저자는 그들의 기술 도움말 및 중요 한 프랜시스 크릭 연구소 BRF 수영 팀을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품의 핵심 자금 암 연구 영국 (FC001999), 영국 의학 연구 위원회 (FC001999), 및 Wellcome 트러스트 (FC001999)에서 받는 프랜시스 크릭 연구소에 의해 지원 되었다.

1. 노출 사전 여과의 반복 시스템 센 티 넬
<ol><li>
깨끗 한 8 L 탱크 반복 시스템을 설정 합니다. 채워 그것 물은 집 수에서 오는. 2 세라믹 구슬 추가 또는 큐브 화면 (그림 1) 시스템에서 바이오-미디어의 갯 솜. 1-2 D. rerio/L (즉, 12 생선)를 추가 합니다. 시설, 예를 들어 AB.에에서 지배적인 유전 배경의 야생 유형 물고기를 사용 하 여
	<ol>
<li>6 생선을 다음과 같이 선택 합니다: 적어도 하나의 암컷과 6 개월 아래 나이, 한 여성 및 6, 18 개월, 그리고 한 여성 연령 18 개월 이상 한 남자 사이 한 남자의 한 남자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
먹이 하루에 한 번입니다. (예:, 건조 다이어트, 소금물 새우) 센 티 넬 zebrafish 시설에서 사용 하는 모든 다이어트에 노출 되는 것을 확인 하는 다이어트 다. 월요일, 수요일, 그리고 금요일, 즉,에 4 개월 동안 일주일에 세 번 변경 합니다.
	<ol>
<li>물 교환을 실시, 전송 임시 탱크에 센 티 넬 및 바이오 미디어. 센 티 넬 탱크를 완전히 비어 하 고 그것을 청소. 센 티 넬 탱크 기름 통 물 리필. 센 티 넬과 바이오 미디어를 다시 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기름 통 물에 4 개월에 대 한 센 티 넬을 노출 합니다. 2-파 (3 mL/L)의 과다 솔루션에서 침수 등 승인 된 방법으로 물고기를 안락사.</li>
	<li>
확인 하려면 죽음, opercula 운동 중단 후 10 분 동안 기다립니다.
	<ol>
<li>집게와는 수 색을 완전히 확인 된 용기에-80 ° C에 그것을 동결. 이 PCR12,15사용 될 것입니다.</li>
		<li>또는 잘라는 tailat 꼬리 peduncle, 복 벽, 닉 고 4% 포 르 말린에 설정 합니다. 주의: 장갑을 사용 하 고 증기 histopathology 캐비닛. 라벨 샘플 컨테이너.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 기름 통 면봉
<ol><li>살 균 건조 면봉을 사용 하 여 플라스틱 샤프트. 장갑을 착용 한다. 면봉 (물 표면에 기름 통 벽)을 찾아서 표면에 쉽게 액세스를 방지 하는 모든 항목을 제거 합니다. 낮은 흐름 기름 통 표면을 선택 하십시오.</li>
	<li>
외부 포장을 제거 하 여 면봉 사설을 하 고 공기를 살 균 면 팁을 노출. 면봉의 교차 오염을 안 된 표면을 만지지 돌보는 피하십시오.
	<ol>
<li>기름 통 벽 흡수 하는 물과 기름 통 물 표면 수준에서 biofilm을 5-10 cm 이상 면봉.</li>
		<li>다시 면봉을 칼 집 또는 메 마른 분리기 관으로 팁을 휴식. 라벨 샘플 및 PCR 테스트 보내거나-80 ° c.에 고정</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 탱크의 하단에 P. tomentosa 계란의 탐지
<ol><li>
현미경 검사 법에 의해 슬러지 분석
	<ol>
<li>9 60 mL 주사기 사용 하 여 발음 기름 통 또는 센 티 넬을 포함 하 여 물고기를 잡고 어떤 탱크의 바닥에 슬러지. 15 mL 튜브 샘플을 나눕니다. 그들의 나사 상판과 튜브를 닫고 튜브 라벨.</li>
		<li>포화 설탕 솔루션 준비 (특정 한 중력 = 1.27) 자력14227 g 뜨거운 물 177 mL에 입자가 굵은 설탕을 혼합 하 여.</li>
		<li>175-250 x g 스윙 양동이와 원심 분리기에서 10 분에서 15 mL 튜브 원심 튜브를 가만히 따르다 하 고 그들의 튜브에는 토사를 유지.</li>
		<li>포화 설탕 솔루션 중간 튜브를 작성. 그들의 나사 상단 튜브를 닫고 솔루션 퇴적 물을 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>원심 분리기 스윙 양동이에 튜브를 놓고 상단에 포화 설탕 해결책으로 그들을 기입 합니다. 각 튜브 위에 부드럽게 및 포화 설탕 솔루션 접촉 한 커버 유리를 설정 합니다.</li>
		<li>10 분 일부 커버 유리 수 있습니다가 하 고 거기에 따라서 원심 분리 동안 휴식에 대 한 175-250 x g에서 원심 분리기는 각 60 mL 샘플 4 튜브 있습니다. 커버 유리를 리프트 하 고 유리 슬라이드에 설정 합니다. 연필 이나 마커 펜으로 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.<ol>
<li>경우에 너무 많은 커버 유리 파손 발생, 포화 설탕 솔루션, 10 분 동안 175-250 x g에서 원심 분리기 튜브의 대부분을 작성, 포화 설탕 솔루션을 상단에 기입 다음 부드럽게 커버 유리를 설정. 30 분을 기다립니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>P. tomentosa 달걀 현미경13 (그림 2 및 비디오 1)을 찾습니다. 확대 400 X6에서 바이 폴라 플러그를 식별 합니다. 참고: 계란의 크기는 57-78 µ m 길이 27-39 µ m 직경16,17. Note 1 긍정적인 슬라이드는 긍정적인 선언 60 mL 샘플에 대 한 충분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
P. tomentosa 계란에 대 한 검역 검사 수입 동물
