저자는 장비의 배아 개발 및 사용 속도에 조언을 microinjection 교육, 고모 헨리 박사 캐롤 김 연구실 감사드립니다, 그리고 fli1 기여에 대한 나단 로손과 같습니다 EGFP 생선. 우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 윌러 연구소와 션의 성벽의 회원 감사드립니다. 우리는 또한이 프로젝트에 대한 기술적 조언 생선 관심과 조언을 마크 Nilan, 그리고 라이언 Phennicie와 크리스틴 가보 감사드립니다. 이 작품은 K. 형제, MAFES 해치 기금 E08913-08, 그리고 R. 휠러에 대한 NIH NCRR 보너스 P20RR016463에 MAFES 연구 assistantship에 의해 재정 지원되었다.

모든 zebrafish 관리 프로토콜 및 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 A2009-11-01하에 수행되었다. 1. Morpholino와 애벌레 사출 요리 실험 기간 : * (10-15분) 어려움의 정도 : * <ol><li> 달걀 주사 들어, 멸균 물, 전자렌지에 2 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 그것의 반을 가득 때까지 솔루션은 별도의 깊은 페트리 접시 (피셔 과학)에 일부를 부어 냉각되면. 얼음과 접시 레벨 확인에 좋았어. </li><li> 접시가 냉각되면 2퍼센트 아가로 오스의 15 ML 상위 레이어를 붓는다. 스프레이 용기에서 멸균 물로 플라스틱 금형 (적응형 과학 도구)를 홈 붙이 달걀 주사 스프레이. 뜨거운 아가로 오스로 금형 그루브 측면을 조심스럽게 내려 놓습니다. 아가로 오스가 냉각되면, 아가의 몰드를 떼어 놓다하기 (VWR 과학) 금속 평평한 주걱을 사용하여상승했다. 천천히 아가로 오스의 격자를 제거합니다. 바꿈 배아 주입 Parafilm의 요리 (VWR 과학)과 매장은 4 ° C.에 뒤집혀 </li><li> 물고기 애벌레 주사 들어 설명한대로 2 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 표준 크기의 페트리 접시 (VWR 과학)에 솔루션을 붓고하고 굳은 때까지 따로 설정합니다. Parafilm 및 저장소에 랩 애벌레 사출 요리는 4 ° C.에 뒤집혀 </li></ol> 2. 곰팡이 문화 준비 실험 기간 : ** (30 분) 어려움의 정도 : ** <ol><li> 10g / 리터 효모 추출물, 20 G / 리터 펩톤, 20 G / 리터 덱스 트로 오스, 그리고 그리고 압력솥에 20g / 리터 한천 : 추출 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 (YPD) 한천 플레이트 효모를 준비합니다. YPD 액체 121 10 G / 리터 효모 추출물, 20 G / 리터 펩톤, 20 G / 리터 덱스 트로 오스와 압력솥 20~30분 ° C. 준비를 위해 </li><li> 생선 감염 이전 이틀 냉동에서 탄력 플레이트를 준비YPD 한천쪽으로 칸디다 albicans 문화의 주식은 하나의 식민지를 구하십시오. </li><li> 37 ° C 하룻밤 사이에 알을 품다. </li><li> 16 X 150mm 문화 튜브 (VWR 과학)에 5 ML YPD의 국물을 넣고. </li><li> 생선 감염 전에 하루 목조 은못 (VWR 과학)와 YPD 한천에 한 작은 식민지를 선택하십시오. YPD 액체에서 다시 정지 서식지 주변 문화 관과 소용돌이에 막대기를 넣고. </li><li> 14 인치 시험관 휠 (뉴 브 런 즈윅 과학)가 장착된 TC-7 조직 문화 롤러 드럼에 37 ° C에서 하룻밤 성장. </li><li> 다음 날, 1.7 ML 튜브 (Axygen)에서 1 분 14000x의 g에서 문화의 한 ML을 돌리다. 