이 작품은 맥네어 재단, NARSAD, 그리고 NINDS 부여 R00NS064171 - 03을 통해 지원이 투자되었다.

1. 원위치 뇌 고정에 * 인산염 가득한 10 ML 주사기 (28 게이지 바늘)을 준비 호수 (PBS)가 버퍼. * PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 가득 10 ML 주사기 (28 게이지 바늘)을 준비합니다. 게시물에 대한 고정 PFA / PBS의 지역은 추가 5-10 ML. <ol><li> Avertin 또는 Nembutal의 치사량과 실험 마우스 intraperitoneally을 주사. </li><li> 마우스가 진정되면 에탄올과 복부를 습식 및 코크, 왁스, 또는 해부 핀을 사용하여 실리콘 엘라스토머와 계층 트레이의 하단에 마우스를 확보. 최대 마주 복부와 표면에 푸르 포스를 확보 - 가능한 한 그들처럼 넓은 확산. </li><li> 흉골의 수준에서 집게로 피부를 잡아, 간장을 폭로 십자형 했네요. 갈비와 횡경막 통해 옆으로 후 잘라. 리브 조직 플랩을 제거하고 심장에 액세스할 때까지 계속 절단. </li><li> 피어스 또는 싹둑 순환 혈액을 유출에 대한 권리 아트리움. </li><li> 좌심실을 통해 PBS의 재관류에 의해 순환 시스템에서 잔류 혈액을 플러시. </li><li> 같은 바늘 구멍을 액세스, 좌심실을 통해 PBS / PFA의 후속 재관류에 의해 전체 마우스를 해결할 수 있습니다. </li></ol> 2. 해부 및 뇌 추출 <ol><li> 두개골을 노출 anteriorly 피부를 당기는 다음, 귀 운하와 눈 주위 궤도 절단하여 머리, 목, 그리고 두개골의 피부를 제거합니다. *) 2.5 단계 2.2)의 그림에 대한 그림 2 참조 </li><li> 뼈 가위를 사용하여, 눈의에서 비강 turbinate 뼈를 통해 소켓을 십자형으로 잘라. 각 측면에 대해이 작업을 수행합니다. 크로스컷은 눈과 후각 구근을 앞쪽에 있어야합니다. </li><li> 각 귀 운하에서 안구 소켓에 세로로 잘라. </li><li> 작은 해부 가위를 사용하여, 다른 한 귀로 운하에서 소뇌를 overlying 후두 골 판 잘라. </li><li> 같은 해부 가위로 후각 전구의 수준에 정중선을 따라 anteriorly 했네요. </li><li> 포셉 사용하여 뼈를 리프팅 때 두뇌가 그대로 남아 있도록하는 결합 조직을 제거하는 간병, 두뇌에서 각 뼈 플레이트를 제거합니다. </li><li> 싹둑 광 및 두개골 신경은 상위 경추의 척추 잘라 및 정착액에 머리를 제거합니다. </li><li> 4 1-2 시간에 대한 사후 수정 ° C. 워시 3 회 15 분 PBS의 각. </li></ol> 3. 아가로 오스의 삽입 <ol><li> 용융 2% 고강도, 낮은 - 젤 포인트 아가로 오스 유형 IB (시그마 카탈로그 번호 : A0576) 전자렌지와 PBS 살린 인치 </li><li> 테스트 튜브에 녹은 아가로 오스를 전송합니다. 온도 평형까지 따뜻한 보육 또는 물 목욕 (40 ° -41 ° C가)에 넣어 테스트 튜브. </li><li> cyanoacrylate 접착제 (그림 3A)와 표본 주사기의 플런저에 접착제 고정 뇌 조직. 뇌 조각의 아가로 오스 고리의 이후 릴리스를 촉진하기 위해 뇌 조직의 표면에 포화 자당 - PBS 솔루션의 얇은 레이어를 브러쉬. </li><li> 플런저 주택 (그림 3B)으로 뇌 조직과 플런저를 그립니다. </li><li> 피펫 또는 뇌 조직을 덮고, 플런저 주택에 따뜻한 아가로 오스를 부어. 아가로 오스로 기포를 트래핑하지 마십시오. 아가로 오스의 공기 방울은 슬라이스의 품질을 손상됩니다. </li><li> 감기 (-25하기 위해 0 ° ° C) 1 분 아가로 오스 (그림 3C)을 설정 놀아요 차단합니다.와 표본 주사기 클램프 </li></ol> 4. Compresstome과 뇌의 슬라이스를 Sectioning <ol><li> Compresstome (그림 3D)으로 뇌 조직을 포함하고있는 표본 주사기 조립. </li><li> 표본 주사기의 콘센트 (그림 3E)와 밀접하게 면도날의 가장자리를 맞춥니다. </li><li> PBS 용액으로 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 표본 주사기의 아가로 오스 - 뇌 조직 블록을 밖으로 돌출 앞으로 마이크로 미터 한 조각의 두께를 돌리세요. </li><li> sectioning 과정을 시작하기 위해 Compresstome의 제어 장치에있는 &#39;시작&#39;버튼을 누르십시오. </li><li> 원하는 조각이 두께를 결정에서 구할 때까지 4.5) 단계 4.4) 반복합니다. </li><li> 튜브 또는 PBS (그림 3 층)으로 가득 얼룩의 우물에 브러시 또는 피펫과 함께 추수 뇌 슬라이스. </li></ol> 5. 