Name: imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method at JoVE.com

이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 프로젝트 번호 30381)에서 CDCB에 존 R. 에반스 지도자 기금 연구 인프라 보조금, 그리고에 의해에서 CDCB에 발견 그랜트에 의해 지원되었다 NSERC에서 NJM에 발견 그랜트. ELL는 온타리오 대학원 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다. CDS는 NSERC에서 학부 학생 연구 조교에 의해 지원되었다. ALM은 NSERC에서 알렉산더 그레이엄 벨 (Alexander Graham Bell) 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다.

성인 여성 CD1 - 변형 마우스는이 연구에 사용되었다. 유사 염색은 다양한 연령층에서 남녀 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 동물은 원칙과 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 마음에 든다고하고, 실험 프로토콜은 구 엘프 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 골지 - 콕스 염색 <ol><li> 두뇌의 골지 - 콕스 함침 <ol><li> 별도로 고품질 물로 칼륨 중크롬산 및 크롬산 칼륨을 용해시켜 1 %의 골지 - 콕스 용액 (w / v)의 중크롬산 칼륨 0.8 % (w / v)의 크롬산 칼륨 1 % (w / v)의 염화 수은 만들기 . 상기 혼합 용액을 염화 수은을 추가 등급 1 여과지를 이용하여 최종 용액을 필터. 최대 1 개월 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 5 %의 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취. </li><li> 잘린 마우스를 안락사 빠르게 두뇌를 제거합니다. </li><li> 골지 - 콕스 용액 17 mL를 함유하는 20 ML 글래스 섬광 바이알로 뇌를 놓고 25 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다. </li><li> 24 시간 동안 4 ℃의 어두운 곳에서 (0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4 / V) 슈 크로스 W (30 %) 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌 Cryoprotect. 주 : 다음 옵션 세 단계가 장기 저장이 단계에서 뇌를 고정하기 위해, 주요 프로토콜의 대안으로 사용될 수있다. </li><li> 드라이 아이스에 미리 냉각 된 200 ㎖의 이소 펜탄에 침지하여 뇌 전체를 고정. </li><li> -80 ℃에서 어둠 속에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 저장 동결 뇌 놓는다. </li><li> 준비가 진행하면, 24 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌를 해동. </li></ol></li><li> 뇌 단면 <ol><li> 자당 및 블록에서 뇌를 제거면도날을 사용하여 소뇌를 차단하고, 뇌의 나머지 꼬리 단부에 평탄한 가장자리를 남겨 절편 대 케이. </li><li> 열 한천 (3 % (w / v)의 물)가 용융 그것의 녹는 점보다 약간 때까지 식지 때까지. </li><li> 그 꼬리 끝면이 아래로 작은 일회용 무게 접시에 두뇌를 놓고 두뇌를 포함 용융 한천의 충분한 양을 추가합니다. </li><li> 한천은 고형화되면, 약 2 이탈 초과 한천 트림 - 뇌를 둘러싸고 4mm 및 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 사용하여 꼬리 단면 다운 가진에 vibratome의 스테이지 뇌 접착제. </li><li> 400, 슬라이스 두께 뇌 및 단면 뇌 다루 자당 동결 방지제의 충분한 양을 가진에 vibratome의 스테이지 영역 채움 - 86 Hz의 진동 주파수를 사용하여 (피검 뇌 영역에 따라) 500 ㎛ 또는 0.125 mm / s의 블레이드 발전 속도. </li><li> 작은 페인트 브러시를 사용하여상업적으로 이용 가능한 메쉬 바닥 인서트와를 함유하는 6- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 위치 뇌 부분 미리 작성된 6 % 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액, pH를 7.4 (w / v)의 자당. </li><li> CO 4 ° / N의 어두운 부분을 부화. </li></ol></li><li> 뇌 섹션 개발 <ol><li> 메쉬 바닥 인서트를 사용하여 0.1 M 인산 완충액, pH 7.4의 웰에 2 %의 파라 포름 알데히드 5 ㎖ (/ V w) (PBD)를 포함하는 신규로 뇌 단면을 옮긴다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 저속으로 이동하는 로커 인큐베이션. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다. </li><li> 2.7 % (V / V) 수산화 암모늄을 함유하는 5 ㎖의 새로운 웰로 수수 부. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 느린 속도로 이동 로커에 부화. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 오 세척5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동 NA 로커. </li><li> 또한 정착액 (A)의 5 ㎖을 함유하는 신규로 수수 부 원래 구입 농도에서 물에 10 배 희석 한 것 (재료 표 참조). 25 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 느린 속도로 이동 로커에 부화. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다. </li></ol></li><li> 뇌 섹션을 장착 <ol><li> 작은 페인트 브러시를 사용하여, 현미경 슬라이드 위에 섹션을 탑재합니다. 여분의 물을 제거하고 핀셋과 작은 조직을 사용하여 한천. 모든 한천 탈수를 진행하기 전에 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 약 45 분 (400 개 ㎛의 부분) 또는 90 분 (500 개 ㎛의 부분)을 실온에서 공기 건조시킨 부분을 허용한다. 주 : 건조시기 적절한 수준은 중요하고, 각 결정해야기관 주위 온도 및 습도 수준에 따라. 너무 짧은 건조 시간 이후 탈수 단계에서 슬라이드 탈락 섹션에 이르게, 너무 긴 건조 시간이 균열 부분에 연결됩니다. 섹션은 여전히 ​​건조의 적절한 수준에서 반짝 것으로 나타납니다. </li><li> 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 크레 실 바이올렛 염색 섹션. 참고 :이 옵션 단계는 크레 실 바이올렛 신경 세포 핵을 염색하기 위해, 동결 된 적이 섹션을 위해 사용될 수있다. 우리는 지우고 크레 실 바이올렛 부화하기 전에 섹션을 재수하는 경우에도 염색 및 섹션에서 저 배경에 이르게 것으로 나타났습니다. <ol><li> 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 물에이어서, 물에 95 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 물에이어서 50 % 에탄올. </li><li> 5 분 동안 물에 놓는다. </li><li> 0.5 %에서 발생 CRE (/ V w)7 분 동안 물 SYL 보라. </li><li> 2 분 동안 물에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 부 탈수. <ol><li> 물 다음, 물 50 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 수중 후 95 % 에탄올. </li><li> 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다. 참고 :이 탈수 및 청소 시간이 원고에 설명 된대로 마우스의 뇌를 처리하기에 충분합니다. 그러나, 우리는 최종 청산 단계는 15 분 총까지 연장해야 할 수도, 쥐 cowbird을 포함한 다른 종에서 관찰했다. </li></ol></li><li> 무수 장착 매체를 이용하여 커버 슬립 구간. </li><li> 슬라이드는 적어도 5 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 수평으로 건조 할 수있다. </li></ol></li></ol> 두꺼운 뇌 섹션 내에서 2 이미징 스테인드 뉴런 <ol><li> 이미지 스택을 캡처 </강한&gt; <ol><li> 현미경 전구, 카메라, 무대 컨트롤러를 켭니다. </li><li> 현미경 소프트웨어 (예를 들어, Neurolucida)를 엽니 다. </li><li> 현미경 무대에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 예컨대 1.25 0.4 NA PlanAPO 또는 4X 0.16 NA로 저배율 대물 렌즈를 이용하여 뇌 단면의 2D 시야각 이미지를 캡처 <ol><li> 이미지 초점 및 노출 시간 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션의 아무 곳이나 왼쪽 버튼으로 클릭하여 기준점 만들기 </li><li> 이미지 획득 창에서 &quot;하나의 이미지를 획득&quot;을 선택하여 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 10 배 NA 0.3 UPlan FL N 목적을 사용하여 관심의 뉴런 (들)를 함유하는 영역의 중간 해상도 이미지를 캡처 스택. <ol><li> 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션 A의 정상에 초점을 맞춤으로써 이미지 스택의 상단 및 하단 경계를 설정ND 선택 화상 획득 창에서 &quot;스택 상단 &#39;옆 다음 섹션의 바닥에 집중하고, 화상 획득 윈도우 내에 다음에&quot;바닥 스택 &quot;,&quot;설정 &quot;을 선택&quot;설정 &quot;. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 사이의 거리를&quot;다음 &quot;5 μm의&quot;을 입력하여 5 ㎛ 인 스텝 거리를 설정한다. