정신 건강의 국립 연구소에서 : 설명이 프로젝트는 보너스 번호 R01MH079751 (F. PERUZZI PI)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 정신 건강의 국립 연구소 또는 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

다음 프로토콜은 준비 PCR 플레이트를 사용하여 CSF 및 프로필 마이크로 RNA에서 RNA를 분리하는 표준 절차를 설명합니다. 유기 상 추출은 선택 사항이며, 캐리어 RNA가 RNA의 최대 회수를 보장하는 동안 추출 시료에 첨가되어 있습니다. 결과적으로, RNA를 정량화 할 필요가 없다. cDNA를가 (약 2 시간) 전날 합성하면 전반적으로, 6 ~ 8 판의 평균 하루에 실행할 수 있습니다. 모든 샘플은 프로파일 및 소프트웨어에로드 된 경우 데이터의 분석을 수행한다. 비교를위한 샘플 / 개 또는 그들의 조합의 수에 따라, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 필요할 수도있다. 1. RNA 추출 RNA 추출이, CSF 샘플에서 수행 된 저장 분석까지 분량 씩 -80 ° C에 냉동. 이 절차 mirVana 파리 격리 키트 제조업체의 악기에 따라 사용총 RNA의 분리를위한 ctions. 작은 RNA 종에 대한 농축이 키트와 함께 가능하지만,이 단계가 완료되지 않고 RNA 추출 절차는 총 RNA의 분리 단계 이후에 종료,주의하시기 바랍니다. (다른 상업적으로 이용 가능한 RNA 분리 키트 등) mirVana 파리 분리 키트는 유기 추출을 필요로하지 않지만 또한,이 절차에 대한 프로토콜은 아래에서 확인할 수 있습니다. RNA 추출을위한 프로토콜은 두 단계로 구성 1.1. 유기 추출 (mirVana 파리 RNA 추출 키트를 사용하는 경우에는 필요하지 않음) 1.2.2. 총 RNA 분리 1.1. 유기 추출 1.1.1. 시약 준비 <ol><li> 솔루션을 변성 2 배 2 - 머 캅토 에탄올 375 μl를 추가하고, 4 ℃에서 저장 </li></ol> 1.1.2. CSF를 준비 <ol><li> RNA 추출하기 전에 얼음에 CSF의 모든 나누어지는 해동. 부드럽게 0.5 해동 CSF의 ML과에 MS2의 RNA 캐리어의 1 μg을 추가혼합. 유기 추출 생략하면 MS2 캐리어 아래 1.2.2.1에 설명 된 샘플 종래 RNA 분리에 첨가되므로주의. </li><li> CSF에 실온에서 2 배 변성 용액 0.5 ㎖를 혼합한다. </li><li> CSF 플러스 2 배 변성 용액에 클로로포름 : 산 - 페놀의 1 ML을 추가 클로로포름,하지 혼합물의 상단에 자리 잡고 수성 버퍼 : 산 - 페놀을 포함하는 아래 단계를 철회해야합니다. 클로로포름이 시약을 사용하여 작업 할 때 독 및 자극을 사용 장갑 등 개인 보호 장비 페놀을 포함 또한, 산 - 페놀이 있습니다. </li><li> 30 ~ 60 초 혼합하는 소용돌이. 편의를 위해 샘플의 2 ㎖는 / 솔루션 / 산 변성 페놀 : 클로로포름의 혼합을 두 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 나누어집니다. </li><li> 실온에서 최대 속도에서 5 분 (10,000 ×)에 대한 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 낮은 단계 또는 계면을 방해하지 않고 수성 (위) 단계를 제거하고로 전송신선한 관. 복구 볼륨을합니다. </li></ol> 1.2. RNA 분리 그것은 전용 피펫 세트 벤치 및 RNA 샘플을 처리하기위한 랙을 가지고하는 것이 좋습니다. 작업 영역과 도구의 RNase 보내 겠 스프레이를 사용하여 오염을 제거하고 이전에 각 실험을 쳐있다. 1.2.1. 