광학 지우기 <ol><li> 글리세롤의 권 솔루션 : PBS 75% 권을 준비합니다. </li><li> 수집된 두뇌 조각에서 PBS 세척의 절반 볼륨에서 (또는 피펫) 하거라. </li><li> 글리세롤 / PBS로 제거 볼륨을 다시 추가합니다. </li><li> 4 부드러운 혼합과 평형을 허용 ° C 조각 싱크까지. </li><li> 최종 글리세롤 농도가 75 %에 도달할 때까지) 6.4 단계 6.2) 반복합니다. </li><li> PBS에 90 % 글리세롤과 솔루션을 교체하고 평형 수 있습니다. * 참고 : 글리세롤 솔루션을 추가하는 동안 공기 방울을 소개 안됩니다. 기포가 균일 equilibra 방해하기 때문에, 천천히 솔루션을 붓고 부드럽게 섞는다기하며 장착 슬라이드로 진행됩니다. </li></ol> 6. 슬라이스는 이미지에 대한 마운트 <ol><li> 마이크로 슬라이드 (Superfrost 플러스 25의 볼 수있는 영역에 맞게 개방 사각형으로 양면 씰 접착제 (SA - S - 1L, 그레이스 바이오 연구소) 컷 X 75 X 1mm, 고양이. # 48311-703, VWR ) 2~3mm 다양한 측면과 함께. </li><li> 피펫이나 페인트를 사용하여 접착 테이프 사각형의 중심 안쪽 뇌의 슬라이스를 놓습니다. 부드러운 흡인과 초과 글리세롤을 제거합니다. </li><li> 페인트 브러쉬로 원하는 순서대로 슬라이드 뇌 조각 마련. </li><li> 접착 테이프로 부드럽게 낮은 커버 유리 (24 X 60mm, 고양이. # 48383-139, VWR), 공기 방울을 소개하지 돌보는. 부드럽게 접착제 테이프와 접촉을 보장하기 위해 커버 유리에 압력을 적용합니다. </li><li> 슬라이드와 coverglass 사이의 가장자리에서 초과 글리세롤을 대기음. </li><li> 투명 매니큐어를 사용하여 밀봉 슬라이드 및 coverslip. </li><li> 이미징 전에 건조, 또는 4 슬라이드 상자에 장기간 저장하는 허용 ° C. </li></ol> 7. 대표 결과 : 가공, 이미징, 그리고 찬란 표시 뇌 조직을 분석은 신경 생물학의 연구에 필수가되었습니다. 이러한 조사의 대부분은 정교한 유전자 조작 모두 낮은과 고해상도 이미지를 분석하여 다음 타겟의 연결 하위 집합에서 기자 표현을 얻기 위해 필요합니다. 종종 실험 및 기술 한계는 불가능 같은 동물에서 이러한 유형의 데이터를 얻을, 또는 신속한 방식으로합니다. 이 도전에 형광 이미징 에이즈에 대한 광학 - 삭제, 세미 두께 뇌 부분의 준비. 유전자 조작 광견병 바이러스에 표시된 그대로 두꺼운 뇌 슬라이스의 예제는 표현 EGFP 수 있도록 설계하고, epifluorescent 및 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 그림 4에 나와 있으며, 각각 5 그림. epifluorescent 이미징을 위해 우리는 Leica M205 FA를 사용하고, 공촛점 이미지 수집을위한 우리 자이스 혈구 LSM 510를 사용합니다. 첨부된 프로토콜의 상대 단순 때문에,이 방법은 하루도 채 안의 처리 시간과 형광 기자를 표현하는 조직에서 유용하게 이미지 데이터를 항복 수 있으며, 모두 낮은과 높은 해상도 가벼운 현미경과 호환됩니다. 조사 추가 사후 라벨 방법, immunohistochemical 얼룩을 통합하거나 얇은 섹션을하도록 선택한 경우, 프로토콜은 따라 길게. 그러나, 위에서 설명한 방법은 그대로 두뇌의 핵심 기자 표현의 심사 패턴 간단하고 상대적으로 높은 처리량 방법을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 고정, 해부, 깔끔히, 삭제하고 준결승 두께 뇌 조각의 설치 절차를 diagraming 플로우 차트. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 그대로 마우스 머리를 추출하는 연속 절삭 단계 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. Compresstome를 사용하여 뇌 조직을 탑재하고 슬라이스하는 방법. superglue를 사용하여 플런저를 절단에 뇌 조직의) 배치. B) 아가로 오스의 포함을위한 플런저에 탑재된 뇌 조직 아래 그리기. C) 냉장 압축 블록을 사용하여 아가로 오스 두뇌 플러그를 응고. Compresstome 절단 챔버로 아가로 오스 두뇌 플러그와 플런저의 D) 삽입. 플런저 장치에 razorblade의 E) 정렬. Compresstome 버퍼 챔버로 뇌 조각의 F) 커팅 및 수집. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 강화된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 표현하는 전두엽 피질을 통해 글리세롤 - 삭제 뇌 조직에서 두꺼운 단면의 빛 현미경 이미지. 마우스 두뇌를 통해 A) 코로나 슬라이스 (두께 200 음)은 바이러스 벡터 표현 EGFP으로 표시하고 epifluorescent 입체경을 사용하여 낮은 해상도에서 몇 군데. 스케일 바, 2mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. 찬란 분류 층 5 / 삭제 두꺼운 뇌 슬라이스 6 대뇌 피질의 뉴런의 높은 배율 이미지. 강조 표시 영역 (그림 4)을 통해 최대 프로젝션 Z - 스택 (두께 150 음)의) 고해상도 공촛점 이미지. 스케일 바, 25 음.

