이 작품은 DJB에 NIH에서 교부금 (AI041930, AI073142, AI075931, 및 AI091461)에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 우리는 대상 유전자 삭제, 유전자 대체, 그리고 / 또는 태그 유전자를 가지고 유전자 조작 자손의 효율적인 복구를 가능하게 Δ ku80 기생충 변종 대상으로 효율적인 유전자에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 방법의 순차적 인 실행은 1-3 단일 또는 여러 대상으로 유전자 조작을 포함하는 기생충 돌연변이 체의 분리에 대한 안정적인 접근 방식을 제공합니다. 대상 삭제의 생성이 여러 요인에 따라 다르지만, 제시된 전략 및 프로토콜 Δ ku80 변형의 사용은 크게 T.를 정확히 정의 된 돌연변이 균주를 제작의 효율성과 편의성을 향상 기능 게놈 연구를위한 gondii의. T.의 게놈 무성 생식 단계에서 gondii의이 반수체 있습니다. 따라서 유전자를 삭제할 계획 할 때 만들 수있는 고려 사항은 유전자가 생체에 필수적인해서는 안 것입니다. 그럼에도 불구하고, 타지의 효율성Δ ku80 변종 팅 유전자 녹아웃은 매우 높고, 이는 크게 손상 복제 속도로 돌연변이 균주의 분리 할 수 있습니다. 대상 유전자가 중요한 경우, 기생충은 종종 선택하는 동안 복제를 중단. 타겟 유전자 조작의 또 다른 중요한 요인은 유전 표적 측면의 적어도 620 BP가 검출 대상 통합 2를 얻기 위해 필요로 완벽한 동성이다. 동성 이상 지역 타겟팅 약 1,000 BP의 DNA의 측면을 대상으로하는 1-4 안정적이고 효율적인 방법입니다 사용하여 높은 효율을 생산하고 있습니다. 이러한 이유로 게놈 대상 측면은 T.의 동일한 균주에서 생성하는 것이 중요합니다 유전자 조작되고 변형 등 포자충 (RH, 저기,). 충분한 유사성의 부족은 종종 하나의 게놈 대상 측면의 대상으로 통합 될,하지만 다른 할 수 없습니다. 완전 통합 또는 녹아웃 엄마를 얻기 위해 실패Y는 에피 솜 지속성으로 인해합니다. 즉시 형질 전환 후, 표적 분자의 모든 episomes를 통합되지 않은 있으며, 때로는 표적 분자는 여러 세대 episomes로 유지할 수 있습니다. 1 ~ KBP 목표 DNA의 측면을 사용하기 전에 다시 서브 클로닝을 선택에서 기생충을 전달하기 위해 계속하는 것은 자주 에피 솜 지속성과 관련된 문제를 해결합니다. 한방의 유효성을 검사하고 HXGPRT 마커가 제거되면, 유전자 표적 전략은 1-3 단일 기생충 긴장에서 여러 유전자의 삭제를 생성하는 두 번째 GOI에 반복 할 수 있습니다. 삭제, 교체 또는 태그 유전자의 생성은 또한 다른 선택 마커 (블레오 마이신, CAT, pyrimethamine 저항 DHFR 등)를 사용하여 수행 할 수 있습니다. CAT 선택 마커가 현재 유형 II Δ ku80 저기, 게놈 1에 존재하지만,이 마커는 HXGPRT를 사용하여 제거 할 수 있습니다 </방명록&gt; 선택 프로토콜은 여기에 설명. 우리 손에, HXGPRT 선택이 단일 복사본을 대상으로 삽입 MPA + X 중간. HXGPRT의 강력한 선택에 대한 충분한 곳 가장 높은 대상으로 효율성을 가장 안전하고 가장 효율적인 마커도의 타겟 삭제 현재 유일하게 유용한 방법을 제공합니다 6 thioxanthine (6TX) 선택 2,3를 사용하여 선택 마커 (그림 3). 따라서이 프로토콜은 여러 타겟 유전자 조작으로 정의 된 돌연변이 균주 개발을위한 현재의 유일한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 톡소 포자충의 Δ ku80 변종 타겟 유전자 조작을위한 귀중하고 효율적인 방법을 제공하며, 하나의 유전자, 유전자의 가족, 또는 게놈 전체의 기능 게놈 연구의 분석에 적용 할 수 있습니다. 이전 Δ ku80 변종 1,2의 가용성에, 이러한 방식은 오프라인으로 인해 널리 실현되지 않았다이러한 방법 fficiency. 따라서,이 프로토콜은 톡소 포자충의 타겟 유전자 조작 광범위하게 적용하고 기생충 생물학, 호스트 응답 및 기능 유전체학에 대한 질문의 범위를 주소에 관심있는 모든 연구자에 액세스 할 수 있습니다.