시약을 준비한다 : <ol><li> miRNA의 세척 용액 1에 100 % 에탄올 21 mL를 넣고 세척 솔루션 2 / 3 ~ 40 ㎖를 100 % 에탄올. miRNA의 세척 용액 1은 잠재적으로 위험한 물질이다 guanidium 티오 시아 네이트를 포함하고 있다는 사실에 유의하시기 바랍니다. </li></ol> 1.2.2. 총 RNA 분리 <ol><li> 유기 추출에서 수상에 상온 100 % 에탄올 1.25 볼륨을 첨가하고 잘 섞는다. </li><li> 컬렉션 튜브 중 하나에 필터 카트리지를 놓습니다. </li><li> 필터 카트리지에 해물 / 에탄올 혼합물의 피펫 이하 700 μL. </li><li> 최대 30 초 동안 원심 분리기속도. 같은 필터로 연속 응용 프로그램에서 700 μl를 초과하는 혼합물을 적용합니다. 모든 원심 분리 한 후 흐름을 통해 폐기 및 세척 단계는 포집 관을 저장합니다. </li><li> 최대 속도에서 15 초 동안 필터 카트리지와 원심 분리기에 700 ㎕의 miRNA의 세척 용액 1을 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. </li><li> 최대 속도에서 15 초 500 μL 세척 솔루션 2 / 3와 원심 분리기를 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. 최대 속도에서 15 초 동안 두 번째 500 μL 세척 솔루션 2 / 3와 원심 분리기를 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. 필터에서 잔여 액을 제거하기 위해 최대 속도로 1 분 동안 어셈블리를 스핀. </li><li> 신선한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송합니다. 신청 (100) 및 무, 필터의 중심에 예열 (95 ° C)에서의 nuclease 무료 물 리터, 뚜껑을 닫습니다. RNA를 복구하기 위해 최대 속도로 30 초 동안 원심 분리기. </li><li> 용출액을 포함하는 RNA를 수집하고 이후의 응용 프로그램에 대한 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> NanoDrop의 2000C 분광 광도계를 사용하여 RNA의 1 μl를 정량화. RNA을 운반 RNA 추출시 샘플에 추가 된 경우 RNA 정량은 건너 뛸 수 있습니다. 아래에 자세히 그 경우 RNA의 8 μL는 cDNA 합성을 실시한다. </li></ol> 2. miRNA의 프로필 : QRT-PCR 프로토콜 miRNA의 프로파일에 대한 프로토콜은 두 단계로 구성 <ol><li> 첫 번째 가닥 cDNA 합성 </li><li> 실시간 PCR 증폭 </li></ol> 2.1. 첫 번째 가닥 cDNA 합성 2.1.1. 템플릿 RNA를 희석 <ol><li> 5 NG / 뉴 클레아 무료로 물을 사용 μL의 농도로 템플릿 RNA 샘플의 각을 조정합니다. 만약RNA (단계 1.2.2.9 참조) 정량화되지 않은, 다음 RNA의 8 μL는 cDNA 합성에 사용된다 </li></ol> 2.1.2. 시약 준비 <ol><li> 조심스럽게 배 반응 버퍼를 해동하고 무료 물을 클레아, 즉시 얼음에 배치합니다. </li><li> 소용돌이로 교반하여 혼합. 재현 탁 RNA 스파이크의 튜브에 40 ㎕의 클레아 무료 물을 추가하고 소용돌이로 교반하여 혼합하여, 15 ~ 20 분 동안 얼음에두고.에게 즉시 사용하기 전에, 냉장고에서 효소의 혼합을 제거 튜브를 가볍게 치면 혼합하고 얼음에 배치합니다. 모든 시약을 스핀 다운. </li></ol> 2.1.3. 역전사 반응 설치 <ol><li> 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브, 또는 동등한 RT 작업 솔루션의 필요한 금액을 준비 (비율 RNA 템플릿을 제외하고, 표 1), (최대 속도로 1 ~ 2 초) 텍싱하여 혼합, 간단하게 (스핀 다운 우리는 고정 속도, 10 초)와 미니 에펜 도르프의 원심 분리기를 사용하여 얼음에 놓습니다. 