저자 물고기 보호를위한 그림 4, Ulrike Nehrdich 및 데비 드 위트의 이미지 및 유용한 토론을 위해 다른 연구실 회원, 차오의 Cui에게 감사 층 드 Kort, 에스더의 웅크리다과 랄프 카르 발료주세요. 이 작품은 경제의 네덜란드 사역의 스마트 믹스 프로그램과 교육, 문화, 과학, 유럽위원회 일곱째 프레임 워크 프로젝트 ZF-건강 (보건-F4-2010-242048), 유럽 마리 퀴리의 교육부에 의해 지원됩니다 초기 교육 네트워크 FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), 그리고 호주 NHMRC (637394)에 의해. 호주의 재생 의료 연구소는 빅토리아와 호주 정부의 주 정부의 보조금에 의해 지원됩니다.

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li><li>vander Sar, A. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism.">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li><li>Ellett, F. L., Lieschke, G. 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Biol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish.">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 문서에서 설명하는 감염 방식은 주로 호스트 타고난 면역 유전자 또는 세균성 독성 유전자 하나의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 정맥 마이크로 주입 방법 (프로토콜 5, 6.1)과 같은 공부를 가장 자주 사용됩니다. 사후 혈액 섬의 꼬리 정맥은 1 일 된 배아의 정맥 주사를위한 가장 편리한 위치입니다. 꼬리 정맥 나중 단계에서 침투하기가 더 어려워집니다로서 2-3 dpf에서 배아의 정맥 주사 사이트로 Cuvier의 덕트를 선호합니다. 모든 경우에 그것은 cfu의 계산을위한 도금 사출 inocula으로 선택되어야 박테리아의 일관성있는 번호로 배아를 주입하는 것이 중요합니다. 다음과 같은 측면 재현할 주사를 달성하기 위해 고려되어야합니다. 첫째, 이것은 고품질의 유리 microcapillary 주사 바늘을 가지고 필수적입니다. 바늘 끝이 너무 클 경우 주사가 발생하는 출혈을 위해 충분히 큰 바늘 구멍을 만들 것입니다주입된 박테리아가 혈액 순환의 돈은 절대 나오지 않습니다. 둘째, 박테리아는 혈액 순환에 직접 주입해야합니다. 바늘 끝은 난황 확장으로 분사 유체 확산 정맥 안쪽 아니면되지 않으면 배아는 실험에서 폐기되어야합니다. 셋째, M. 주입을위한 캐리어로 PVP40를 사용하여 marinum은 유리 바늘에 가라앉고에서 세균을 방지에 도움이 될 것입니다. PVP40 주사 기간에 걸쳐 더 재현할 inocula 그 결과 현탁액의 균질성 향상됩니다. PVP40 또한 S. 위해 사용될 수있다 큰 크기와 박테리아의 밝은 형광이 실험 중에 분사 inoculum 이상의 시각적 제어를 허용하기 때문에 typhimurium 주사하지만, 여기서는 덜 중요하다. 주사 연습을 위해 우리는 페놀 붉은 염료 (1 % V / V) 또는 1 μm의 다양한 색상 (Invitrogen)에서 사용 가능한 형광 분야의 사용을 권장합니다. 기술이 마스터되면, 그것은 약 30 minut 소요초밖에는 아가로 오스 플레이트에 배아를 정렬하고 세균성 사출 볼륨을 조정하는 데 필요한 시간을 포함하여 50-100 배아를 주입합니다. 혈액 섬 (프로토콜 5)로 또는 Cuvier (프로토콜 6.1)의 덕트로 정맥 주사가 가장 일반적으로 사용되고 있지만,이 비디오 문서에서 설명한 감염의 대안 노선 (프로토콜 6.2, 6.3 대식 세포 및 호중구 chemotaxis을 공부하는 데 유용 증명했습니다 및 6.4), 감쇠 박테리아 변종 (6.5 프로토콜)의 성장을 공부하고, 높은 처리량 어플 리케이션 (프로토콜 6.6) 4-8 대한 zebrafish 감염 모델을 적용할 수 있습니다. 설명 마이크로 사출 방법도 바이러스 18, 19, 곰팡이 포자 14, 20, protozoan의 기생충 (마리아 Forlenza, 개인 커뮤니케이션)의 주사에 대해 적용할 수 있습니다. 이 비디오 문서에서 설명하는 분사 절차에 유용한 첨가 zebr로 박테리아의 피하 주입에 대해 최근에 설명된 절차입니다금부어의 배아 21. 