톡소 포자충은 종종 일반적인 의무 세포 내 원생 기생충이며, 만성적으로 동물과 인간 5의 넓은 범위를 감염. 그것은이 병원균에 의해 10 억 이상의 인류가 현재 추정하고 만성 감염됩니다. T.에 의한 질병의 중요성에 추가 체외 성장과 우수한 마우스 모델에서 T. 만든의 gondii의 감염, 실험 도구, 강력한 게놈 자원 6의 증가 가용성, 편의성 gondii의 세포 진핵 병원체 및 말라리아 (Plasmodium의 SP에.) 및 크립토스포리디움 (Cryptosporidium의) 5,7과 같은 치명적인 질병을 일으키는 원인이 다른 중요한 apicomplexan 기생충의 광범위한 연구를위한 선도적 인 모델 시스템. 모델 생물로 톡소 포자충의 중요한 한계는 유전자 조작을 대상으로 나른다 자손의 비효율적 복구되었습니다. 이 proble 나유전자 타겟팅의 M은 T의 야생형 균주의 동종 재조합의 매우 높은 주파수를 기준으로 상동 재조합의 낮은 주파수로 인해 광범위한 DNA 상 동성이 유전자 연구 2에 사용되는 DNA의 표적 분자에 제공되는 gondii의 경우에도. 우리는 최근 유전자 타입 동종 재조합의 주요 통로를 차단 KU80 단백질 1,2 인코딩 유전자를 삭제하여 I 및 유형 II 톡소 포자충의 변종. I 및 유형 II Δ ku80 변종 정상적인 성장 속도, 크기 및 in vitro와 in vivo에서 체외 tachyzoite 및 bradyzoite 단계에서 생체의 두 동작을 결과 형식은, 그러나, 이러한 변형은 기본적으로 100 % 상동 재조합의 빈도와이 전시 표현형은 몇 칸토에 수백의 표적 유전자 조작으로 빠르게 분리 원하는 자손의 가능성을 증가USand에서 배 1,2,4. 최근 사회 전반 I 및 유형 II Δ ku80 긴장이 속도까지 크게 램핑이 유형의 사용, 다양한뿐만 아니라, T.의 표적 유전자 접근 방법의 성공률 gondii의 1-4,8-13. 여기에서 우리는 T.의 Δ ku80 변종 대상으로 유전자 삭제, 유전자 교체, 유전자 태그에 대한 포괄적 인 프로토콜을 설명 gondii의. 우리는 디자인하고 안정적으로 톡소 포자충의 Δ ku80 균주의 특정 유전자 또는 유전자 좌위에 유전자 조작을 대상으로하는 방법을 보여줍니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

상동 재조합을 사용하여 대상 유전자 조작 유전자 기능과 표현형 (들)의 상세보기를 얻을 수있는 기능 게놈 분석을 위해 선택의 방법입니다. 표적 유전자의 삭제, 대상 돌연변이 보완 유전자 기능 및 / 또는 태그 유전자 돌연변이 균주의 개발은 이러한 유전자 조작을 효율적으로 이중으로 통합 중재를 사용하여 그 유전자 현장을 대상으로 할 수있는 경우, 특히 유전자 기능을 해결하기 위해 강력한 전략을 제공합니다 상동 재조합을 통해 교차합니다. 톡소 포자충의 동종 재조합, 기능 게놈 분석의 매우 높은 속도로 인해 이전에 특정 유전자 좌위에 유전자 삭제 및 유전자 교체 대상에 대한 효율적인 방법의 부재로 제한되었습니다. 최근에, 우리는 유형 I 및 유형 II T의 변종 동종 재조합의 주요 통로를 폐지 유전자 encodin을 삭제하여 gondii의G KU80 단백질 1,2. Δku80 균주 tachyzoite (급성) 및 in vitro와 in vivo에서 bradyzoite (만성) 단계에서 일반적으로 행동과 상동 재조합 본질적으로 100 %의 빈도를 나타냅니다. Δ ku80 균주는 단일 유전자뿐만 아니라 게놈 규모의 1-4 페이지의 기능 게놈 연구는 가능합니다. 