표면에 뜨는를 제거하고 vortexing (VWR 과학)에 의해 잔류 액체에 펠렛을 resuspend. </li><li> 식염수를 (VWR 과학) 버퍼 한 ML 1X 인산을 추가하고 이전에 설명된대로 스핀. </li><li> PBS 세척을 3 번씩 반복합니다. </li><li> 1X PBS에 1:100 희석합니다 (990 μL 1X P로 형편없는 C. albicans 10 μL 희석학사). </li><li> Hemocytometer (VWR 과학) 믿는 수 밖에. </li><li> 10 7 셀 / ML로 희석. </li></ol> 3. Zebrafish 감염 실험 기간 : **** (1-3시간) 어려움의 정도 : **** <ol><li> 섹션 5와 달걀 물 저장소, 멸균 탈이온수 60 MG / L 인스턴트 바다 소금 (피셔 과학)에 따라 배아를 수집합니다. </li><li> 이러한 올림푸스 SZ61 (올림푸스), 감염 당일 dechorionate 배아와 같은 해부 현미경을 사용. 칩 한 봉지를 열고, 또는 부드럽게 chorion로 닫힌 위치에 핀셋을 찌르지 후 천천히 열어처럼 chorion 27 분열 시키려고 뒤몽 Dumoxel 핀셋 (VWR 과학)를 사용합니다. 물고기 chorion을 들락 거 렸고 바로 쏴버릴테다. </li><li> 뚜껑 접시의 중앙에 물고기 이동에있는 소용돌이 추가 깊은 페트리 접시를. 접시의 뚜껑으로 물고기를 전송합니다. 달걀 물을 제거하고새로운 미디어로 바꿉니다. 미디어로 물고기를 추가합니다. </li><li> 28시 인큐베이터에서 따뜻한 애벌레 사출 요리 ° C. tricaine 메탄 산염 (서양 화학 주식 회사) 200 μg / 생선 anesthetizing위한 ML에서 희석을 준비합니다. </li><li> 감염 (20-50 생선)에 애벌레 중 원하는 번호를 세어보세요. tricaine의 메탄 산염 용액에 생선을 넣고 그들이 계속 움직이게 때까지 1~2분을 기다립니다. </li><li> MPPI-3 분사 장치 (응용 과학 인 스트 루먼트)를 켭니다. 압력 스위치는 &quot;펄스&quot;에 있고 &quot;펄스 기간은&quot;backpressure 단위 3 PSI와 9 설정되어 있는지 확인하십시오. 사출 장치의 압력은 30 PSI를 읽고 때까지 질소 탱크에 밸브를 엽니다. </li><li> 1x10 7 셀 / ML의 농도에서 vortexed 칸디다 albicans의 5 μL로 뽑았 micropipette 28로드합니다. micropipette 홀더 (응용 과학 인 스트 루먼트)의 micropipette를 놓습니다. 물로 빈 여분 깊은 페트리 접시를 채우십시오. 끝까지 micropipette를 이동 전뷰 사이의 막 뽑아 피펫의 끝부분에서 3mm에 대해 바늘을 고정하기 위해 현미경 및 사용 뒤몽 Dumoxel 핀셋 (VWR 과학)을 해부를 통해 수면을 건드렸다. </li><li> 바늘이 잘린되었는지 확인하기 위해 발 스위치 (응용 과학 인 스트 루먼트) 누르십시오. 당신이 성공한다면 액체가 분산 나타납니다. 액체 bolus의 지름은 꼼꼼한 25 zebrafish의 유충의 학생 (0.21 mm, 부피의 4.9 NL의 영역을 항복)의 직경보다 더 큰 없어야합니다. 액체 bolus이 너무 크고 또는 너무 작은 경우에 따라 압력을 조정합니다. </li><li> tricaine의 메탄 산염의 물고기 (200 μg / ML)을 마취. 일단 물고기 이동 소용돌이들에게 물고기가 중앙에있을 때까지에서 뚜껑이있는 접시를 중단했습니다. 전달 피펫 (피셔 과학)를 사용하여 50 물고기를 수집합니다. 