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 획득 스택&quot;을 선택하여 이미지 캡처 스택. </li><li> 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 30 배 NA 1.05 실리콘 오일 액침 대물를 사용 관심 뉴런을 포함하는 영역의 높은 해상도 이미지를 캡처 스택. <ol><li> 대물과 OI과 접촉하도록 보장 슬라이드 침지 실리콘 오일 4 방울 슬라이드 위에 대물 배치 - 3 적용엘. </li><li> 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션 상단에 포커싱 &quot;설정&quot;을 선택하여 이미지 스택 상위 및 하위 경계를 설정 다음 다음 이미지 획득 창에서, 및 &quot;스택의 상단&quot;부분의 바닥에 집중하고 선택하는 「설정」 이미지 획득 창에서 &quot;스택의 하단에&quot;옆에. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 사이의 거리를&quot;다음에 &quot;1 ㎛&quot;을 입력하여 1 ㎛의 단계의 거리를 설정한다. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 획득 스택&quot;을 선택하여 이미지 캡처 스택. </li><li> 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 데이터 파일을 저장하고 외부 처리를 위해 TIFF 형식의 모든 이미지 파일을 저장합니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> Z 프로젝션 이미지와 이미지 몽타주 만들기 <ol><li> ImageJ에있는 Z-투사 이미지 만들기 <ol><li> 바이오 형식 플러그인이 설치되어 열기 ImageJ에 소프트웨어. </li><li> &quot;플러그인&quot;을 선택 -&gt; &quot;바이오 형식&quot;-&gt; &quot;바이오 형식 가져 오기&quot;. </li><li> 이미지 스택 파일을 선택 열 수 있습니다. </li><li> &gt; &quot;유형&quot;- -&gt; &quot;RGB 색상&quot;파일이 열리면, &quot;이미지&quot;를 선택하여 RGB의 형식을 변경합니다. </li><li> &quot;이미지&quot;를 선택하여 Z 프로젝션 만들기 -&gt; &quot;스택&quot;-&gt; &quot;Z 프로젝트 ...&quot;. </li><li> TIFF 파일로 두 개의 차원 Z 프로젝션 이미지를 저장합니다. </li></ol></li><li> 관심의 전체 영역의 2 차원 이미지의 몽타주를 작성합니다. <ol><li> (예를 들어, 어도비 포토샵) 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> &quot;파일&quot;을 선택 -&gt; &quot;자동화&quot;-&gt; &quot;진 Photomerge를&quot;. </li><li> 선택 &quot;찾아보기&quot;및 모든 IMAG을 추가ES 파일을 병합 할 수 있습니다. </li><li> &quot;함께 이미지를 혼합&quot;을 선택하고 &quot;확인&quot;을 선택해야합니다. </li><li> TIFF 파일로 관심의 전체 영역의 결과 몽타주 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+del+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li><li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impr&#228;gnation+des+centralen+Nervensystems+mit+Quecksilbersalzen.">Impr&#228;gnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li><li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step.">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38 (2016).</li><li>Levine, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+thin+tissue+Golgi-Cox+impregnation:+fast,+reliable+methods+for+multi-assay+analyses+in+rodent+and+non-human+primate+brain.">Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain.</a> J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).</li><li>Ranjan, A., Mallick, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+consistent+and+reliable+Golgi-Cox+staining+in+significantly+reduced+time.">A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time.</a> Front Neurosci. 1, 157 (2010).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).</li><li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum.">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li><li>Narayanan, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+the+effect+of+brain+impregnation+duration+on+neuronal+staining+and+morphology+in+a+modified+Golgi-Cox+method.">Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method.</a> J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).</li><li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Golgi-Cox+method.">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li><li>Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampus+makes+a+significant+contribution+to+experience-dependent+neocortical+plasticity.">The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity.</a> Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).</li><li>Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II/III+pyramidal+neurons.">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li><li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressive-like+behaviours+and+decreased+dendritic+branching+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+mice+with+tumors:+A+novel+validated+model+of+cancer-induced+depression.">Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression.</a> Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).</li><li>Frauenknecht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+with+experimental+antiphospholipid+syndrome+display+hippocampal+dysfunction+and+a+reduction+of+dendritic+complexity+in+hippocampal+CA1+neurones.">Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).</li><li>Camacho-Abrego, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+the+dendritic+morphology+of+the+neurons+from+prefrontal+cortex+and+hippocampus+after+subthalamic+lesion+in+Sprague-Dawley+rats.">Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats.</a> Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).</li><li>Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus.">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li><li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons.">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li><li>Lytton, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Ha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi-Cox+method+with+counterstain+for+the+study+of+synapses.">A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses.</a> Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+coeruleus:+a+cytoarchitectonic,+Golgi+and+immunohistochemical+study+in+the+albino+rat.">The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat.</a> Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).</li><li>Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+combining+Golgi+and+Nissl+staining+to+study+neuronal+morphology+and+cytoarchitecture.">A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 - 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 ...