여기, 우리는 I 및 유형 II Δku80Δhxgprt 균주는 T.의 유전자 타겟팅 방식을 사전에 유형을 사용하는 방법을보고 gondii의. 우리는 산틴 - 크 산틴-구아닌의 phosphoribosyltransferase (HXGPRT) 선택 마커의 대상 삽입 또는 삭제에 의해 유전자 삭제, 유전자 교체 및 태그 유전자를 생성하기위한 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜을 대상으로 설명하는 유전자는 기생충 게놈의 기능 분석을 진행하고 수행 한 균주를 개발하는 Δku80 변종 다양한 방법으로 사용할 수 있습니다여러 유전자 조작을 대상으로. 이 유전 적 방법과 이후의 표현형 분석의 응용 프로그램은 T.의 생물학의 기본적이고 독특한 측면을 보여줄 것입니다 gondii의 말라리아 (Plasmodium의 SP에.) 및 크립토스포리디움 (Cryptosporidium의)이 발생할 관련된 중요한 인간 병원체.

자세한 템플릿은 제한 효소 사이트의 배치에 HXGPRT의 후속 삭제 유전 표적 유전자의 검증 대상뿐만 아니라, 플라스미드 건설을 촉진 프라이머의 생성을 포함, 유전자를 삭제 대상으로 플라스미드를 구축 제공됩니다 단일 단계 과정 (그림 1A-C, 그림 2A, 그림 3A). 일반 회로도 예를 들면, 목표 유전자 삭제 (그림 2A), 녹아웃의 삭제를 확인하는 데 사용되는 프라이머 쌍을 만들기 위해 제시, 유형 I rop18 (그림 2B) 및 PCR 검증의 대표적인 결과가 표시됩니다 (그림 2C). 이 대표 결과는 대상 상대적으로 어려운 유전자 좌위에서 얻을 수있는 결과의 범위를 설명하기 위해 표시됩니다. 성공적으로 목표 유전자 삭제에서의 유전자의 부재가 발생합니다관심이 늘어 PCR 제품 (PCR 1), (3)의 존재 &#39;게놈 대상 측면 (PCR2), 제대로 5 사이의 통합 HXGPRT 선택 마커의 존재&#39;와 (PCR3와 후 pCR4) 삭제를 정의 3 &#39;게놈 대상 측면 . 클론 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11 HXGPRT가 GOI (그림 2C)를 대체했다 타겟 유전자의 삭제를 (녹아웃) 확인됩니다. 유전자의 삭제를 포함하지 않는 클론은 밴딩 다양한 패턴으로 표현 될 수있다. 일반적으로 유전자의 삭제없이 복제는 PCR1 및 PCR2 관찰 밴드 부모의 변형 (부모 패턴)을 반영하지만 클론 1과 2 (그림 2C)를위한 것과 같이 PCR3 또는 후 pCR4합니다.합니다 이 &quot;부모의 패턴은&quot;몇 가지 잠재적 인 메커니즘에서 발생합니다. 때때로, MPA 저항 선택한 기생충 플라스미드 대상 pΔGOI의 비 통합 지속 episomes을 가지고, 우리는 계속 선택은 종종 이러한 episomes에게 강제주의통합 할 수 있습니다. 우리는 또한 내가 Δ는 pΔGOI의 의도 통합으로 인해 ku80 변형 DHFR 5 &#39;와 3&#39;발기인 요소 DHFR 유전자 좌도에 또는 부분적으로 삭제 HXGPRT에 통해 표현 HXGPRT의 cDNA를 포함하는 플라스미드 대상 형식 드문 배경을 준수 현장 14. 