우리의 프로토콜은 제브라피시 애벌레에 대한 관심의 물질과 오염 물질의 신경 행동 효과를 연구하고 이러한 에이전트의 잠재적 인 신경 독성을 밝히기위한 명확한 과정을 제공합니다. 이 기술은 제브라피시 모델에서 신경 행동의 높은 처리량 테스트를 사용하여 수행 될 수있다. 이 방법은 제브라피시 게놈이 인간과 높은 동성애를 가지고 있기 때문에 오염 물질에 대한 잠재적 인 신경 독성을 입증하기 위해 오염 물질의 대립 - 신경 행동 효과를 평가하기 위해 적용 될 수 있으므로 화학 적 관리 및 오염 물질로 인한 공중 보건 문제에 대한 표시를 제공 할 수 있습니다.
Zebrafish는 높은 처리량 검열의 이점을 가지고 있기 때문에, 이 방법은 정신성 약물 및 환경 독성학 연구의 발달에 대한 통찰력을 제공합니다. 첫 번째 실험을 공부하는 것에 대해 두려워하지 마십시오. 프로토콜을 따르는 경우 성공적인 결과를 받게 됩니다.
실험을 수행하기 최소 2시간 전에 실온을 섭씨 28도로 설정하고 48웰 마이크로플레이트의 각 웰에 800마이크로리터의 노출 용액을 추가합니다. 이어서, 변형된 팁이 있는 1밀리리터 파이펫을 사용하여 200마이크로리터의 노출 용액을 운동 및 경로 각도 실험에 대비하여 마이크로플레이트의 각 웰에 하나의 애벌레를 이송한다. 사회적 행동 실험을 위한 6웰 마이크로플레이트를 준비하려면 6개의 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 4밀리리터의 노출 용액을 추가하고 200마이크로리터의 노출 용액을 각 우물에 전달합니다.
테스트를 시작하기 전에 높은 처리량 모니터링 소프트웨어 프로그램을 열고 추적 회전 경로 각도 모듈을 선택합니다. 48웰 마이크로 플레이트를 레코딩 플랫폼으로 옮기고 덮개를 아래로 당깁니다. 파일을 클릭하고 프로토콜을 생성하여 새 프로토콜생성을 시작하고 48을 위치 수 위치에 입력합니다.
매개 변수, 프로토콜 매개 변수 및 시간을 클릭하여 실험 기간을 1시간 10분으로 설정하고 통합 기간을 60초로 설정합니다. 타원형 모양 도구를 사용하여 왼쪽 상단 주위에 원을 잘 그립니다. 원을 선택하고 복사, 오른쪽 상단 마크, 붙여 넣기 및 선택을 클릭합니다.
마우스를 사용하여 복사된 원을 오른쪽 오른쪽으로 잘 드래그하고 복사, 오른쪽 상단 마크, 붙여넣기 및 다시 선택합니다. 그런 다음 복사된 원을 오른쪽 하단으로 잘 드래그하고 빌드 및 표시 지우기를 클릭합니다. 시스템은 자동으로 플레이트의 다른 모든 우물 위에 원을 그립니다.
다음으로 눈금 그리기를 클릭하고 화면에 교정 선을 그립니다. 줄의 길이를 입력하고, 단위를 설정하고, 그룹에 적용을 클릭합니다. 동물색을 검은색으로 설정하고 검출 임계값을 16내지 18로 설정하여 동물을 감지하고, 비활성을 초당 0.5cm로, 초당 2.5cm의 작은 속도로 설정합니다.
경로 각도 클래스를 영하 180에서 180으로 설정합니다. 조명 조건을 설정하려면 매개 변수, 라이트 드라이빙, 아래 3가지 트리거링 방법 중 하나를 클릭하고 향상된 자극을 사용하여 조명 조건을 설정합니다. 가장자리를 클릭하고 10분의 어두운 기간을 설정하고 10분 동안 빛과 어두운 기간을 번갈아 가며 세 사이클을 설정합니다.
그런 다음 프로토콜을 저장합니다. 모든 매개 변수가 설정되면 테스트룸의 조명을 거절하고 애벌레가 10분 동안 시스템에 적응할 수 있도록 합니다. 적응 기간이 끝나면 실험 및 실행을 클릭하고 실험 파일을 저장할 폴더를 만듭니다.
그런 다음 결과 이름을 입력하고 배경 및 시작을 클릭합니다. 실험이 끝나면 실험을 클릭하고 중지합니다. 그런 다음 후속 실험을 위해 48웰 마이크로 플레이트를 라이트 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
모든 그룹은 16마리의 동물을 포함할 수 있기 때문에, 시스템은 단일 48웰 마이크로플레이트에서 상이한 처리 조건 하에서 운동과 경로 각도의 높은 처리량 테스트를 수행하는 데 사용될 수 있다. 애벌레의 사회적 활동은 6웰 플레이트를 사용하여 테스트할 수 있습니다. 본 대표적인 실험에서, BDE-47의 가장 높은 농도 군은 암흑기간 동안 뚜렷한 저활성을 보였으며, BDE-47 노출로 인한 변화는 광기간 동안 관찰되지 않았다.
또한, 6-하이드록시-BDE-47의 고농도 군은 5일 후 수정시 루틴및 평균 회전횟수를 줄여나하였다. 그러나, 6-메톡시-BDE47 노출 군에서 보다 반응성이 뛰어난 회전이 유도되었다. 제브라피쉬의 사회적 활동은 염소처리파라핀-70과 단사슬 염소처리 파라핀-52b에 의해 자극되었으며, 긴 사슬 염소 파라핀-52a는 애벌레의 접촉 기간을 단축시켰다.
시험을 위해 옮겨진 애벌레가 정상적인 수영 능력과 기형이 없어야하는지 확인하는 것이 중요합니다. 색상 선호도, 어두운 환경 설정, 모든 어둠, 얼룩말피의 꼬리 움직임과 같은 다른 변수는 환경 오염 물질의 신경 행동 독성에 대한 추가 질문에 대답할 수 있습니다. BDE-47 노출 솔루션은 신경 독성이며 내분비 중단 가능성이 있으므로 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오.