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지앤 - 창족 콩이 문서에서 사용되는 제품을 제조 Precisionary 인 스트 루먼트 주식 회사의 직원입니다.

가벼운 현미경에 빠르게 화면, 이미지, 손상 뇌 조직 내의 신경 네트워크 분석은 귀중한되어 필요를 통해 조사의 연결 집합을 대상으로 형광 단백질을 사용하는 광범위한 응용 프로그램을 감안할 때. 사용자 친화적인 생체내 electroporation 기법에 바이러스성 벡터, 그리고 유전자 변형 마우스 종자의 개발에 기술적인 진보는 이제 조사를 표시 셀 종류의 겉보기 무...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th항목의&gt; 이름</th&gt;<th&gt; 회사 소개</th&gt;<th&gt; 카탈로그 번호</th&gt;<th&gt; 댓글 (옵션)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 뼈 가위</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt; - 또는 동급</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 해부 가위</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt; - 또는 동급</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 유형 IB 아가로 오스</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Precisionary 계측기</td&gt;<td&gt; VF - 200</td&gt;<td&gt; - 다른 vibratomes가 호환되는</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 더블 양면 접착</td&gt;<td&gt; 그레이스 바이오 연구소</td&gt;<td&gt; SA - S - 1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrost 플러스 슬라이드</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 커버 유리</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 글리세롤</td&gt;<td&gt; EMD 화학 주식 회사</td&gt;<td&gt; GX0185 - 6</td&gt;<td&gt; - 또는 동급</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