	<ol>
<li>탱크에서 남성과 여성의 D. rerio 를 설정 합니다. 일반적으로 수확 하 고 폰된 계란을 보존 하지만 여기 배설물 (그림 3)를 그것을 사용 하는 데 사용 하는 장치는 탱크에 추가 합니다. 참고: 예를 들어 전체 1 L 사육 탱크 (외부 탱크 및 강판 바닥 내부 탱크)은 완전히 침수 13 L 탱크, 물고기 번 식 장치 및 이동에 대 한 무료로 이용할 수에.</li>
		<li>1 주일 후 사육 장치를 제거 하 고 단계 3.1 "슬러지 분석 현미경 검사 법에 의해."에서 설명한 대로 사육 장치에서 수집 된 슬러지를 수확</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. PCR 슬러지 침전 물에
<ol><li>탱크 또는 기름 통 60 mL 주사기9 의 바닥에 슬러지를 발음 하 고 60 mL 튜브에 샘플을 전송. 튜브는 스크류 상단으로 닫고 튜브 라벨. 주사기 폐기.</li>
	<li>60 mL 튜브를 흔들어 하 고 15 mL 튜브에 15 mL를 전송. 튜브는 스크류 상단으로 닫고 튜브 라벨.</li>
	<li>175-250 x g 스윙 양동이와 원심 분리기에서 10 분에서 15 mL 튜브 원심 튜브를 가만히 따르다 하 고 튜브에는 토사를 유지.</li>
	<li>
외부 포장을 제거 하 여 면봉 사설을 하 고 공기를 살 균 면 팁을 노출. 면봉의 교차 오염을 안 된 표면을 만지지 돌보는 피하십시오.
	<ol>
<li>15 관에서 퇴적 물을 면봉 s.</li>
		<li>다시 면봉을 칼 집 또는 메 마른 분리기 관으로 팁을 휴식. 라벨 샘플,-80 ℃에서 동결 하 고 PCR 테스트 보낼. 참고: 45 mL 60 mL 튜브에 남아 있습니다. 이 수 보관 P. tomentosa 계란의 검출에 대 한 슬러지 분석 현미경 검사 법에 의해 단계 3.1 예: PCR 결과 확인 하려면에 설명 된 대로. 슬러지에 PCR 심사 단계 3.2 다음 가져온된 동물에 대 한 재판을 받을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schroeder, P., Mocho, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+veterinary+perspective+on+laboratory+zebrafish+welfare.">A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare.</a> Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).</li><li>Mason, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+Mitigate+a+Mycobacterium+marinum+Outbreak+in+a+Zebrafish+Research+Facility.">Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility.</a> Zebrafish. 13, 77-87 (2016).</li><li>Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+genetic+characterization+of+Mycobacterium+chelonae+in+laboratory+zebrafish+Danio+rerio.">Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio.</a> Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).</li><li>Murray, K. N., Peterson, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+in+practice.+P.+tomentosa+infection+in+zebrafish.">Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish.</a> J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).</li><li>Foreyt, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Veterinary Parasitology Reference Manual. , (2001).</li><li>Whipps, C. 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T., Whipps, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Antibiotics+against+Mycobacterium+Species+Commonly+Found+in+Laboratory+Zebrafish.">Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish.</a> Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).</li><li>Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+treatment+of+zebrafish+mycobacteriosis:+tolerance+and+efficacy+of+treatments+with+tigecycline+and+clarithromycin.">Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin.</a> J Fish Dis. , (2017).</li><li>Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. 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저자는 공개 없다.