끝쪽으로 물고기를 진정시킬 수 있도록 피펫의 측면을 누릅니다. 부드럽게 가능한 한 작은 액체로 사용 애벌레 아가로 오스 접시에 생선을 피펫. </li><li> 부드러운 유리 막대 (그들을 부수기 위해서는 않도록 주의해!) 함께 선 물고기. 접시 가능한 오프만큼 액체로 기음. 모든 수분을 멀리 등심하기 KimWipe을 사용합니다. </li><li> 같은 시간에 고기와 바늘의 좋은 경치를 얻을 때까지 현미경 물고기와 애벌레 아가로 오스 요리를 둡니다. 물고기를 향해 유리 바늘을 이동합니다. 당신은 물고기를 향해 바늘을 위치로 물고기와 바늘 모두에 확대. 조심스럽게 첫 번째 물고기의 귀의 소포 27, 29 일 (귀)로 유리 바늘을 이동합니다. 당신은 물고기로 바늘을 이동 후에는 당신이 발 스위치 (응용 과학 인 스트 루먼트) 밀어 때 hindbrain의 뇌실 약간 들어올려 때문에 당신은 알게 되겠죠. </li><li> 발 스위치 (응용 과학 인 스트 루먼트) 누르면 액체가 물고기의 hindbrain 뇌실 27 내부에 분산 봐요. 생선과 이동에서 다음 물고기에 바늘을 접어야합니다. 당신이 접시에 물고기를 모두 주입 때까지 절차를 반복합니다. 모든 d를 제거EAD 생선과 (50 생선) 번호가 정확 계속 교체 투입. 50 물고기의 각 그룹에 대한 새 microinjection 바늘이 준비되어야합니다 주입, 또는 C. albicans는 바늘의 맨 ​​아래에 놓이게하고 나막신이나 주입 농도를 throw합니다. </li><li> 접시를 낚시와 60 ML 달걀 물을 포함하고 깨끗한 추가 깊은 배양 접시에 생선에 달걀 물을 분사하여 접시의 생선을 씻으십시오. 그것은 이상 15-20분 동안 아가로 오스의 생선을 떠나지 않는 것이 중요 아니면 그들은 건조하고 죽을 것이다. </li><li> 완료까지 전체 사출 과정을 반복합니다. PBS와 비 병원성 주입 컨트롤을 잊지 말라. </li><li> 완료되면, 28에서 물고기를 유지 ° C. </li><li> 질소 탱크 밸브를 닫습니다. 탱크 라인의 압력을 완화하기 위해 &quot;지속적인&quot;에 &quot;펄스&quot;에서 분사 장치 스위치를 이동, 압력이 시점에서 제로로 떨어질한다. &quot;펄스&quot;로 분사 장치를 전환합니다. 사출 장치를 끄고 작업 공간을 정리. </li></마셨다&gt; 4. 이미징을 위해 물고기를 준비 실험 기간 : ** (30 분) 어려움의 정도 : ** <ol><li> (200 μg / ml) 쇼핑은 이전처럼 tricaine의 메탄 산염 솔루션을 준비합니다. 감염된 물고기를 꺼내, 그리고 tricaine로 그들을 전송합니다. </li><li> 달걀 물에 47.9 ML 0.4 % 낮은 용해 아가로 오스 (VWR 과학)를 준비합니다. microwaving하여 솔루션을 가열. 37까지 쿨 ° C와 혼합에 추가 tricaine의 메탄 산염 (200 μg / ml) 쇼핑 </li><li> 일단 생선 tricaine의 메탄 산염, 0.4 % 낮은 용해 아가로 오스 (VWR 과학)를 포함하는 배양 접시 (VWR 과학)로 피펫 개별 생선 꼼짝 못하고있다. </li><li> 다음으로, 이미징을위한 유리 바닥 접시 (MatTek 공사)의 개별적인 우물에 낮은 용해 아가로 오스에서 물고기를 이동합니다. 생선 접시의 바닥에 평평하게 놓여 있으므로 가능한 한 적게 용해 아가로 오스로 사용합니다. 오직 채워 충분한 tricaine-아가로 오스의를 사용하여유리 바닥 접시의 NER 서클. </li></ol> 5. 프로토콜을 정돈하기 위해 관련 수정 Microinjection위한 Micropipettes 실험 기간 : * (10-15분) 어려움의 정도 : * <ol><li> 원 외에 따라 불타는 브라운 Micropipette 풀러 모델 P-97 (셔터 인 스트 루먼트). 