조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 - 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 (1)에 의해 개발 콕스 2에 의해 수정, 연구자들은 또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 3, 4 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 5, 6, 7, 8, 9,. 뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 기술적 인 고려 사항은 가능한 고배율 / 고해상도 현미경 목표의 작동 거리에 의해 제한되는 최대 슬라이스 두께입니다. 60 공통 오일 침지 목표 - 100X는 뛰어난 해상도를 제공 범위하지만, 일반적으로 200 μm의보다 크지 않습니다 자신의 작업 거리에 의해 제한됩니다. 200 ㎛의 범위로 잘라 뇌 절편 대뇌 피질 (10),의 CA1 영역 11, 12, 피라미드 신경의 얕은 층에서의 예시적인 피라미드 신경이 슬라이스 두께 내에 포함될 수있는 소정의 신경 세포 유형을 시각화하기 적합 할 수 해마 (15)의 치아 이랑에서 해마 13, 14, 및 과립 세포. 상대적으로 이상과 뉴런이러한 뇌 전체 수지상 트리를 포함하는 완벽한 각도로 구분 될 필요가 있기 때문에 셀 본체 (16)에서 800 μm의를 확장 할 수 있습니다 마우스, 더 큰 도전을 제공하는 대뇌 피질의 깊은 층에서 피라미드 신경 세포로 수지상 나무, 200 개 μm의 슬라이스 내의. 수지상 또는 분기 중 입쪽 또는 꼬리 방향으로 연장되는 경우에도 실현 될 수 없다. 그것은 다수의 뇌에 인접 섹션에 걸쳐 신경을 추적하여 이러한 제약을 해결하는 것이 가능하지만,이 방식은 17 정확하게 추적하는 섹션을 정렬하는 데 중요한 기술적 도전을 소개한다. 더 실용적인 접근 방식은 더 큰 두께로 잘라 뇌 섹션에 포함 된 전체 뉴런을 시각화하는 것입니다. 골지 - 콕스 방법을 사용하여 마우스의 500 μm의 두께 뇌 부분, 그들의 개월을 시각화 - 우리는 여기에 (400) 내에서 신경 세포를 염색하는 기술을보고rphology 800 μm의 작동 거리를 갖는 고해상도 실리콘 오일 침지 목적을 사용. 우리가 설명하는 골지 - 콕스 함침 처리 프로토콜은 문헌 (6)에 가장 많이 인용 된 현대 프로토콜 중 하나에서 수정됩니다. 두꺼운 뇌 섹션 우리의 접근 방식은 완전히 섹션에 포함 된 모든 유형의 뉴런을 식별의 가능성을 증가시키는 장점을 제공한다. 기본 프로토콜뿐만 아니라, 또한 독특한 장점 제공 본 개의 변형 : 위해 장착 섹션의 표면 상 크레 실 바이올렛 Counterstain과 함께 (1) 골지 - 콕스 염색 뇌 영역의 경계를 정의하고, 레이어를 식별 할 단면 처리 및 최종 처리 이전에 함침 전체 뇌의 장기 저장을위한 중간 제빙 단계와 대뇌 피질, (2) - 골지 콕스 염색.