중요 한 단계, 기술의 한계 및 문제 해결:
나이, 성별, 스트레인, 그리고 센 티 넬의 노출의 길이 표준화 되지. 이것은 표 1에 표시 됩니다. 6 개월, 세 물고기의 아래 물고기의 아주 작은 심사가입니다. 일부 병원 체는 이전 인구10,18,,1920에서 더 유행 되는 어린 물고기에 영향을 주는 일부 병원 체를 있을 수 있습니다. 마찬가지로, 성별은21일부 병원 체 대 한 성별 바이어스는 일부 보고서에도 불구 하 고 일부 센 티 넬 그룹의 선택에 고려 되지 않습니다. 긴장의 모니터링 하는 특정 병원 체에 따라 만들 수 있지만 제안 된 기술은 이러한 문제를 해결 하려고 합니다. 예를 들어 너와 진 균 종12,22의 탐지와 도움이 수도 있지만 센 티 넬 저수지 또는 디스플레이 임상 증상 역한 다음 것을 위험이 있다. 노출의 길이 관한 Zebrafish 국제 자료 센터10 의 접근 부족 오염 시간을 놓칠 수 있는 병원 체를 검출 하기 위하여 가능성이 높아집니다. 장기간된 노출에 대 한 필요는 센 티 넬은 쉽게 사용할 수 없습니다 의미 합니다. 환경 샘플의 추가는 일부 유연성과 심사 이벤트의 곱셈 수 있습니다. 예를 들어 샘플링 장소 각 심사 방법 사이 4 개월 간격으로 모든 다른 달 걸릴 수 있습니다. 이 새로 도입된 된 병원 체를 발견 하기 전에 시간의 경과 줄일 수 있습니다.
환경 심사 기법 환경에서 병원 균의 검출에 의존합니다. 병원 균은 물고기에 의해 흘리 고 따라서 시스템 물에 희석. 물 여과23 에 의해 병원 균의 가능성을 탐험 하지 했다. 우리가 설명 하는 방법 병원 체 물고기와 오염 감지를 허용 임계값에 도달 하는 biofilm에서 증식을 충분 한 시간이 주어진 경우만 효과가 있습니다. 기술의이 제한 샘플링 사이트의 중요 한 선택에 의해 극소화 된다: 탱크에 슬러지 기름 통 슬러지 보다 샘플링 되 고 물과 biofilm 기름 통 보다는 탱크 또는 후 여과 표면에서 샘플링 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 같은 시스템에서 모든 샘플 동일한 결과 줄 가능성이 있다. P. tomentosa 에 대 한 긍정적인 결과 다른 분석 결과 (histopathology, PCR, 또는 슬러지 분석)를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 문화 또는 다른 진단 실험실 mycobacterial PCR 긍정적인 결과 확인할 수 있습니다. 그러나, 건강 상태를 설정할 때 추가 샘플은 것이 좋습니다 모든 환경 심사 기법에서 부정적인 결과 확인 하.
기존/대체 방법에 관하여 기술의 중요성:
진 균 종 환경에서 일반적 이며 기름 통에서 그들의 존재는 그들의 pathogenicity12예측 하지 않습니다. Mocho9 사망률을 모니터링 하는 것이 키 건강 문제의 발달을 조사 하는 것을 보여주었다. 동물 예제를 사용 하 여 어떤 수의 조사에 필수적인 남아 있습니다. 시설에서 모든 만연한 병원 균의 검출을 의미 상태 모니터링 하 고이 환경 심사 기법의 단독 사용으로 얻을 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 진단 도구의 감도의 부족 수 있습니다 지연 또는 건강 상태에 대 한 정확한 설명. 센 티 넬을 사용 하 여 인구에서 널리 미생물을 검출 하는 데 필요한 물고기의 수를 감소, 하는 동안 감도의 부족 환경 심사5,23를 포함 하 여 방법의 조합을 사용 하 여 무게를 추가 한다. 실제로 특정 병원 체 자유로운 상태는 일반적으로 정의 시설에 한 종족의 부재로 같은 환경 및 동물 샘플 부정적인24,25를 테스트 해야 합니다.
기름 통 면봉 결과 진 균 종 식별 물고기 샘플 허위 부정적인 건강 상태로 이어질 수 있습니다에 의존 하는 보여줍니다. 6 테스트 mycobacterial 종으로 병원 성 설명 또는 달걀 표면 소독 염소26 검역으로 정기적으로 수행 zebrafish15 에 일부 병원 성 잠재력 것 하지 제거. 따라서, 거짓 부정 수입 라인 공동 작업자에 대 한 몇 가지 결과 있을 수 있습니다. 예를 들어 생선 샘플에 PCR에 의해 M. fortuitum 놓친 하지만 기름 통 면봉 PCR의 절반 이상이 감지. 이러한 mycobacteria는 다른 사람 및 물 시스템27에서 성장 하는 능력 보다 염소에 더 강한 고려, 그것은 비 오염 수입 시설에 대 한 위험. 라인의 수입을 허용 하려면 관리자는 신뢰 하 고 그들의 수출 시설의 건강 보고서를 비교할 필요 합니다. 28 ICLAS 성능 평가 프로그램 설치류에 해당 프로세스에 열쇠 이다. RESAMA 네트워크는 프랑스 D. rerio11 M. gordonae 와 M. mucogenicum 의 탐지를 보고합니다. 이러한 Mycobacteria 우리가 사용 하는 상용 실험실의 패널에 제안 하지는. 그것은 ICLAS 프로그램을 확장 하 고 병원 성 종29목록으로 진단 분석 실험 조화에 유용할 것 이다.
A. hydrophila 하더라도 염소30 에 그것의 감수 성을 제거 가능성이 더 일상적인 달걀 표면 소독 중 동물, 가져올 때 소개 될 잠재력을 가진 병원 체 이기도 합니다. 기름 통, 면봉, 및 슬러지 결과 환경 심사가 병원이 체를 검출 하는 데 사용 될 수 표시. 진 균 종 같은 다른 박테리아는 슬러지에 PCR23에 의해 발견 되었습니다. 샘플의이 유형은 이다 특히 관련 창 고 병원 균의 검출 수 있기 때문. 예를 들어 다른 새로운 응용 프로그램 P. tomentosa격리에서 가져온된 물고기 화면을 슬러지 분석 이다. 기생충은 동물의 건강13 및 neoplasia 모델16에 대 한 위협. 또한, 일상적인 zebrafish 달걀 표면 소독에 사용 되는 염소 농도 효율적인31되지 않습니다. 따라서, 가져온된 동물 일주일 회전율 및 어떤 물고기 안락사 없이 화면 수 매우 매력적인 것 같습니다. 이 기술은 수입 심사 함으로써 격리 및 생물 규칙을 좌우할 수 있다. 의사 결정 과정은 다음 수출 시설에서 만연한 병원 균, 가져온된 물고기와 가져오기 시설10의 건강 상태를 손상의 위험에서 샘플에 검출 된 병원 체에 따라 설계 되었습니다.
미래의 응용 프로그램 또는 이러한 기법을 습득 후 방향:
일상적인 격리 치료 옵션을 선택한 경우, 같은 약32,33,34,,3536 의 효능 사육 장치 슬러지 분석 평가 될 수 있다. 더 일반적으로, 환경 심사 박테리아와 기생충에 대 한 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 박멸, 물고기 소 생활권에 포함 한. 환경 심사의 또 다른 틈새 응용 프로그램 라이브에서 병원 체 인구 모니터링 하37,38피드입니다. 비록 이러한 기술의 주요 응용 프로그램 상태 모니터링 zebrafish 시설에 대 한 진단 도구 상자에 귀중 한 추가 이다. 더 정확 하 게, 비용 및 시간 덕분에 건강 상태, 기름 통 면봉 및 슬러지 분석의 효율적인 정의 센 티 넬 감시 및 일상적인 격리 연습을 보완. 사실, 이러한 기술의 미래 수생 실험실 건강 보고서의 일상적인 부분이 될 것입니다.