30를 사용하여 중공 유리 막대 BF120 69-10 (셔터 인 스트 루먼트) 당겨라. 다음 조건 히트 = 470, 속도 = 120 시간 = 200으로 프로그램 # 7을 선택합니다. 결과 바늘 한번 그것이 약 10 μm의의 직경을 가지고 팁 위 3mm에 이어 8 베벨부터 끝까지 mm하고있다. </li><li> 브라켓으로 유리 micropipette를로드합니다. &quot;당겨&quot;을 선택하십시오. 가열 필라멘트는 프로그램 매개 변수와 유리 막대 두 뽑아 micropipettes으로 분리됩니다에 따라 바늘을 가열합니다. 피펫 저장 상자 (Sutt의 상점 micropipettes근데 악기). </li></ol> 배아 수집, Morpholino 주입 및 유지 관리 실험 기간 : *** (1-2시간) 어려움의 정도 : *** <ol start="3"><li> 로젠 외. 31 방법에 따라 배아를 수집합니다. 산란 탱크 (수생 서식지)에서 달걀을 수집하기 위해 플라스틱 체에을 (Knutsford의 상품)를 사용합니다. 추가 깊은 페트리 접시 위에 거꾸로 체를 잡고 알을 수집 탱크 물로 린스. </li><li> morpholino 준비 들면, morpholino 300 nanomoles (GeneTools, LLC)가 300 μL 멸균 물을 추가합니다. 이 1.0 mm의 작업 주식을 제공합니다. </li><li> Nanodrop (써모 과학)를 사용하여 morpholino의 농도를 확인합니다. &quot;핵산을하고 샘플 유형을 변경&quot;을 선택 265에 다른 &quot;와 파장. absorptivit로 나눈 1,000 의한 morpholino의 분자량을 곱하여 상수를 입력하십시오Y 계수는 morpholino oligo 속성 시트에 나열. </li><li> 2 μL 0.1 N HCL과 빈 nanodrop. 0.1 N HCL (20x 희석)의 95 μL로 morpholino 솔루션의 5 μL를 희석. nanodrop 페데 스탈을 클릭 조치에 희석 2 μL를 놓습니다. 희석 계수 (20)의 농도를 곱하면됩니다. 이것은 morpholino의 작동 농도를 제공합니다. millimolar 농도를 계산하려면 morpholino의 분자량에 의해 얻은 농도를 나눕니다. </li><li> Danieau 버퍼에 morpholino (58 MM NaCl 0.7 MM KCl, 0.4 MM MgSO 4, 0.6 MM 칼슘 (NO 3) 2, 5.0 밀리미터 HEPES, 산도 7.6)와 0.01 % 페놀 레드 (VWR 과학)의 작동 재고를 준비합니다. </li><li> morpholino 주입 작업에 로젠 외. 31 만원 외. 30에 따라 프로토콜을 따릅니다. 15 분 동안 28 ° C에서 달걀 물과 따뜻한으로 morpholino 분사 요리를 씻어. 사출 요리와 라인 업 한 C에서 물을 제거내말이 맞지 단계의 전송 피펫으로 사출 접시 (제 1에서 준비)의 홈에 배아. 각 접시는 약 250 알을를 개최한다. morpholino로 1-2 세포 단계 배아를 주입. 계란 15 분 27 한 세포 단계에서 유지됩니다. </li><li> 추가 깊은 배양 접시 60 ML 달걀 물에 주입 완료 달걀 물에 달걀 (60 MG / L 인스턴트 오션 소금과 멸균 탈이온수)와 장소를 씻어. Morpholino 주입 요리 활용할 수 있습니다. 완료되면 달걀 물로 헹굼과 4 ° C.에 거꾸로 저장 </li><li> 스토리지를위한 배아로 뗀다는 60 ML 달걀 물을 추가합니다. 60 ML 달걀 물을 별도의 추가 깊은 배양 접시에 트랜스퍼 피펫으로 110 배아를 세어보세요. 