우리의 기술은 T 세포 폐 호밍의 과정에 흥미 진진한 통찰력을 제공하는 생체 내 염증 조건에서 폐 축적 된 인간 면역 세포의 정확한 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 T 세포 폐 호밍에 대한 번역 연구를 지원하고 염증성 또는 알레르기 성 폐 질환의 최적화 된 치료를위한 새로운 표적의 식별에 도움이 될 수 있습니다. 특히, T세포 폐호밍에 대한 질병특이적 면역세포 특성, 폐조직 조직 및 염증성 밀리우의 영향을 고려하는 능력은 이 방법을 매우 유리하게 만든다.
전반적으로, 우리의 기술은 수시로 활성화된 면역 세포의 압도적인 조직 축적에 의해 구동되는 만성 선동적인 폐 질병의 필드에 있는 면역학 연구를 위한 높은 가치입니다. 적어도 16그램, 6주 된 마취 C57 블랙 6J 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마이크로 파이프를 사용하여 갓 준비된 파파인 10 마이크로리터를 3일 연속으로 마우스의 한 콧구멍으로 천천히 전달한다. 마지막 papain 행정 다음 날, 10 층 건강한 자원 봉사자로부터 인간의 말초 혈액 아래 Ficoll 배지의 층 10 밀리리터는 원심 분리에 의한 밀도 그라데이션 분리를 위해 PBS에서 1 대 2 비율로 미리 희석됩니다.
말초 단일핵 혈전 또는 PBMC 상 간 층을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 다음으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 양성 세포의 자기 미생물 절연을 수행한다. 비드 절연 CD4 양성 T 세포를 PBS 농도의 최소 500 마이크로리터당 7번째 T 세포에서 10배까지 최대 10배까지 재중단한다.
적절한 적색광 흥분 세포 증식 염료로 세포에 37도에서 10 분 동안 라벨을 지정하십시오. 인큐베이션이 끝나면 5권의 RPMI 배지로 라벨링 반응을 5분 동안 10%의 FBS로 보충한 다음 중간 크기의 세 개의 세차재를 검게 합니다. 인간 CD4 양성 T 세포를 파팡 노출 받는 마우스로 양용 이송하는 경우, 형광으로 표시된 T 세포를 PBS에서 밀리리터 농도당 10배에서 7번째 세포로 10배로 재일시 중단하고 100마이크로리터의 셀을 1밀리리터 주사기로 하였고, 1인자 동물당 30게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기에 적재한 다음, 한 주사기에서 부터 세포의 전체 부피를 꼬리 정맥 에 추가적으로 주입하여 테인을 추가적으로 치료한 동물에 대한 테인을 유지한다. 세포 전달 후 5초 후 세포 현탁액의 배출을 방지합니다.
입양 세포 전달 후 3 시간, 카테터에 연결된 21 게이지 캐뉼라와 각 안락사 마우스의 오른쪽 심실을 펑크하고 왼쪽 심실에 절개를합니다. 얼음차가운 PBS 20밀리리터로 폐를 천천히 견딜 수 있으며, 5밀리미터 EDTA로 보충한 다음 얼음냉이 4%의 파라포름알데히드 2밀리리터가 그 뒤를 따릅니다. 모든 고정제가 조직을 통해 플러시되었을 때, 타액샘을 제거하고 흉골 하이드 근육을 잘라 서 집게가 기관 아래에 미끄러져 공기관 조직을 노출할 수 있도록 한다.
바늘을 무딘 30 게이지 카테터로 교체하기 전에 30 게이지 바늘로 노출된 기관체의 초기 천자를 수행하여 조직에 대한 추가 손상을 방지합니다. 바늘 홀더를 사용하여 삽입 된 카테터와 기관 사이의 접합을 밀봉하고 폐가 완전히 전개 될 때까지 약 섭씨 0.75 %의 아가로즈로 기도를 조심스럽게 채웁니다. 카테터와 기관 사이의 단단한 접합은 폐를 생리적 크기로 확장하고 이미징을위한 조직 아키텍처를 유지하는 데 중요합니다.
아가로즈가 완전히 굳어지면 카테터를 제거하고 폐를 4%의 파라포름데디로 채워진 어둡고 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮겨 넣습니다. 다음으로, 분당 31회전과 4°C로 연속 회전하에서 순차적인 에탄올 인큐베이션으로 조직을 탈수하여 배양당 4시간 동안 표시한다. 완전한 탈수 후에, 조직이 반투명으로 나타날 때까지 실온에서 하룻밤 잠복을 위해 에틸 신나메이트로 샘플을 옮기.