참고 UniSp6의 RNA 스파이크인은 (표 1 참조) RT 반응 전에 시료에 첨가한다. </li><li> 클레아 무료 PCR 튜브에 RT 작업 용액을 분사합니다. </li><li> 각 튜브에 템플릿 RNA를 분배. 참고 : 10 %를 초과하는 볼륨 / 피펫 및 / 또는 로봇 죽은 볼륨에 대한 각각의 시약을 계산하는 것을 기억하십시오. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 패널 I 양 (μL) </td><td> 패널 I + II 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 배 반응 버퍼 </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> 클레아 무료 물 </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> 효소 혼합 </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA 스파이크의 템플릿 </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> 템플릿 총 RNA (5 NG / μL) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tR&gt; <tr><td> 총 양 </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> 표 1. 전사 반응 설정 반전. </li></ol> 2.1.4. 혼합 시약을 회전 <ol><li> 모든 시약이 완전히 혼합되도록 부드러운 (1-2 초) 소용돌이로 교반하여 반응을 섞는다. 혼합 한 후, (고정 속도, 10 초 미니 에펜 도르프 원심 분리기)를 스핀 다운. </li></ol> 2.1.5. 품어 열을 비활성화 <ol><li> 다음과 같이 PCR 기계를 프로그램 : </li><li> 42 ° C에서 60 분 알을 품다 </li><li> 95 ° C에서 5 분의 역전사 효소를 열 불 활성화 </li><li> 4 ° C에 즉시 차가운 </li><li> 4 ° C에서 또는 동결에 보관 참고 : 프로토콜이 단계에서 중단 할 수있다. 희석 cDNA를 최대 오주 (최대 4 일 동안 4 ° C에서 선택적 저장소)에 -20 ° C로 유지 될 수있다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. 실시간 PCR 증폭 2.2.1. 실시간 PCR 시약을 준비 <ol><li> 얼음에 (단계 2.1.5에서)의 cDNA를 놓습니다. </li><li> 얼음 해동 클레아 무료 물과 PCR 마스터 믹스. 알루미늄 호일로 덮어서 빛으로부터 PCR 마스터 믹스 튜브를 보호합니다. 즉시 사용하기 전에, 미니 원심 분리기 1 ~ 2 초 텍싱하여 PCR 마스터 믹스를 혼합하고 1 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. </li></ol> 2.2.2. SYBR 녹색 마스터 믹스, 물, 그리고 cDNA를 결합하고 PCR 플레이트에 추가 다음 절차는 튜브의 표면에 부착 된 cDNA의 낮은 농도를하지 않는 것이 좋습니다 : <ol><li> 플레이트 씰을 제거하기 전에, 간단히 1 분 1,500 XG에서 냉장 원심 분리기에 플레이트 (들)을 스핀 다운. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 2 배 PCR 마스터 믹스와 물을 결합한다. 패널 I : 2,000 μL 2X 마스터 믹스 1980 μL 물, 패널 I + II : 4,000 μL 2X 마스터 믹스와 3,960 μ, L의 물. </li><li> 20 μL의 cDNA를 (패널 I) 또는 40 μL의 cDNA를 (내가 II를 + 패널)을 추가하고 혼합한다. </li><li> 1 ~ 2 초 텍싱하여 부드럽게 혼합 1 분 1,500 XG에서 냉장 원심 분리기의 회전 속도. </li><li> 멀티 채널 피펫 저수지에서 PCR 마스터 믹스 / cDNA를 혼합 배치합니다. 