28에서 미생물의 성장과 부화에 배아를 방지하기 위해 파란색 0.00003 %의 메틸렌 추가 ° C. </li><li> 배아의 개발을 빠르게하기 위해서는 배아는 머리로 개발할 수 있도록 Kimmel 외. 27에 따라 24 시간 무대를 위해 33 ° C에서 배아 요리를 유지75 트렁크 각도 ° (꼼꼼한 25 단계 27). </li><li> 애벌레 감염 업무 내용 C. 주사 후 28 ° C에서 배아를 유지 albicans. </li><li> 매일 60 ML 신선한 달걀 물로 배아 요리를 바꿉니다. </li></ol> 이미징 실험 기간 : ***** (1-5 시간) 어려움의 정도 : *** <ol start="14"><li> 앞서 설명한 유리 바닥 이미징 요리 (MatTek 주식 회사)에서 tricaine과 낮은 용해 아가로 오스 (4.2 절에 따라)에 물고기를 준비합니다. 올림푸스 IX-81 (올림푸스) 거꾸로 현미경 스테이지에서 접시를 놓습니다. 미분 간섭 대비 (DIC) 빛 아래에서 4X 배율 미만의 초점으로 물고기를 가져와. 이미지 4X, 20x에서 캡처하고, DIC, TRITC (tetramethyl rhodamine의 isothiocyanate) 및 FITC (플루오레신 isothiocyanate) 필터 설정에서 40x 배율. 수 있습니다 </li><li> FV-1과 올림푸스 IX-81 거꾸로 현미경을 사용하여000 레이저 Ariga 외 따라 공촛점 시스템을 스캔. 32. 1-1.5 μm의의 조각 감염의 모든 시간과 Z-스택을 설정하여 40x 배율에서 시간 과정을 실시합니다. </li><li> 이시간 이상의 긴 시간 코스 이미징은 이미징 접시에 물고기마다 2~3시간 위에 낮은 용해 아가로 오스의 레이어를 놓습니다. 이것은 밖으로 건조하고 그것을 몇 군데되는 동안 물고기를 분쇄에서 아가로 오스를 방지합니다. 물고기의 수가 적은 긴 시간 코스의 경우 감염 기간 동안 28 ° C를 유지하기 위해 (Bioptechs 주식 회사) 가열 스테이지를 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 성공 hindbrain 뇌실 C의 예 5시간 후 감염 (hpi) 24 hpi에 zebrafish 애벌레의 albicans 감염 (그림 1)에 표시됩니다. 빨아들이는 C.있는 대식 세포와 같은 세포 albicans은 5 hpi에서 hindbrain의 뇌실에서 볼 수 있습니다. 24 점차로 hpi, C. albicans는 대식 세포와 같은 세포 내부전파 칸디다 증을 나타내는 지느러미 꼬리 조직에의. 이 감염 결과는 10-15 효모 형태 C의 정확한 주입시 크게 의존 hindbrain에 꽂혔어 albicans. 감염된 생선을 즉시 사후 주입의 상영이 보장 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> 그림 1 트렌스 제닉 fli1 :. EGFP 22 CAF2-yCherry 칸디다 albicans와 공촛점 현미경으로 intravitally 군데에 감염된 33 유충. (AC) 5시간 후 감염 감염의 사이트 (hindbrain 뇌실) 규모 막대 = 100 μm의에서 대식 세포와 같은 세포를 EGFP-표현으로 (A) 감염된 유충. 같은 생선 (B와 C) 높은 배율 이미지, C를 보여주는 phagocytes 이내 albicans. 스케일 바 = B 100 μm의와 C (DF) CAF2-yCherry C.있는 전파 칸디다 증과 24시간 후의 감염 (D) 감염된 유충 10 μm의 EGFP 맥 내부 albicans지느러미 꼬리 조직의 rophage 같은 세포. 스케일 막대 = 100 μm의. 같은 생선 (E와 F) 높은 배율 이미지, C를 보여주는 꼬리 조직의 albicans. 스케일 막대 = 100 μm의.