이 희귀 한 이벤트가 타겟 통합이지만, 그것은 의도 된 통합 아니었다 어떤 유전자 교체 전략을 설계 기억하는 핵심 역할을합니다. 타겟팅 pΔGOI에 실시 120 bp의보다 큰 DNA 상 동성이 플라스미드 원하지 않는 배경을 돌려 줄 수 Δ ku80 변종 2 재결합 다른 사이트를 제공 할 수 있습니다. HXGPRT 선택 마커 타입 II 형 DNA와 비교할 때 염기 다형성이 나는 순서를 기반으로하기 때문에 유형 II 저기, Δ ku80 변형이 배경이 감소 또는 존재하지 않는 나는을 입력 비교하는크게 유형 II 저기, Δ ku80 변형 1을 사용하여 실험이 드문 배경 줄어 듭니다. 유전자 현장은 (삭제할 수없는) 필수, 또는 현장에서 주파수를 대상으로, 또는 매우 낮은 유전자를 가지고 있다면 경우 episomes 쉽게 성장과 선택을 통해 제거되지 않습니다 【비 통합],이 부모 패턴 MPA에서 관찰 된 패턴을 지배하게 될 것이다 지속 저항 클론. 또한, 표적 DNA 분자는 때때로 단지 5 &#39;또는 3&#39;게놈 대상 측면과 밴드 (하지만 둘 다) 클론 10 같이 PCR1 및 PCR2과 함께 (5 PCR3 또는 후 pCR4 중 하나에 대한 관찰에 통합하는 관찰 &#39;통합) 및 복제 7 (3&#39;통합) (그림 2C). 이러한 패턴은 HXGPRT을 통합 만이 대상으로 통합이 관심의 유전자를 삭제하지 않는 현장에서 대상 플라스미드의 통합을 통해 단일 십자가의 드문 발생을 제안한다. 이 패턴 (레인 7 및 그림 2C 10) EM그 대상 통합 대신 발생 확인하는 PCR 데이터를보고 할 필요가 phasizes 하나는 동종 건너와 표적 분자의 동종 번째 통합. 드물게, 우리는 부모의 패턴 타겟 삭제 패턴을 모두 나타냅니다 클론 12 (그림 2C)로 표현 유전 적 혼합을 준수합니다. 이 패턴은 대부분 잘 복제에서 동일한 위치에 존재하는 두 개의 기생충 유전자형의 경우에 발생합니다. Δ ku80Δgoi에서 HXGPRT의 제거를위한 일반적인 회로도 :: HXGPRT 긴장에서 HXGPRT을 삭제할 수는 (그림 3A) 표시됩니다. 클론 4, 7, 9, 11, 12 (그림 3C)에서 볼 수 있듯이 Δ ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (그림 3B)에서 HXGPRT의 제거의 유효성을 검사하는 데 사용되는 프라이머 쌍은 PCR5에 고유 한 ~ 1.2 KBP 대역을 증폭. HXGPRT는 궤적, 2 ~ 3에서 제거되지 않은 경우.4 KBP 밴드는 (클론 1, 2, 3, 6, 8, 10 및 부모의 통제) 관찰된다. 몇 가지 메커니즘 HXGPRT의 제거 (6TX 선택) 더 도전적이고 HXGPRT의 통합 (MPA는 + X 선택)보다 효율적으로 만들기 위해 행동한다. MPA 선택은 6TX 선택 14,16 단순히 더 효율적입니다. 또한, HXGPRT 표현의 높은 수준은 MPA 선택 16,24보다 6TX 선택을 위해 필요합니다. 따라서, HXGPRT 효소 활동이나 돌연변이 또는 유전자의 현장에서 HXGPRT의 발현을 감소 성적인 변화를 줄일 수 변이는 잠재적 6TX 선택의 효과를 폐지 할 수 있습니다. 심지어 6TX 선택의 이러한 도전, Δ ku80 변종 6TX 선택의 성공률은 1-3의 첫 번째 시도에서 90 %보다 큽니다. 단백질 코딩 유전자의 직접 C-말단 태그에 대한 일반적인 구조는 (그림 4) 표시됩니다. 