당신은 멀티 채널 피펫의 길이가 저수지를 식별 할 수 있습니다. 이것은 채널에 걸쳐 동일 부피의 분취 량을 허용 충분히 높은 볼륨의 레벨을 유지한다. 이것은 지난 몇 분주으로 중요합니다. </li><li> 10 ㎕의 PCR 마스터 믹스를 분배 / cDNA를 16 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트의 각 웰에 섞는다. </li><li> 광학 밀봉와 플레이트를 밀봉. </li><li> 솔루션을 혼합 기포를 제거하기 위해, 냉장 원심 분리기 (1 분 1,500 XG)에서 간단히 플레이트 스핀. 참고 : 실험이 시점에서 일시 정지 될 수있다. 최대 24 시간 동안 4 ° C에서 빛으로부터 보호 반응을 저장합니다. </li></ol> 2.2.3. 실시간 PCR 표 2에 설명 된 매개 변수를 다음과 실시간 PCR 증폭과 융해 곡선 분석을 수행합니다. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 공정 단계 </td><td> 설정, 로슈 LC480 </td></tr><tr><td> 중합 효소의 활성화 / 변성 </td><td> 95 ° C에서 10 분 </td></tr><tr><td> 확대 </td><td> 증폭 45 사이클에서 95 ° C에서 10 초 60 ° C에서 1 분 램프 속도 1.6 ° C / 초 광학 읽기 </td></tr><tr><td> 용융 곡선 분석 </td><td> 예 </td></tr></tbody></table> 표 2. 로슈 LightCycler 480을 사용하여 실시간 PCR 사이클 조건. 2.3. 실시간 PCR 데이터 분석 실시간 PCR 데이터 분석, Exiqon 제넥스 프로 5.0와 함께 이루어집니다 다음 t그는 지침을 권장합니다. 제넥스 단계별 설명서에서 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> 데이터 분석은 세 단계로 구성 <ol><li> 데이터 가져 오기 </li><li> 데이터의 전처리 </li><li> 통계 분석 </li></ol> 2.3.1. 데이터 가져 오기 <ol><li> 로슈 LightCycler 480에서 2 차 미분 분석 방법을 선택하고 Cq와 값을 계산합니다. 데이터는 테이블로 내 보낸 텍스트 파일로 저장됩니다. </li><li> 데이터, 오픈 제넥스을 가져 Exiqon 가져 오기 마법사 버튼을 클릭하고 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. 형식, 악기와 플레이트 레이아웃 파일을 선택하는 지침을 따르십시오. 그 플레이트 레이아웃 파일 (엑셀 파일) Exiqon 웹 사이트 (에서 다운로드 참고 <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files을</a> ). </li><li> IMPORT 패널은 I 및 II와 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 파일 가져 오기 한 후 생성 된 테이블은 사전 정의 된 열이 포함되어 있습니다. 샘플 단순 편집 할 수 및 분류 컬럼이 추가되거나이 단계에서 제거 될 수있다. 작업이 완료되어 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 데이터를 저장하고 데이터 편집기에로드 할 수 있습니다. </li></ol> 2.3.2. 데이터의 전처리 <ol><li> Exiqon와 제넥스에서 권장하는 여러 판을 비교할 때, 할 수있는 첫 번째 일은 사전 메뉴에서 간 판 교정을 선택하여 판 사이의 데이터를 보정하는 것입니다. </li><li> 그것은 세중 실행에 miRNA의 배열을 실행하는 것이 좋습니다. miRNA의 세 개의 복제본 중 적어도 두에없는 경우는 nonexpressed로 설정됩니다. </li><li> 사전 처리의 다음 단계에서, 상처를 출발했다. 