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 제시 zebrafish microinjection 방법은 Gutzman 외 다릅니다. 34 저 여기에 우리가 36-48 hpf의 애벌레의 hindbrain의 뇌실에 귀의 소포를 통해 주사를 보여줍니다. 우리가 설명하는 방법은 감소 조직 손상과 hindbrain의 꽂혔어 10-15 효모의 일관된 주입을 허용합니다. 이 프로토콜은 24 hpi (그림 1)과 상당한 주죠 / 병적 5의 결과에 의해 신체 전반에 걸쳐 펼쳐지는 초기에 현...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 산란 탱크 </td><td> 수생 서식처 </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1.7 ML 튜브 </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> 인스턴트 오션 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> 추가 깊은 배양 접시 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> 표준 배양 접시 </td><td> VWR 과학 </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> 전송 pipettes </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 효모 엑기스 </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> 펩톤 </td><td> VWR 과학 </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> 우선당 </td><td> 피셔 과학 </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> 한천 </td><td> VWR 과학 </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 Hemocytometer </td><td> VWR 과학 </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> VWR 과학 </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 Dumoxel 족집게 </td><td> VWR 과학 </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> 나무 Dowels </td><td> VWR 과학 </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> VWR 과학 </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> 녹음 낮음아가로 오스 </td><td> VWR 과학 </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> 사출 요리 아가로 오스 </td><td> VWR 과학 </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> 브라운 Micropipette 풀러에 불타는 </td><td> 셔터 인 스트 루먼트 </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> 중공 유리 막대 </td><td> 셔터 인 스트 루먼트 </td><td> BF120-69-10 </td><td> 분젠 버너 이상 가열하여 유리 봉을위한 부드러운 유리 </td></tr><tr><td> 피펫 스토리지 박스 </td><td> 셔터 인 스트 루먼트 </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 분사 시스템 </td><td> 응용 과학 계측 </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> 위로 압력 단위 </td><td> 응용 과학 계측 </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 홀더 키트 </td><td> Appli에드 과학 계측 </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> 풋 스위치 </td><td> 응용 과학 계측 </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> 응용 과학 계측 </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> 마그네틱베이스 </td><td> 응용 과학 계측 </td><td> 마그네틱베이스 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine의 메탄 산염 </td><td> 서양 화학 주식 회사 </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> 범위를 해부 </td><td> 올림포스 산 </td><td> SZ61 최고 SZX-ILLB2-100베이스 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> FV-1000 레이저 스캐닝 공촛점 시스템 IX-81 </td><td></td></tr><tr><td> 14 인치 시험관 휠과 TC-7 조직 문화 롤러 드럼 </td><td> 뉴 브 런 즈윅 과학 </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> 이미징 요리 </td><td> MatTek 주식 회사 </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> 바늘을로드하는 피펫 팁 </td><td> Eppendorf </td><td> 930,001,007 </td><td></td></tr><tr><td> 플레이트 붓는 격자 </td><td> 적응형 과학 도구 </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> 열띤 무대 </td><td> Bioptechs 주식 회사 </td><td> 델타 T-5 </td><td></td></tr><tr><td> 작은 주걱 </td><td> VWR 과학 </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 Sieves </td><td> Knutsford 온라인의 상품 </td><td> 12cm </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR 과학 </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> 