보호 연구 및 동물 복지1,2, 동물 시설 내에서 병원 균의 존재를 모니터링 합니다. Zebrafish, 상태 모니터링3,,45,6,7,,89,10,11의 경우 종종 동물 분석 사후 histopathology, 세균 학 문화, 또는 분자 방법에 의존. 식민지 동물만을 테스트 하는 것은 물고기와 낮은 보급의 병원 체를 검출 하는 데 필요한 것 이라고 관련된 비용의 수 권장된 방법이 아닙니다. 따라서, 선호 하는 방법 오염 물질의 높은 부하에 동물의 작은 그룹을 노출 하는 것입니다. 이 물고기는 사전 여과 센 티 넬 라고 합니다. 이 노출 개월 지속 되며 동물 보호자의 작업 또는 목적 엔지니어링 솔루션 일부에서 증가 포함 한다. 또 다른 도전은 격리 비옥한 동물은 살아 보관 하 고이 시체에 일상적인 분석와 호환 되지 않습니다에서 가져온 심사 이다.
여기 수생 시스템의 환경을 검사 하 여 특정 zebrafish 병원 체 (A. hydrophila, 진 균 종, 그리고 P. tomentosa)를 검색 하는 몇 가지 방법을 설명 합니다. 목표는 매출, 비용, 및 탐지의 감도 최적화 하 고 상태 모니터링에 사용 되는 물고기의 수를 줄이기 위해. 이러한 메서드는 동물의 사용에 대안 그리고 일부 기술 심사 수입 검역에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어 Mocho9 (센 티 넬 포함), 제 브라 보다 기름 통 면봉에 PCR을 수행 하 여 더 많은 병원 성 mycobacterial 종을 식별할 수 있었다 그리고이 적은 샘플으로 얻은. 그 같은 연구, P. tomentosa 계란 더 감도 부 그리고 현미경 검사 법을 사용 하 여 탱크 슬러지를 심사 하 여 발견 했다 PCR 및 histopathology 물고기를 테스트 하는 대신.
표 1 센 티 넬 프로그램3,,45,6,7,8,9,10의 다양 한 특성을 요약 한 zebrafish 시설 수로 사용. 후 여과 센 티 넬 사전 여과 센 티 넬 수신 물 일단 그것 먼저 식민지 물고기 탱크를 통해 유포 하고있다 반면 물 식민지 물고기와 같은 방식으로 나타납니다. 예를 들어 사전 여과 센 티 넬 기름 통 물 지속적으로 수신 하 여 반복 시스템에에 설정할 수 있습니다. 한 방에 많은 독립적인 시스템 있을 때이 옵션을 않을 수 있습니다. 이 경우에, 사전 여과 센 티 넬의 한 탱크 전체 룸 화면을 사용할 수 있습니다. 센 티 넬 반복 시스템, 정적 탱크에 있고 그들의 물만 사전 여과 물 즉, 방에 있는 모든 시스템에서 기름 통 물을 사용 하 여 정기적으로 변경 됩니다. 이 기술은 환경 심사의 효능 비교에 대 한 기준으로 아래 설명 되어 있습니다. 제안 된 설정은 pH 또는 질소 오염 감소 같은 물 품질 문제를 제어 하도록 설계 되었습니다.
세균 환경 심사의 개념 박테리아는 감지는 탱크의 바닥에 슬러지 또는 물 표면에 기름 통 벽에 있는 같은 biofilm에서 가설에 의존 합니다. 기름 통이 보인다 이상적인 샘플링 포인트를 recirculating 양식 체계 (물, 배설물, 피드, 그리고 다른 유기 물질) 폐기물 수집 이후 모든 탱크 사전 여과에서. 표면에는 기름 통은 종종 쉽게 연결할 수는 보라고 하는 것은 빨리, 그리고 aseptically (예: 장갑)에서 샘플의 교차 오염을 방지 하려면 수행할 수 있습니다. 개념은 zebrafish 시스템9,12에서 만연한 병원 성 진 균 종 식별 하는 데 사용 됩니다. 기술은 아래 설명 하 고 우리는 또한 zebrafish 기름 통 표면 면봉에 슬러지 A. hydrophila 의 탐지를 보고.
기생충 알에 대 한 환경 심사 기반 탐지 머 레이 외. 13 와 부양 기술은 정기적으로 기생충학 및 배설물14기생충 계란의 현미경 검사에 사용 됩니다. Mocho9 샘플링 과정에 대안을 제안 하 고 기술을 다른 종의 물고기 소 생활권을 검출 하기 위하여 사용 될 수를 보였다. 감염 된 D. rerio 통과 P. tomentosa 그들의 배설물과 함께 계란 그리고 기생충 계란 슬러지에는 탱크의 바닥에 남아 있다. 그들은 있을 수 있습니다 수집 물 보다 큰 되 고 그들의 밀도 때문. 계란의 밀도 너무 환경 샘플을 처리 하는 데 사용 됩니다. 원심 분리와 함께 첫 번째 부양 무거운 문제에서 물과 빛의 파편을 분리합니다. 두 번째 원심 튜브의 표면에 등장 하는 기생충 알 수 있도록 ( P. tomentosa 계란의 밀도 보다 큰 밀도)와 포화 설탕 솔루션에 의존 합니다.
심사는 biofilm에 박테리아와 탱크의 하단에서 P. tomentosa 슬러지 샘플 앙금 얻은 첫 번째 원심 분리 후에 이러한 모든 병원이 균에 대 한 PCR을 수행 하 여 결합할 수 있습니다. 이 샘플링 시간을 최적화합니다. 방법은 아래 설명 되어 있습니다. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 이러한 격리 컨텍스트에서 제안 합니다. 가져온된 성인 zebrafish 유지 될 필요가 있는 화면, 사육 장치 격리 탱크에 삽입 됩니다. 1 주 후 배설물 및 다른 폐기물 사육 장치에서 수집 된 있으며 현미경 또는 PCR 검사를 실시. 기술은 아래 설명 그리고 P. tomentosa 계란이이 맥락에서 현미경에 의해 발견 되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="683">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Aqua-Sed 250 mL</td>
			<td style="width:140px;">Vetark</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:191px;">2-phenoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tubed Sterile Dryswab Tip</td>
			<td style="width:140px;">mwe</td>
			<td style="width:124px;">MW100</td>
			<td>Sump surface</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric</td>
			<td style="width:140px;">Becton 
			Dickinson</td>
			<td style="width:124px;">300866</td>
			<td style="width:191px;">They are actually 
			graduated to 60 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Centrifuge tube 15 mL Corning</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:229px;">Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing&#8211;Out Rotor (unsealed)</td>
			<td style="width:140px;">Sanyo</td>
			<td style="width:124px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Cover Glass 22 mm x22 mm</td>
			<td style="width:140px;">Menzel-Glaser</td>
			<td style="width:124px;">MNJ-350-020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:229px;">Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap</td>
			<td style="width:140px;">Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">F155CA</td>
			<td>Swab sediment from sludge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">430921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">In-Tank Spawning Tray Set&#160;</td>
			<td style="width:140px;">MBK Installations Ltd</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

