우리의 프로토콜은 FFPE 유래 RNA 샘플, 특히 최적이 아닌 품질 샘플에서 생성된 유전자 발현 데이터의 품질과 양을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 FFPE 조직 샘플 내의 RNA 품질을 평가하고 다운스트림 처리를 최적화하여 샘플 시퀀싱 데이터의 양과 품질을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 생물학적 및 임상 샘플에서 성적증명서의 포괄적인 특성화를 허용하고 개발 및 질병에서 게놈의 기능적 요소에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
샘플 QC, 라이브러리 준비 및 데이터 분석을 위한 방법의 FFPE-RNA 분해 및 선택은 모두 매우 까다로울 수 있다. 올바른 방법과 적절한 컨트롤을 선택할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 시각적 데모를 사용하면 시청자가 계획, 평가 및 시퀀싱 프로세스, 특히 제대로 보존되지 않은 FFPE 샘플에 필요한 작은 미묘한 수정 및 예방 조치를 관찰할 수 있습니다.
RNA 샘플의 품질을 확인하기 위해 제조업체의 지침에 따라 RNA QC 시스템에서 샘플을 실행하고 적절한 생체 분석 소프트웨어를 사용하여 샘플 내의 RNA 단편의 분포를 분석하고 100 및 200 뉴클레오티드보다 긴 단편의 비율을 계산한다. QC 메트릭에 기초하여, 100뉴클레오티드보다 더 긴 단편의 40% 미만으로 샘플을 식별하여 이러한 샘플을 처리에서 배제할 수 있도록 한다. 시퀀싱을 위해 실온 수조에서 실행 매개 변수에 따라 적절한 시퀀싱 시약 키트를 해동하고 해동 후 시약 트레이를 섭씨 4도로 놓습니다.
유동 셀 패키지를 실온에 30분 간 놓습니다. 패키지가 온난화되는 동안 일루미나 실험 관리자 응용 프로그램을 열고 샘플 시트 만들기를 선택합니다. 사용할 시퀀서를 선택하고 다음을 클릭합니다.
시약 키트 바코드 및 기타 적절한 워크플로 매개 변수를 입력합니다. 그런 다음 일루미나 시퀀스 기준에 따라 생성된 샘플 시트를 업로드합니다. 샘플 라이브러리 및 제어 라이브러리 PhiX를 준비하려면 라이브러리를 적절한 농도로 분해하고 희석하고 샘플 및 PhiX 제어 라이브러리를 혼합하여 5% PhiX 제어 부피 비율을 얻습니다.
유동 세포가 준비되면 랩핑을 제거하고, 보풀이 없는 알코올 닦아로 유리 표면을 청소하고, 낮은 보풀 실험실 조직으로 유리를 건조시다. 시약 카트리지를 섭씨 4도에서 제거하고 카트리지를 5번 반전하여 시약을 혼합합니다. 벤치의 카트리지를 부드럽게 탭하여 기포를 줄이고 디네이처및 희석된 샘플을 지정된 저수지의 시약 카트리지에 적재합니다.
유량 셀, 버퍼 카트리지 및 시약 카트리지를 시스템에 로드합니다. 그런 다음 자동 검사를 수행하고 출력을 검토하여 실행 매개 변수가 시스템 검사를 통과할 수 있도록 합니다. 자동 검사가 완료되면 시퀀싱 실행을 시작하도록 선택합니다.
사전 처리 QC 및 정렬 후 QC 결과를 시각화하려면 멀티 QC를 실행하여 HTML 형식으로 집계된 보고서를 생성합니다. 배치 효과를 결정하고 지정된 데이터 집합의 품질 맵을 평가하기 위해 R 스크립트를 사용하여 주 구성 요소 분석을 실행합니다. 그런 다음 샘플 상관 관계 분석은 다른 샘플 간의 Pearson 상관 관계를 사용하여 수행될 수 있습니다.
100개 이상의 뉴클레오티드 보다 긴 단편의 비율의 추정은 고분해된 RNA 시료에 대한 작은 단편 크기의 비율을 정확하게 측정하기 위해 더 민감하기 때문에 200뉴클레오티드보다 긴 단편의 추정보다 더 유용하다. 샘플 세트에서 높은 수준의 분해를 감안할 때, 총 RNA 라이브러리 준비 방법이 권장됩니다. 예를 들어, 여기에 네 가지 샘플에서 준비된 시퀀싱 라이브러리가 표시됩니다.
여기서는 원시 FastQ 파일 시퀀싱 품질 및 샘플 어댑터 콘텐츠에 대한 개요가 표시됩니다. FastQC 스크리닝은 샘플 내의 세균 또는 마우스 오염과 같은 오염을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다. STAR 정렬은 참조 게놈에 매핑된 판독의 비율, 참조 게놈에 고유하게 매핑된 판독의 비율 및 매핑되지 않은 읽기의 비율 또는 여러 loci로 매핑된 읽기의 비율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
카드 및 RSeQC 통계는 매핑된 판독값에 존재하는 메신저 RNA, 내성 및 상호 간 기지의 백분율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 대표적인 분석에서 일부 저격된 라이브러리에는 5개의 프라임 엔드보다 더 많은 읽기가 3개의 프라임에 더 가깝게 매핑되는 세 가지 주요 편향이 있었습니다. 또한, 주 성분 분석은 각 시료의 생물학적 복제를 위해 주성분에 의해 포획된 총 변이의 백분율을 결정하기 위해 수행될 수 있다.
샘플 분해를 방지하고, 각 샘플에 대한 복제 및 여러 코트를 준비하고, 적절한 메트릭을 사용하여 샘플 품질을 평가하고, 올바른 라이브러리 준비 방법을 사용하십시오. 이 방법론을 사용하여, 더 큰 NGS 연구는 다양한 저장 시간 및 조건에 이전에 사용할 수 없는 FFPE 견본으로 수행될 수 있습니다 다양한 질병 상태에 통찰력을 얻기 위하여. 이 기술은 연구원이 풍부한 임상 정보를 가진 FFPE 견본의 기존 큰 기록보관소를 연구하고 인구 기지를 둔 암 연구 결과를 크게 향상할 수 있는 쪽을 포장했습니다.
