탈출구 뮤턴트의 검증에 nigericin을 사용합니다. 절차에서 사용되는 표 1. 탈출구를 inducers. 10 ML HBBSc 25 밀리그램 / ML 화면 DS, 또는 돌연변이 유효성 검사 (탈출구 분석)에 대한 노 DS를 포함하는으로 희석. 시그마 - 올드 리치의 모든 화합물.

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship.">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li><li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites.">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li><li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant.">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li><li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii.">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li><li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment.">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li><li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

<html> 설명한 프로토콜은 탈출구 결함으로 Toxoplasma 돌연변이를 분리하는 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 성공적으로 이중 침략의 표현형 13 일부 중 탈출구 경로의 여러 단계에 따라 돌연변이를 분리했습니다. 침략에 대한 잠재적인 효과는 차동 항체 염색법 23,24으로 비 침략 기생충으로부터 침공 차별화 소위 빨강 녹색 검정을 사용하여 결정하실 수 있습니다. 침략과 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> ENU </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> N3385 </td><td> -20 ° C에서 DMSO, 가게에서 1 M 주식 </td></tr><tr><td> EMS </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M0880 </td><td> -20 ° C에서 DMSO, 가게에서 1 M 주식 </td></tr><tr><td> Dextran 황산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P8765 </td><td> PBS 100 밀리미터 증권 </td></tr><tr><td> 비교 빠른 </td><td> EMD 화학 </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 홀더 </td><td> 콜 - Parmer </td><td> 540,100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 μm의 폴리 카보 네이트 필터 </td><td> 워트 먼지Schleicher &amp; Schuell </td><td> 110,612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> 이 incubators 공동 </td><td> 다양한 제조 업체 </td><td></td><td> 35, 37 40 Humidified, 5 % CO 2, ° C </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 다양한 제조 업체 </td><td></td><td> 63x이나 100x 오일 목적과 이상적인 반전, 넓은 필드 </td></tr></tbody></table> HBSSc (블랙 외 11 ~했다.) <ul><li> 98.0 ML 행크스 균형 소금 솔루션 (Hyclone 카탈로그 번호 SH30588) </li><li> 100 μl 1M MgCl 2 (100 밀리미터 끝) </li><li> 100 μl 1M CaCl 2 (100 밀리미터 끝) </li><li> 2.0 ML 1M Hepes 산도 7.3 (20 밀리미터 끝) </li><li> 84 MG NaHCO 3 (10 밀리미터 끝) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

널리, 고맙게 여기게 세포내, protozoan 기생충 Toxoplasma gondii는 immuno-감염된 환자에서 기회 질환의 원인과 선천성 감염시 태아에 악영향을 끼친다. 1 : lytic 복제주기가 3 단계이 특징입니다. nucleated 숙주 세포의 활성 침공 2. 숙주 세포 안에서 복제 3. 숙주 세포에서 활성 탈출구. 탈출구의 메커니즘은 점점 여전히 저조한 분자 수준에서 이해하는 독특한, 높은 규제 프로세스로 평가되고있다. 탈출구의 기본 신호 전달 경로는 경로 1-5의 다양한 측면에서 행동 pharmacological 대리인의 사용을 통해 특성화되었습니다. 따라서 탈출구 여러 독립적인 트리거는 모든 세포 내 칼슘 2의 릴리스에 수렴하는 확인되었습니다 +, 또한 숙주 세포 침입 6-8에 중요 신호. 이러한 통찰력은 identi로 이끌었 후보 유전자 접근 방법을 알려탈출구 9 관련된 칼슘 의존 단백질 키나제 (CDPK)과 같은 식물의 fication. 또한, 이해 탈출구 여러 최근의 획기은 (화학) 유전 접근법에게 10-12를 사용되었습니다. Toxoplasma의 증가 유전자 접근으로 pharmacological 정보의 재산을 결합하기 위해 우리는 최근에 호스트 세포 밖으로 나가기 13 결함있는 기생충 뮤턴트 농축을 허용 화면을 설립했습니다. N-에틸-N-nitrosourea (ENU) 또는 에틸 methanesulfonate (EMS)를 사용하여 화학적 돌연변이 유발이 Toxoplasma 생물학 11,14,15의 연구에서 수십 년간 사용되고 있지만, 최근에 밑에 변이 유전자 매핑을 가지고 phenotypes는 일상 16가 -18. 또한, 온도에 민감한 돌연변을 생성하여 필수적인 프로세스를 해부 수 있으며 기본 유전자 직접 확인. 이러한 돌연변이가 허용 온도 (35 ° C) 이하 야생 형 답게 행동하지만, p로 ​​실패문제의 돌연변이의 결과로 제한 온도 (40 ° C)에서 roliferate. 여기에서 우리는 온도에 민감한 탈출구의 표현형 13 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 심사 방법을 설명합니다. 탈출구 화면에 대한 도전은 다시 침략 및 호스트 세포에 기생충 일반 끈적 거림 빨리 복잡하지 않은 egressed 기생충에서 egressed 분리하는 것입니다. 이전에 설립 탈출구 화면이 세포외 기생충 11 일부터 세포 분리 biotinylation 단계의 성가신 시리즈를 기반으로했다. 이 방법은 또한 약한 phenotypes 결과 조건부 돌연변이 생성되지 않았습니다. 여기서 설명한 방법은 숙주 세포 19 고집에서 기생충을 방지 glycan 경쟁, dextran 황산 (DS)를 포함하여 기생충을 egressing의 강한 첨부 파일을 극복. 또한, 세포외 기생충은 특히 세포내 기생충을 떠나는 pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)에 의해 죽였으니있다20 무사히. 따라서 구체적으로 유도 탈출구 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 화면, 유전학의 전원은 이제 완벽하게 숙주 세포의 출현의 기초 분자 메커니즘을 해명하도록 배포할 수 있습니다.

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한 방법입니다<em&gt; Toxoplasma</em&gt;는 숙주 세포에서 egresses. 프로토콜은 화학적으로 기생충을 mutagenize 위해 제공, 유도 탈출구 결함있는 돌연변이에 대한 풍부하고, 복제된 돌연변이 표현형을 검증하고 있습니다.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

12.9K 조회수.  Boston College. 앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한 방법입니다 Toxoplasma는 숙주 세포에서 egresses. 프로토콜은 화학적으로 기생충을 mutagenize 위해 제공, 유도 탈출구 결함있는 돌연변이에 대한 풍부하고, 복제된 돌연변이 표현형을 검증하고 있습니다.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

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Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

연구

면역학 및 감염병학

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...