이방식은 태그 유전자의 HXGPRT 3 &#39;의 상동 재조합을 통해 더블 크로스를 통해 직접 통합을 사용하며 위에서 설명한 것과 유사한 검증 전략을 사용합니다. 유전자는이 플라스미드 독립적으로 격리 대상으로 DNA와 두 번째 형질 전환을 사용하여 확인할 수있다 필수적인 유전자로 의심됩니다. 이러한 규제 유전자 발현에 대한 계획과 같은 다른 방법은 유전자가 25 중요한 경우 추가 검증에 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> 그림 1. 플라스미드 대상 DNA의 설계의 개요. 설계. 도식은 PCR이 pRS416 셔틀 벡터와 HXGPRT의 minigene 카세트에 대한 33 bp의 겹침 5 &#39;와 3&#39;대상 측면을 증폭하는 데 사용되는 프라이머를 중복. 회로도에 나와 뇌관이었다5 &#39;및 3&#39;pΔROP18 10의 목표 측면. 표적 DNA 분자를 설계 B. 전반적인 전략을 생성하는 데 사용됩니다. pΔGOI의 백본 pRS416 셔틀 벡터를 포함하는 우라실 (URA) 및 암피실린 (AMP) 선택 마커입니다. ~ 1 KBP 5입니다 pRS416에 삽입 된 &#39;F1과 R1 프라이머를 사용하여 HXGPRT의 minigene 카세트 및 pRS416에 대한 중복과 게놈 DNA에서 증폭 된 DNA 대상 측면은 1 ~ KBP 3&#39;DNA 대상 측면을위한 중복과 게놈 DNA에서 증폭된다 HXGPRT의 minigene 카세트와 F2와 R2 프라이머 HXGPRT의 minigene 카세트를 사용 pRS416. 다음과 같은 고유 한 제한 효소 소화 사이트는 프라이머에 추가됩니다 F1 입문서는 re.X (제한 효소 X 컷 사이트) R2에 RE.Y, DNA 대상 측면 5 &#39;5의 끝&#39;에서 플라스미드를 잘라 소비세 HXGPRT 분에 R1 및 F2 프라이머의 DNA 대상 측면과 RE.Z 3 &#39;3 끝&#39;에서 플라스미드를 절단하는 프라이머rop18의 삭제 대상 구조를 생성하는 데 사용 igene 카세트입니다. C. 뇌관 시퀀스. 굵은 지역은 T.에 해당 gondii의 게놈 시퀀스와 굵은 글씨 이외의 지역 pRS416 및 HXGPRT의 minigene 카세트와 중복 제한 효소 사이트 및 시퀀스에 해당합니다. HX_F 및 HX_R 프라이머 쌍은 HXGPRT minigene 카세트 14 증폭. 프라이머는 5 ~ &#39;3&#39;읽어보십시오. 펜트 레스 등 10 일부터 적용 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> 그림 2. HXGPRT를 사용하여 유전자의 삭제에 대한 프로토콜의 개요. . DisruptioN 번 교차하여 Δ ku80Δhxgprt 변형에 GOI ~ 1 KBP 5 &#39;DNA 대상 측면과 ~ 1 KBP 3&#39;플라스미드 pΔGOI에 DNA 대상 측면을 사용하여 상동 재조합 이벤트. PCR의 PCR1를 사용하여 전략 PCR2, PCR3 및 후 pCR4은 (눈금 표시) GOI 궤적의 대상 HXGPRT의 통합 및 삭제를 가진 복제 시스템의 유효성을 검사하는 유전자형 확인을 가능하게하는 표시됩니다. B. 