이 절차는 조직 표면에 효율적으로 빨아들이다 세균을 찾았으나되었다 neutrophils에 의한 세균의 phagocytosis를 공부하기 위해 적용되었다 macrophages과는 달리, 혈액 또는 외부로 유체가 노니는 신체 충치로 주입시 박테리아를 phagocytose 것이 거의 없었습니다. 피하 주사의 배아이 동영상에 대한 문서에서 설명한 꼬리 근육 주사 용과 비슷한 위치되지만, 바늘은 체절을 통해 박테리아를 주입하기 위해 단지 피부 아래에 삽입됩니다. 그것은 마이크로 사출은 본질적으로 감염의 인위적인 경로는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 그러나, 초기 배아는 세균성 병원체에 대한 외부 노출에 매우 저항력이 있습니다. 실제로 태아가 세균 현탁액 목욕을하고 침지 assays는 우리 손에 22 재현할 수 없습니다. 일부 배아는 침수시 감염 될 수 있지만, 우리는 사망률 요금과 특급에 큰 변화를 관찰했습니다이러한 assays에서 개별 배아 간의 염증 마커 유전자의 이온. 이 문서에서 설명하는 마이크로 사출 방법은 재현성 감염을 달성하며 호스트 타고난 면역 세포와 세균의 상호 작용을 연구하는 데 특히 유용합니다. 각각의 배아에서 세균 감염을 계량하기위한 효율적인 접근법은 맞춤 전용 픽셀 부량 소프트웨어 17, 23에 감염된 태아의 형광 이미지를 분석하는 것입니다. 이 접근법은 감염된 태아의 도금 후 cfu 카운트의 결과와 잘 상관 관계를 보여왔다. 마찬가지로 태아 당 백혈구 수치의 상대적인 변화는 유전자 변형 백혈구의 형광단 기자 라인의 디지털 이미지 분석에 의해 계량되어,이 방법은 감염 24 호스트 leukopoietic 응답을 quantifying에 적용되는 것입니다. 호스트 타고난 면역 유전자의 기능을 설명하는 감염 모델을 결합하여 생체내에 효율적으로 조사 수morpholino를 최저로. Morpholinos 특정 RNAs을 타겟으로하고이 저널 10, 25의 다른 동영상 기사와 같이 1-세포 단계 zebrafish의 배아에 주입하면 유전자 제품의 표현을 줄이고 합성 안티 센스 oligonucleotides입니다. morpholino의 최저 연구에서는 비교되는 모든 배아 그룹이 세균 주사 이전 올바르게 개최되는 매우 중요합니다. 배아는 시간이 지남에 따라 점차 유능한되는 개발 면역 체계를 가지고 있기 때문에 이것은 특히 중요합니다. zebrafish 배아의 주요 타고난 면역 하위 집합, macrophages와 neutrophils를 구분하는 현재 사용할 수있는 여러 가지 유전자 변형 기자 라인이 있습니다. mpx 및 lyz의 발기인은 호중구 기자 노선 16, 26, 27을 생성하는 데 사용되었으며 csf1r (FMS)과 MPEG1 발기인은 대식 세포 기자에게 14, 28, 생산하는 데 사용되었다. 동안 csf1r (FMS)가 추가 xanthophores로 표현되며, MPEG1 표현이 macrophages에 독점적이다. 이 동영상을 문서에 나타난 바와 같이, 최근에 개발된 MPEG1 기자 라인 macrophages에 의해 영상 세균성 phagocytosis에 대한 매우 유용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 페놀 레드 </td><td> 시그마 </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 228,210 </td></tr><tr><td> Difco 미들 7H10 한천 </td><td> Becton, Dickenson 및 회사 </td><td> 262,710 </td></tr><tr><td> BBL 미들 OADC 농축 </td><td> Becton, Dickenson 및 회사 </td><td> 211,886 </td></tr><tr><td> Difco 미들 7H9 국물 </td><td> Becton, Dickenson 및 회사 </td><td> 271,310 </td></tr><tr><td> BBL 미들 ADC 농축 </td><td> Becton, Dickenson 및 회사 </td><td> 211,887 </td></tr><tr><td> 십대 초반 80 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, 머크 KGaA </td><td> 529,504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ em&gt;는-Phenylthiourea (PTU) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> 에틸 3 - aminobenzoate methanesulfonate 소금 (Tricaine) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> 