차단 값을 정의 임계 사이클 (C의 T)이 값보다 높은과 데이터가 삭제되는 것을 나타냅니다. 뇌척수액 검체를 사용하여 본 실험에서, 컷 오프는 39로 설정 하였다. 거기efore, 세 개의 복제본의 39보다 C의 t 이상과 모든 시료는 삭제됩니다. miRNA의 한 프로브 (세 가지 중 하나의 복제)에&gt; 39 C의 t가있는 경우, 그 독서는 다른 두 프로브 C (T)의 평균으로 대체가 39 아래에 둘 다 제공됩니다. </li><li> 참조 유전자를 정의합니다. 제넥스 전문 참조 유전자를 식별하는 geNorm 및 / 또는 NormFinder을 활용하는 옵션이 있습니다. 모든 샘플에 걸쳐 유사한 Cq와 값을 가지고 geNorm 및 / 또는 NormFinder를 실행의 miRNAs의 목록을 선택합니다. 이 분석에 따르면, 여기에 제공된 예에서, 미르 - 622과 미르 - 1266 샘플에서 가장 균일 한 값을 가지고 있었다 (그림 1) 참조 유전자로 선택되었다. </li><li> 다음에, 데이터는 표준 발현 유전자를 사용하여 정규화 및 얻어진 값 ΔC의 t에 해당된다 </li><li> cDNA 합성 반응은 삼중으로 수행 된 경우,이 시점에서 값을 평균화한다. </li><li> 다시 시트의 유효성을 확인빈 거의 빈 열을 이동합니다. 전처리 창에서 선택 &quot;시트의 유효성을 검사합니다&quot;하고 제거 빈 열 라인에 적용보다. 아래 행에서 유효한 데이터의 원하는 비율을 선택하고 적용을 클릭합니다. 모든 샘플에 공통된의 miRNA를 비교하고자하는 경우 예를 들어, 100 %를 선택합니다. </li><li> 누락 된 데이터를 처리합니다. 전처리 메뉴에서 &quot;누락 된 데이터&quot;를 선택하고 누락 된 데이터를 처리 할 수​​있는 옵션 중 하나를 선택했다. 이 단계가 필요합니다. 당신이 처리되지 않은 누락 된 데이터가 포함 된 파일을로드하려고하면 제넥스는 당신에게 오류를 줄 것이다합니다. </li><li> 샘플 (제어 대 즉. 실험) 그룹의 상대 정량을 결정합니다. 집단 간의 상대 정량은 ΔΔ C의 T 방법을 사용하여 계산됩니다. 제넥스에서 사전 탭을 클릭하고 상대 정량을 선택합니다. 창에서 참조 그룹을 선택하고 적용 누르십시오. EXPR, 그래픽 표현과 / 또는 추가 통계 분석을 위해 그것을 참고ession 데이터는 로그 스케일로 변환해야합니다. 전처리 메뉴에서 LOG2을 선택합니다. </li></ol> 2.3.3. 통계 분석 제넥스 소프트웨어는 T-테스트 및 ANOVA 통계 분석 등의 폭 넓은 범위를 허용한다. <ol><li> 제넥스와 공개 데이터 관리자로 최종 MDF 파일을로드합니다. 통계적 분석이 수행되는 샘플의 정확한 샘플 또는 그룹을 선택하는 것이 중요하다. </li><li> &quot;통계&quot;를 선택하고 원하는 테스트에 해당하는 아이콘을 선택했다. </li><li> 제어판 창에서 &quot;실행&quot;을 클릭합니다. Excel 또는 MDF 파일로 결과를 저장합니다. </li></ol> 2.3.4. 발현 프로파일 다음과 같이 마이크로 RNA 샘플은, 분류, 클러스터링 및 열지도 및 계통도에 가시화 될 수있다 <ol><li> 제넥스와 공개 데이터 관리자로 최종 MDF 파일을로드합니다. 샘플이나의 miRNAs의 그룹을 선택하고 작성하려면이 창을 사용합니다. 당신이 완료되면 &quot;적용&quot;을 클릭합니다. </li> &lt;왼쪽 상단 모서리를 선택 클러스터의 리&gt;와 히트 맵 아이콘을 클릭 </li><li> 제어판 창에서 &quot;실행&quot;을 클릭합니다. 히트 맵은 TIFF 나 BMP 등의 다양한 형식으로 저장할 수 있습니다, 그것은 또한 복사하고 필요에 따라 수정 될 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