environmental screening of aeromonas hydrophila, mycobacterium spp., and pseudocapillaria tomentosa in zebrafish systems

건강 모니터링 시스템 개발 및 Danio rerio Aeromonas hydrophila, 진 균 종, Pseudocapillaria tomentosa 등의 병원 균을가지고 있기 때문에 제 브라 연구 시설에서 사용 동물 복지 및 연구 손상. 물고기는 일반적으로 분석 된 사후 미생물을 검출 하기 위하여. 센 티 넬을 사용 하 여 감시의 감도 향상 하 고 샘플을 동물의 수를 줄이기 위해 제안 된 방법입니다. 반복 시스템 사전 여과 센 티 넬 탱크의 설정을 설명 합니다. 기술은 나이, 성별, 그리고 긴장의 주의 깊은 선택에 의해 물고기 인구를 대표 하 고 수질오염을 방지 하기 위해 개발 된다. 동물의 최소 수를 사용, 기술 환경에도 자세히 나와 있습니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 표면 기름 통 면봉에는 크게 약간 우세 하 고 병원 성 mycobacterial 종 fortuitum 진 균, 진 균 haemophilum, 등의 검출 향상 사용 진 균 chelonae. 또 다른 환경 방법은 지주 탱크 또는 기름 통 P. tomentosa 계란에 대 한 보고의 바닥에 슬러지 처리 이루어져 있다. 이것은 사육 장치 가져온된 동물의 지주 탱크에 빠져들은 격리에 적용할 수 있는 저렴 하 고 빠른 기술 이다. 마지막으로, PCR 슬러지 샘플에 적용 되 고 A. hydrophila 기름 통의 하단 표면에서 발견. 일반적으로, 이러한 특정 병원 체에 적용 되는 이러한 환경 심사 기술을 사전 여과 센 티 넬의 테스트에 비해 증가 감도 끌고있다.