대표 프라이머 쌍은 rop18의 삭제를 검증하기 위해 설계 . ROP18_DF 및 ROP18_DR는 PCR1, ROP18_ExF 및 ROP18_CxR이 PCR2, ROP18_CxF 및 DHFR_CxR이 후 pCR4을 (그림 2A 참조) 증폭 PCR3 및 DHFR_CxF 및 ROP18_CxR을 증폭 증폭 증폭. 프라이머는 5 ~ &#39;3&#39;읽어보십시오. 표 펜트 레스 등의 HXGPRT를 사용하여 목표 유전자 삭제 (rop18)의 검증 10. C. 대표 결과를 적응. MPA의 Δ ku80Δhxgprt 및 선택에 플라스미드 pΔROP18의 다음 형질 +X, MPA + X 저항하는 클론 rop18의 삭제을 분석 하였다. 부모의 변형 제어 PCR 3 (~ 1,200 BP)과 PCR을위한 PCR 1 (~ 400 bp의) 및 PCR 2 (~ 650 bp의) 제품에 대한 긍정적이고 부정적인 4 (~ 1,300 BP) 제품입니다. 대상 GOI 녹아웃은 PCR2, PCR3 및 후 pCR4 제품에 대한 긍정적이며 (그림 2A 참조) PCR 한 제품에 대한 음수입니다. 표시는 PCR1 및 PCR2 (상단 패널)의 결과를 대표 패널, PCR3 (중간 패널) 및 후 pCR4 (아래 패널)입니다. 클론 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11은 복제의 타겟 유전자의 삭제 이벤트를 정의 PCR 1, PCR2, PCR3 및 후 pCR4의 정확한 밴딩 패턴을 나타냅니다. 클론 1, 2, 7, 10, 12 유전자 삭제하지 않습니다, 그리고 기타 잠재적 대표 결과에 해당합니다. (C = 부모의 통제 변형 Δ ku80Δhxgprt, M = 크기 마커). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> 그림 3. 관심의 유전자가 HXGPRT를 삭제하려면 다시 대상의 프로토콜의 개요. 더블 크로스 오버로 HXGPRT 선택 마커 제거 변형 Δ ku80Δgoi에서 상동 재조합 이벤트 :: HXGPRT은 1 ~ KBP 5 &#39;DNA 대상 측면과 ~ 1 KBP 3&#39;플라스미드 pΔGOIc에 DNA 대상 측면을 사용 A. 전략. 유전자형 확인을위한 PCR 전략은 (눈금 표시) 삭제를 걸쳐 PCR 제품 (PCR5)에 대한 분석에 프라이머 쌍을 사용하여 묘사된다. B.는 gra2에서 HXGPRT 선택 마커의 제거를 확인하기 위해 설계 담당자 프라이머 쌍 변형 Δ ku80Δgra2의 궤적 :: HXGPRT. 프라이머 GRA2 _CLF 및 GRA2_CxR는 PCR5를 증폭. 프라이머<html> 5 ~ 6TX에 Δ ku80Δgoi :: HXGPRT 및 선택에 플라스미드 pΔGOIc의 다음과 같은 형질을 얻을 수 있습니다 6TX 저항 클론. C. 대표위원회 &#39;3&#39;읽어보십시오. 클론 4, 7, 9, 11, 12 HXGPRT 마커의 대상 삭제 (~ 1.2 KBP 제품 그 측면 &#39;5에 약간의 중복에 측면&#39;과 3 &#39;외부 3에 걸쳐에 해당 PCR5의 정확한 밴딩 패턴을 전시 측면). 클론 1, 2, 3, 6, 8, 10 (이 밴드 빛)이 복제가 허용 6TX에 대한 저항의 정도를 전시에도 불구하고, 부모의 복제 유전자형에 해당하는 3.4 KBP ~ 주위의 예상 줄무늬 패턴을 나타냅니다 자신의 선택 (이 표현형은 가끔 (프로토콜 2.1 (8 단계)에있는 주 및 대표 결과 섹션을 참조하십시오) 셧다운 HXGPRT의 발현에 의해 자발적으로 발생할 수 있습니다. (C = 부모의 통제 변형 Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = 크기 마커).