메틸 셀룰로오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque 아가로 오스 (낮은 용융 점 아가로 오스) </td><td> Lonza 주식 회사 </td><td> 50,100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 μm의 빨강, 형광 (605분의 580)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 μm의, (515분의 505) 노랑 - 녹색 형광) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Zebrafish (Danio rerio) 배아는 점점 호스트 병원체 상호 작용 1 척추 타고난 면역 체계의 기능을 연구를위한 모델로 사용됩니다. 타고난 면역 체계의 주요 셀 유형, macrophages와 neutrophils은 사전 적응 면역 반응에 필요한 lymphocytes의 성숙에 embryogenesis의 첫 번째 일 동안 개발할 수 있습니다. 배아 다수를 획득 용이성은, 외부 개발, 배아 및 애벌레 단계의 광학 투명성으로 인해 그들의 접근은 유전자 도구, 유전자 변형 리포터 라인의 광범위한 돌연변이 자원과 콜렉션의 다양한 모든 zebrafish의 다양성에 추가 모델. 살모넬라 enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium)와은 Mycobacterium marinum는 macrophages에 intracellularly 거주하고 자주 zebrafish 배아에서 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 이 두 가지의 감염 과정세균성 병원균은 비교하는 흥미로운 때문에 S. typhimurium 감염은 M. 반면, 급성 하나 일 이내에 치명적입니다 marinum 감염 만성이고 애벌레의 단계 2, 3까지 몇 군데하실 수 있습니다. 배아 (그림 1)로 박테리아의 마이크로 주입의 사이트는 감염이 급속도로 전신이 될 것이다 또는 초기화된 상태로 유지됩니다 여부를 결정합니다. 급속한 조직 감염에 의해 설정할 수 마이크로 주입 직접 사후 혈액 섬의 꼬리 정맥을 통해 혈액 순환에 또는 Cuvier, 트렁크 vasculature로 마음을 연결하는 난황에 대한 광범위한 유통 채널의 덕트를 통해 박테리아를. 한 dpf에서이 단계의 배아는 phagocytically 활성 macrophages을 가지고 있지만 neutrophils 아직 혈액 섬에 주입, 성숙하지 않은 경우 사용하는 것이 좋습니다. 배아도 기능적 (myeloperoxidase 생산) neutrophils를 개발 2-3 dpf,시 주사의 경우 Cuvier의 덕트는 t으로 선호그는 주사 사이트. 지역의 감염에 대한 골수양 세포의 이동 마이 그 레이션을 공부하려면, 박테리아는 꼬리 근육, 귀의 소포, 또는 hindbrain 뇌실 4-6로 주입 할 수 있습니다. 또한, notochord, 골수양 세포에 정상적으로 접근할 것 같습니다 구조, 지역 감염 7 매우 쉽습니다. 높은 처리량 어플 리케이션을위한 유용한 대안은 기름지게 8 후 첫 시간 이내에 배아의 노른자로 박테리아의 주사입니다. 형광 macrophages 또는 neutrophils과 형광 박테리아와 유전자 변형 zebrafish 라인을 결합하면 호스트 병원체 상호 작용의 멀티 컬러 이미징을위한 이상적인 환경을 만듭니다. 이 비디오 기사는 S로 zebrafish 배아의 정맥과 지역 감염에 대한 자세한 절차를 설명합니다 typhimurium 또는 M. marinum 박테리아와 타고난 면역 계통의 세포와 상호 작용의 후속 형광 이미징을위한.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을 증명했습니다<em&gt; 살모넬라균 typhimurium</em&gt;과<em&gt;은 Mycobacterium marinum</em&gt;. 박테리아와 멀티 컬러 형광 이미징의 미세 주입은 zebrafish 배아 감염 모델의 응용에 관련된 필수적인 기술입니다.

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.4K 조회수.  Leiden University. 투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을 증명했습니다 살모넬라균 typhimurium과은 Mycobacterium marinum. 박테리아와 멀티 컬러 형광 이미징의 미세 주입은 zebrafish 배아 감염 모델의 응용에 관련된 필수적인 기술입니다.