생선 샘플에 비해 널리 진 균 종 식별 하 기름 통 면봉의 혜택은 그림 4에 결과 의해 지원 됩니다. 115, 물고기의 테스트 M. chelonae 와 M. haemophilum 했다 발견 5%와 3%의 샘플, 각각. 아니 다른 병원 성 mycobacterial 종 확인 되었다. 동일한 시스템에서 49 기름 통 면봉 5 mycobacterial의 존재를 공개 했다. 확율 비율은 M. chelonae 그리고 M. fortuitum 감지 더 자주 PCR에 의해 물고기 샘플에서 보다 표면 기름 통 면봉에 가설으로 계산 됩니다. 이것은 통계적으로 중요 한 11의 각각 확율 비율 (95 %CI: 4 ~ 29; p < 0.0001)과 306 (95 %CI: 18 5208; p = 0.0001). 결과 표시 표면 기름 통 면봉 기술 진 균 종에 대 한 화면 zebrafish 시설에 센 티 넬의 유일한 사용에 중요 한 대안 이다 환경 샘플 또한 사용 되었다 A. hydrophila화면에. 이 박테리아는 물고기, 슬러지, 그리고 표면 샘플 (그림 4)에서 발견 했다. 이 또한 생선 소 생활권에 제안 된 기술의 능력을 지원 합니다.
P. tomentosa 계란을 검출 하기 위하여 슬러지 분석에 관한 Mocho9 계란 같은 시스템에서 분석 된 슬러지의 93%에서 발견 된 반면 PCR 및 histopathology 생선 샘플의 27%에서 기생충을 감지. 여기, 기술은 검역 심사 재현을 전했다. 이러한 맥락에서 가져온된 동물 샘플링 수 없습니다, 고 생물 관리와 적시에 자신의 건강 상태를 평가 하는 데 도움이. P. tomentosa 긍정적인 시설에서 알 수 없는 건강 상태 물고기 8 탱크 사육 장치를 설정 했다: 최대 16 물고기/13 L 탱크, 7 유전자 변형 및 1 강포한 유형 선, 성별, 혼합의 세 4-24 개월. 슬러지는 1 주일 후 장치에서 수확 되었고 현미경에 의해 분석. P. tomentosa 계란 7 (88%) 샘플에서 볼 수 있었다. 마지막으로, 기생충의 PCR 탐지 기름 통 면봉 및 슬러지 퇴적 물에 trialed 이었다. 4 6 슬러지 샘플 PCR 긍정적인 되었고 모든 결과 표면 면봉에 대 한 부정 했다. 슬러지 심사는 탱크의 바닥에가에 계란의 능력에 의존 하는 때문에, 이것은 놀라운 일이 아니다. 이 슬러지 분석 기법 D. rerio aquaria P. tomentosa 감염에 대 한 고 방법이 가져온된 동물의 심사에 대 한 적용할 수 있습니다 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg"> 그림 1: 반복 시스템 사전 여과 센 티 넬 탱크. 8 L 탱크 물과 화면에는 시스템의 집 수에서 바이오 미디어 채워집니다. 2 개의 백색 세라믹 바이오 미디어 비즈 (사진) 중간 탱크의 바닥에 앉는 다. 12 물고기 그들의 스트레인, 연령과 성별, 선택 하 고 센 티 넬 탱크에 추가 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg"> 그림 2: 현미경 검사 법에 의해 슬러지 분석 하는 동안 검색 P. tomentosa 계란. 확대 사용 400 X 했다입니다. 화살표는 바이 폴라 플러그를 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg"> 그림 3: 분석에 대 한 슬러지 수집 수조 지주에에서 빠져들 사육 장치. 이 탱크는 그림; 목적 벤치에 설정 되어 그렇지 않으면 반복 시스템에서 설정 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg"> 그림 4: 물고기,의 진 균 종, A. hydrophila, P. tomentosa PCR에 의해 식별의 비율 표면 기름 통 면봉, 및 기름 통 슬러지. 백분율 테스트 샘플의 수로 각 병원 체 종에 대 한 긍정적인 결과의 수를 나누어 얻을 수 있습니다. 긍정적인 결과의 백분율 물고기, 표면, 또는 슬러지, 샘플 형식에 의해 주어진 이며 박테리아의 이름 표시. 115 물고기와 49 표면 기름 통 면봉의 진 균 종 식별에 대 한 PCR에 의해 시험 되었다 이 연구의 확장 이므로 데이터 Mocho의9 결과 함께 컴파일됩니다. 물고기는 주로 사전 여과 센 티 넬 프로토콜 섹션 1에 의하여. 드물게, 센 티 넬 사용할 수 있었던, 탈북자와 오래 된 식민지 물고기 (> 18 개월) 샘플링 된. 진 균 종에 대 한 모든 테스트 시스템은 물고기와 기름 통 면봉에 시험 되었다. 확율 비율은 M. chelonae 그리고 M. fortuitum 감지 더 자주 PCR에 의해 물고기 샘플에서 보다 표면 기름 통 면봉에 가설으로 계산 됩니다. 