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> 그림 4. 단백질의 C-말단에 태그를 대상으로 DNA 분자의 디자인. 전략은 또한 3 &#39;하류 규제 영역으로 작동 할 수 HXGPRT 마커의 기능을 기반으로합니다. pΔGOItag의 백본 pRS416 셔틀 벡터 포함 우라실 (URA) 및 암피실린 (AMP) 선택 마커입니다. DNA 대상 측면에 대한 중복과 게놈 DNA에서 증폭 ~ 1 KBP 5 &#39;Fgoi 및 Rtag 프라이머 ~ 1 KBP 3 사용 HXGPRT의 minigene 카세트 및 pRS416에 대한 중복과 게놈 DNA에서 증폭 된 DNA 대상 측면&#39;은 pRS416에 삽입 F2와 R2를 사용하여 HXGPRT의 minigene 카세트 및 pRS416프라이머 및 HXGPRT의 minigene 카세트입니다. 5 &#39;DNA 대상 측면은 대체 종료 코돈 다음 태그 (HA, Myc와 그의 등) 종료 코돈을 대체합니다. MPA + X 선택은 C-말단 태그와 하류 HXGPRT을 통합하고, HXGPRT 마커 다음 위치 3 &#39;UTR 이동합니다. 다음과 같은 고유 한 제한 효소 소화 사이트는 프라이머에 추가됩니다 Fgoi 프라이머의는 re.X (제한 효소 X 컷 사이트) DNA 대상 측면 5 &#39;5의 끝&#39;에서 플라스미드를 잘라 RE.Y에 플라스미드 건설에 사용하는 다시 대상 태그 유전자 현장 삭제하려면 HXGPRT의 minigene 카세트 소비세에 Rtag 및 F2 프라이머의 DNA 대상 측면 3 &#39;3 끝&#39;에서 플라스미드 및 RE.Z을 잘라 R2 프라이머 3 &#39;UTR의 위치를 복원합니다 HXGPRT 마커.

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Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

여기에서 우리는 유형 I 및 유형 II를 사용하는 방법을보고<em&gt; Δku80</em의&gt; 변종<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 효율적으로 기능 게놈 분석 대상으로 유전자 삭제 및 유전자 교체를 생성합니다.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

16.9K 조회수.  The Geisel School of Medicine at Dartmouth. 여기에서 우리는 유형 I 및 유형 II를 사용하는 방법을보고 Δku80 변종 톡소 포자충 효율적으로 기능 게놈 분석 대상으로 유전자 삭제 및 유전자 교체를 생성합니다.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

고도 정화 구하기 Toxoplasma gondii</em불연속 세슘 클로라이드 그라디언트로> Oocysts

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

연구

면역학 및 감염병학

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...