와동 지니 </td><td> VWR 과학 </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 X 150mm 문화 튜브 </td><td> VWR 과학 </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop </td><td> 써모 과학 </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> VWR 과학 </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> HCL </td><td> VWR 과학 </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR 과학 </td><td> BDH4534-500GP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR 과학 </td><td> BDH4532-500GP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> VWR 과학 </td><td> BDH0246-500GP </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 (NO 3) 2 </td><td> VWR 과학 </td><td> BDH0226-500GP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR 과학 </td><td> BDH4520-500GP </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae

병원균 칸디다 albicans에 의한 전파 칸디다 증은 입원 개인에서 임상적으로 중요한 문제이며 30~40% 기인 사망률 6 연결되어 있습니다. 침투성 칸디다 증은 보통 타고난 면역에 의해 제어와 같은 식세포 NADPH 산화 효소로서 타고난 면역 세포 구성 요소의 유전적 결함을 가진 개인은 candidemia 7-9에 더 감염될 수 있습니다된다. 아주 조금은 C.의 역학에 대한 알려져있다 생체내의 타고난 면역 세포와 albicans 상호 작용. 체외 연구에서 광범위한 설립 있지 않은 호스트 C의 외부 albicans은 macrophages 안에서 germinates, 빠르게 neutrophils 10-14 의해 파괴된다. 체외 연구에서 유용하지만, 시토킨 레벨, 세포외 기질 첨부 파일 및 세포 연락처 10 시간 종속적인 역학을 포함 생체내 환경에서 복잡한 요점을 되풀이 수 없습니다 15-18 </sup&gt;. 호스트 병원체 상호 작용에서 이러한 요인 공헌을 알아내기 위해서는 살아있는 그대로 호스트에 비 invasively 감염의 이러한 측면을 시각화하는 모델 생물을 찾을 중요합니다. zebrafish의 유충이 감염 연구를위한 독특하고 다양한 척추 호스트를 제공합니다. 개발 zebrafish 애벌레의 첫 30 일 동안에만 타고난 면역 방어 2, 19-21는 타고난 면역력에 크게 의존 전파 칸디다 증과 같은 질병의 연구를 단순화합니다. zebrafish 애벌레의 작은 크기와 투명성은 모두 호스트 및 병원체에 대한 세포 수준에서 감염 역학 이미징을 가능하게합니다. 타고난 면역 세포를 fluorescing있는 유전자 변형 애벌레는 감염 22-24에 관련된 특정 세포 유형을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 수정된 안티 센스 oligonucleotides (Morpholinos)은 같은 식세포 NADPH 산화 효소 등 다양한 면역 요소를 허물고 funga에 대한 응답으로 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다난 감염 5. 작은 낮은 척추를 사용하는 윤리적하고 실용적인 장점 이외에도, zebrafish 애벌레 이미지 모두 intravitally와 색상의 병원체와 호스트 간의 총력전을에 독특한 기능을 제공한다. zebrafish는 인간 병원성 박테리아의 여러 모델 감염에 사용되었으며, mycobacterial 감염 3 25 우리의 이해에 큰 발전의 수단이되었습니다. 단, 최근에 이러한 유충 5를 감염하는 데 사용되었습니다 진균류, 23, 26, 훨씬 더 많은 병원체를 가지고 있고, 감염 방법에 대한 자세한 영상 설명도 없어 데이트. 여기에서 우리는 이전 프로토콜에 대한 우리의 수정을 포함하여 꼼꼼한 25 zebrafish의 hindbrain의 뇌실의 microinjection을 위해 우리의 기술을 소개합니다. 곰팡이 감염 애벌레 zebrafish 모델을 사용하여 우리의 연구 결과는 체외 연구에서에서 갈리는과 호스트 병원체 intera 검사의 필요성을 강화오히려 배양 접시 5 간소화 시스템보다 호스트의 복잡한 환경에서 ction.

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Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난 장점입니다<sup&gt; 1-4</sup&gt;. 여기 곰팡이 병원균을 사용 zebrafish 애벌레를 감염시키는 기술을 입증<em&gt; 칸디다 albicans</em&gt; microinjection하여 방법론는 최근 곰팡이 동종 이형 통제하에 식세포 NADPH 산화 효소 활동을 연루하는 데 사용<sup&gt; 5</sup&gt;.

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K 조회수.  University of Maine. zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난 장점입니다 1-4. 여기 곰팡이 병원균을 사용 zebrafish 애벌레를 감염시키는 기술을 입증 칸디다 albicans microinjection하여 방법론는 최근 곰팡이 동종 이형 통제하에 식세포 NADPH 산화 효소 활동을 연루하는 데 사용 5.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic의 비 침습 모델<em&gt; 대장균</em&gt; 신생아 쥐에 감염

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

비 침습적 기관 내 삽관 성인 쥐에서 전체 흉선

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

비 침습적<em&gt; In Vivo</em&gt; 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 MMP 활성의 형광 광학 이미징

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...