<table><tbody><tr><td>potassium dichromate</td><td>Fisher Scientific</td><td>P188-100</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>potassium chromate</td><td>Fisher Scientific</td><td>P220-100</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>mercuric chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25423</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Whatman grade 1 filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>20 mL scintillation vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Bioshop Canada</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5011-500G</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390-500G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC126470010</td><td>Also known as 2-methylbutane; hazardous</td></tr><tr><td>agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-100G</td><td></td></tr><tr><td>small weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1b</td><td></td></tr><tr><td>mesh bottom tissue culture inserts</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-214</td><td></td></tr><tr><td>paraformadelhyde (PFA), 16%</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>15710-S</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Kodak Fixative A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7542</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>CitroSolv clearing agent</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>anhydrous ethyl alcohol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>cresyl violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1791</td><td></td></tr><tr><td>permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53 model</td><td></td></tr><tr><td>colour camera, 12 bit</td><td>MBF Biosciences</td><td>DV-47d</td><td>QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td></tr><tr><td>3D motorized microscope stage, controller and enoders</td><td>MBF Biosciences</td><td>N/A</td><td>Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences</td></tr><tr><td>4X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>4x 0.16 N.A. UplanSApo</td><td></td></tr><tr><td>10X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>10x 0.3 N.A. UPlan FL N&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td><td></td></tr><tr><td>silicone immersion oil</td><td>Olympus</td><td>Z-81114</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida software</td><td>MBF Biosciences</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>Current version</td><td>With the OME Bio-Formats plugin installed</td></tr><tr><td>Photoshop software</td><td>Adobe</td><td>version CS6</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method

신경 세포 염색의 골지 - 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 - 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.

500 μm의 두께 뇌 구역 -이 골지체 콕스 - 염색 프로토콜과 두 바와 선택적 변이체 (400) 내의 개별 뉴런을 시각화하는데 이용 될 수있다. 10 배의 대물 렌즈와 Z 축에서 5 ㎛의 단계를 사용하여 캡처 이차원 Z-돌기 대표 화상 몽타주는도 1에 도시된다 : A1 - 전방 피질 영역 (1)과를 포함하는 코로나 뇌 부분의 넓은 영역에 대한 C1 이차 운동 ?...

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Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K 조회수.  University of Guelph.  우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다. 

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

연구

신경과학

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

요약

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이 비디오의 챕터

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

골지 콕스 염색과 돌기 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

요약

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세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

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신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

골지 콕스 염색과 돌기 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화