광시트 형광 현미경검사의 경우, 소량의 유기 용매 안정 접착제를 사용하여 폐를 현미경의 샘플 홀더에 고정하고 폐 엽을 똑바로 세워 홀더에 놓습니다. 샘플 홀더를 챔버에 넣고 계측기 소프트웨어의 실험에 적합한 레이저를 선택합니다. 그런 다음 광학 아래의 슬라이더를 사용하여 전체 기관 또는 특정 관심 부분을 균일하게 드러내는 숫자 조리개 시트 너비를 설정합니다.
슬라이더를 사용하여 선택한 각 레이저에 대한 레이저 전송 제어 하에 레이저 강도를 설정하고 적용을 클릭합니다. 고급 측정 설정을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 라이트 시트를 병합하여 균일하게 조명된 이미지를 만듭니다. 스캔 범위에서 측정할 Z 스택의 시작 및 끝 위치를 정의하고 단계 크기를 5 마이크로미터로 설정한 다음 자동 저장을 선택하여 파일을 자동으로 저장하고 측정을 시작하여 이미지를 캡처합니다.
모든 이미지를 획득하면 3D 이미징 분석 소프트웨어에서 능가 버튼을 활성화하고 선택한 Z 스택의 다른 모든 이미지의 개구부 및 자동 3D 재구성을 시작하기 위해 하나의 Z 스택에서 첫 번째 이미지를 로드한 다음 디스플레이 조정하에 각 채널에 대한 강도, 검은색 수준 및 대비를 조정합니다. 다른 견본에 걸쳐 폐 조직 내의 인간 세포의 축적을 비교하려면, 특정 부피로 폐 큐브를 정의하기 위하여 편집 및 자르기 3D를 선택합니다. 정의된 폐 큐브 내에서 표지된 셀을 정량화하려면 도구 모음에서 새 스팟 추가를 열고 자동 생성 건너뛰기를 클릭하고 수동으로 편집하고 640 나노미터 채널을 선택합니다.
반지름 스케일을 10.00 미크론으로 설정하고, 선택(Select)을 클릭하고 편집 할 때, 시프트는 왼쪽 마우스 버튼을 클릭하여 각 형광 셀을 개별적으로 점으로 표시합니다. 계산된 셀의 전체 수가 통계에 표시됩니다. 이미지를 캡처하려면 스냅샷 도구를 사용하거나 애니메이션 도구를 사용하여 비디오를 캡처합니다.
미생물 기반 세포 농축 및 후속 형광 라벨링은 전형적으로 CD4 양성 순도가 적어도 95%의 양순도및 유동 세포측정에 의해 결정된 바와 같이 이들 세포의 성공적인 라벨링을 초래한다. 에틸 신나마트 계 조직 클리어링은 성공적인 굴절률 매칭을 나타내는 높은 수준의 기관 투명성을 달성합니다. 폐 조직의 자동 형광 신호는 평균 강도 투영 또는 표면 모드로 표시될 수 있는 광시트 현미경검사법에 의해 폐의 해부학 구조를 이미지화하는 유용한 도구를 제공한다.
종래의 현미경 검사법에 비해, 광시트 현미경 검사는 전체 장기 영상 및 후속 3D 재구성의 이점을 제공하여 증식 염료 표지의 식별 및 시각화를 허용하고, 또한, 파팡 노출 동물의 염증폐 조직 내선택적 축적을 위한 인간 T 세포의 선호는 인간 CD4 양성 세포로부터 더 지원된다는 사실에 의해 더 지원된다. 상이한 조건 들 사이의 인간 CD4 양성 T 세포의 폐 축적의 정량화 및 비교를 위해, 표지된 세포는 또한 입증된 바와 같이 정의된 부피의 몇몇 폐 큐브에서 계산될 수 있다. 폐 관류, 인플레이션 및 조직 정리를 포함한 신중한 조직 준비는 고해상도 광시트 현미경 이미지의 최적화된 생성에 매우 중요합니다.
이송된 인간 림프구의 성공적인 다이파이드를 추가로 확인하기 위해, 이 프로토콜은 뮤린 기관지알벨라 라베이지 내의 인간 림프구의 유동 세포정량화와 쉽게 결합될 수 있다. 생체 내의 개별 환자로부터 유래된 면역 세포를 모니터링하는 능력은 특정 질환 또는 치료에 의해 각인된 면역 세포에서 기능적 변화의 식별을 지원합니다.