이것은 통계적으로 중요 한 11의 각각 확율 비율 (95 %CI: 4 ~ 29; p < 0.0001)과 306 (95 %CI: 18 5208; p = 0.0001). 진 균 marinum PCR 모든 샘플에 대 한 부정적 이었고 따라서 이러한 시설에서 결 석으로 간주 되며 분석에 포함 되지 않습니다. 12, 14 표면 기름 통 면봉, 생선과 6 기름 통 슬러지는 A. hydrophila의 존재에 대 한 PCR에 의해 시험 되었다. 6 집 수 및 슬러지 표면에 P. tomentosa 의 존재에 대 한 테스트 되었습니다. PCR = 연쇄 반응. CI = 신뢰 구간. * 및 * * 나타내는 통계적 의미; 다른 비교는 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg"> 비디오 1:의 달걀에 대 한 검색 P. tomentosa 현미경. 3.1 단계에서 설명한 대로 슬라이드 슬러지 분석에서 얻은 것입니다. P. tomentosa의 달걀을 감지 하는 필드 검색 됩니다. 구조 인식 되 면 그것은 확대 된 더 높은 해상도에서 id를 확인 하. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>저자</td>
			<td>노출의 시작 나이</td>
			<td>노출의 길이</td>
			<td>샘플링 시대</td>
			<td>사전 또는 사후 여과</td>
			<td>성별</td>
			<td>Strain(s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>바튼 외. 3
</td>
			<td>4 개월</td>
			<td>6 개월</td>
			<td>10 개월</td>
			<td>사전 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>보 그 스 외. 4
</td>
			<td>6 개월</td>
			<td>6 개월</td>
			<td>12 개월</td>
			<td>사전 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB 야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collymore 외. 5
</td>
			<td>가능한 한 한 어린</td>
			<td>3 개월</td>
			<td>< 6 개월</td>
			<td>사전 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>가 슬 러 외. 6
</td>
			<td>4 개월</td>
			<td>4 개월</td>
			<td>8 개월</td>
			<td>사전 및 사후 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB 야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>리 우 외. 7
</td>
			<td>3 개월</td>
			<td>1-6 개월</td>
			<td>4-9 개월</td>
			<td>사전 및 사후 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>마틴 외. 8
</td>
			<td>3 개월</td>
			<td>3 개월</td>
			<td>6 개월</td>
			<td>사전 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mocho9
</td>
			<td>< 6 개월, 6-12 개월 > 18 개월</td>
			<td>4 개월</td>
			<td>7-24 개월</td>
			<td>사전 여과</td>
			<td>1 여성 및 1 남자의 각 연령 그룹</td>
			<td>AB 야생 타입</td>
		</tr>
<tr>
<td>머 레이 외. 10
</td>
			<td>3-4 개월</td>
			<td>3 개월, 6 개월, 1 년</td>
			<td>7, 10, 및 16 개월</td>
			<td>사전 및 사후 여과</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB 야생 타입</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: zebrafish 시설에서 센 티 넬 설정의 비교. 센 티 넬 물고기는 그들의 나이, 성별, 또는 긴장에 따라 선택할 수 있습니다. 그들은 정의 된 기간에 대 한 노출 되 고 그들은 사전 또는 사후 여과 시스템 물 받을. 데이터는 Zebrafish 저널3,,45,6,7,8,9, 의 건강에 특별 한 문제를 2016에서 컴파일됩니다 10.