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마이크로 RNA는 번역 억제 및 / 또는 mRNA의 분해 2를 촉진하여 유전자 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA를합니다. 때문에 세포가없는 조건에서 높은 안정성, 마이크로 RNA는 많은 체액에서 검출되었다. 또한, 마이크로 RNA의 서로 다른 발현 양상은 인간의 암 3-9의 다양한 단계 및 / 또는 진행과 상관 관계가있다. 고전 칩 배열하거나 최신 깊은 시퀀싱 기술을 포?...

마이크로 RNA는 이후 전사적으로 유전자 발현을 조절하는 RNA를 비 암호화 (길이 NT 21-23) 소규모의 가족에 속한다. 마이크로 RNA들이 비교적 안정적인 것으로 나타나는 세포 외 공간으로 분비 될 수있다. miRNA의 발현의 변화를 결정하는 miRNA의 프로파일을 수행하고 많은 양의 데이터를 처리, 생체 식별 향한 중요한 단계 일 수 있지만 위협 할 수있다. 여기, 우리는 민감한 실시간 PCR에 의한 (기타 체액에 적용) 뇌척수액에서의 miRNA 발현의 변화를 확인하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 또한 통계 분석 결과의 그래픽 표현을 포함하여, 데이터 분석을위한 소프트웨어의 사용을 설명한다. 전체 절차는 비교적 쉽고 간단하며, 프로파일 및 실시간 PCR 기계의 수를 사용할 수 있습니다, 또한 상대적으로 빨리 할 수​​있는 샘플의 수에 따라 달라집니다. 실험 부분은 처리의 정확성을 필요로384 - 웰 플레이트에 RNA와 피펫, 제넥스를 사용하여 데이터 분석 섹션 정보학 및 통계의 몇 가지 기본 지식을 필요로하는 동안.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> 마이크로 RNA (의 miRNA)는 자신의 번역 억압을 조절함으로써, 결과적으로의 mRNA에있는 사이트를 대상으로하는 RISC를 안내하여 유전자 조절의 강력한 층을 구성한다. miRNA의 발현의 변화는 모든 주요 복잡한 질병의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근의 연구 결과는의 miRNA가 세포 외 환경을 분비하고 높은 안정성을 순환 할 수있는 혈액 및 기타 체액을 입력 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 순환의 miRNA의 기능은 크게 애매 남아 있지만, 이러한 miRNA의 프로파일 배열과 같은 체계적인 높은 처리 방법은, 신경 퇴행성 질환 및 암의 여러 종류 등 여러 가지 병적 인 상태에서의 miRNA 서명의 식별로 이어질있다. 이러한 맥락에서, 뇌척수액에서의 miRNA 발현 프로파일의 식별은, 우리의 최근의 연구에보고 된, 바이오 마커 분석의 miRNAs 매력적인 후보가 있습니다. _content &quot;&gt;와 같은 마이크로 어레이와 같은 마이크로 RNA를 프로파일 링 할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다, 정량 실시간 PCR (qPCR에), 깊은 시퀀싱. 여기에서, 우리는 정량 실시간 PCR에 의해 뇌척수액의 마이크로 RNA를 프로필에 민감한 방법을 설명합니다. 우리 Exiqon 마이크로 RNA 즉시 사용 PCR 인간의 패널을 사용하는 I와 수 II V2.R, 742 독특한 인간 마이크로 RNA의 검출. 우리는 세중 실행의 배열을 수행하고 우리가 제넥스 프로 5 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 분석했다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 세포 선 및 일차 전지, CSF, 플라즈마, 포르말린 고정 파라핀 조직의 다양한 종류의 마이크로 RNA를 프로파일했다.

이 연구 결과는 이전에 1 발표되었다. geNorm 응용 프로그램을 사용하여 후보 참조 마이크로 RNA의 분석 1은 결과를 그림. 따라서,이 마이크로 RNA, 미르 - 622 미르-1266은 표준 발현 유전자로서 식별하고, miRNA의 값을 정규화하기 위해 사용되었다. CSF의 연구를 위해 우리가 샘플의 세 그룹을했다 : HIV-(N = 10), HIVE 뇌염없이 (N = 4), 그리고...

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K 조회수.  LSU Health Sciences Center.  우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

연구

의학

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

운동은 성능의 실시간 피드백을 사용하여 재교육

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

신생아 마우스 폐에서 폐 유체 볼륨의 실시간 X 선 영상

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...