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Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

이 프로토콜에는 기름 통 면봉의 사용 및 Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 와 같은 병원 체를 검출 하기 위하여 센 티 넬의 단독 사용에 비해 증가 탐지에 이르게 zebrafish 시스템의 슬러지 분석 설명 합니다. Pseudocapillaria tomentosa. 검역에 P. tomentosa 계란을 모니터링 하는 시스템도 제안 했다.

Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 Pseudocapillaria tomentosa Zebrafish 시스템에서의 환경 심사

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

environmental-screening-aeromonas-hydrophila-mycobacterium-spp

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

9.7K 조회수.  The Francis Crick Institute. 이 프로토콜에는 기름 통 면봉의 사용 및 Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 와 같은 병원 체를 검출 하기 위하여 센 티 넬의 단독 사용에 비해 증가 탐지에 이르게 zebrafish 시스템의 슬러지 분석 설명 합니다. Pseudocapillaria tomentosa. 검역에 P. tomentosa 계란을 모니터링 하는 시스템도 제안 했다.

비디오: Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

진단 도구를 개발하기 위해 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS)를 사용

연구

생물학

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

레이저 Uncagable 플루오레신 Dextran과 Zebrafish 세포의 리니지 라벨

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em&gt; 변형체</em&gt; Rhoptry 단백질

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an incredible diversity of microbial life and can be a good source of these bioremediative fungi. This work aims to search for soil fungi with bioremediation potential by using different screening tests. Mineral culture media supplemented with recalcitrant substances as the sole carbon source were used as growth tests. First, soil dilutions were plated on Petri dishes with mineral medium amended with humic acids or lignocellulose. The growing fungal colonies were isolated and tested on different substrates, such as complex mixtures of hydrocarbons (petrolatum and used motor oil) and powders of different plastic polymers (PET, PP, PS, PUR, PVC). Qualitative enzymatic tests were associated with the growth tests to investigate the production of esterases, laccases, peroxidases, and proteases. These enzymes are involved in the main degradation processes of recalcitrant material, and their constitutive secretion by the examined fungal strains could have the potential to be exploited for bioremediation. More than 100 strains were isolated and tested, and several isolates with good bioremediation potential were found. In conclusion, the described screening tests are an easy and low-cost method to identify fungal strains with bioremediation potential from the soil. In addition, it is possible to tailor the screening tests for different pollutants, according to requirements, by adding other recalcitrant substances to minimal culture media.

Here, we present a protocol for screening soil biodiversity to look for fungal strains involved in the degradation of recalcitrant materials. First, fungal strains able to grow on humic acids or lignocellulose are isolated. Their activity is then tested both in enzymatic assays and on pollutants such as hydrocarbons and plastics.