모두 기초 및 임상 신경 과학에 대한 근본적인 목표는 더 신원, 분자 메이크업, 그리고 정상과 질병 뇌 모두에서 뉴런에 특징 아르 연결의 패턴을 이해하는 것입니다. 이 무렵, 노력의 다량은 고해상도 neuroanatomical지도 1-3 건물에 위치하고 있습니다. 분자 유전학 가벼운 현미경의 진보의 확장의 연결 morphologies뿐만 아니라 쿼리 수있는 능력을 올뿐만 아니라, 개별 뉴런과 연결된 네트워크 4 분자 및 세포 메이크업이되고있다. 설치류의 유전자 변형과 유전자 타겟팅 기술을 통해 뉴런을 표시하고 조작할 수있는 능력의 주요 발전은 이제합니다 5-6에서 &#39;프로그램&#39;의 연결 집합에 수사관을 허용합니다. 확실하게, 현대 신경 과학에 가장 영향력있는 공헌 중 하나는 필수 기자의 끊임없이 확장 도구 상자 9 항복을 7-8, 그들의 후속 기술과 함께 해양 무척추 동물에 형광 단백질 (FPS) 인코딩 유전자의 발견 및 복제되었습니다. 이산의 연결 인구에서 타겟 FP 표현을 드라이브에 활용 세포 유형의 특정 발기인 활동은 이제 유전자 정밀 neuroanatomical 조사를 내실수가 있었죠. 뉴런의 엔지니어링 FP 표현은 크게 뇌의 구조와 기능에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 그러나, 깊은 뇌 조직에, 또는 3 차원 영상 개별 뉴런과 관련 네트워크, 도전 남아있다. 높은 지질 내용으로 인해, 신경 조직 오히려 불투명 전시 자동 형광입니다. 이러한 고유 biophysical 속성은 어려운 미크론 수십의 깊이 이상의 표준 epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 높은 해상도에서 찬란 분류 뉴런을 시각화 및 이미지를합니다. 이 과제의 수사를 회피하기 위해서는 종종 일련 박막 섹션 이미징 및 재건 방법 10, 또는 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 11 사용합니다. 이러한 방식으로 현재의 단점은 각각 관련 노동 집약적인 조직을 준비하거나, 비용 금지 기기입니다. 여기서는 광학 삭제 및 이미징에 의해 고정 세미 두께 마우스 뇌 조각의 찬란 레이블 세포를 시각화하기 위해 상대적으로 신속하고 간단한 방법을 제시한다. 첨부된 프로토콜에서는의 방법을 설명합니다 intracardial 재관류, 2) 해부 및 전체 두뇌의 제거, 3) 아가로 오스, 4 고정 뇌 포함) 새로운 vibratome 장비를 사용하여 정밀 세미 두꺼운 슬라이스 준비를 통해 현장에서 1) 고정 뇌 조직 , 5) 정산 두뇌 글리세롤 기울기를 통해 조직, 그리고 6) 가벼운 현미경과 Z - 스택 재건 (그림 1) 유리 슬라이드에 장착. 뇌 조각을 준비하는 동안 우리는 장비의 새로운 작품은 &#39;Compresstome&#39;VF - 200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html)를 호출 구현했습니다. 이 악기는 다른 vibratomes 함수를 유사한 기능을 갖춘 전동 사전 및 블레이드 진동 시스템을 갖춘 세미 자동 마이크로톰입니다. 다른 vibratomes 달리 얇게하는 조직은 스테인레스 스틸 실린더 내에 아가로 오스 플러그인에 마운트됩니다. 조직 원하는 실린더의 두께로 압출하고, 앞으로 발전 진동 칼날에 의해 절단. 아가로 오스 플러그 / 실린더 시스템은 재현성 조직이 장착 정렬 및 정밀 가공을위한 수 있습니다. 우리 손 안에있는 &#39;Compresstome&#39;수율은 전기 생리학, immunohistochemistry를위한 고품질의 조직 슬라이스하고, 직접 고정 조직 실장 및 이미징. 광학 삭제와 함께, 우리가 고해상도 형광 이미징을위한 세미 두께 고정 뇌 조각의 준비를 보여줍니다.

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

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Research

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Neuroscience

16.2K 조회수.  Baylor College of Medicine (BCM). 여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

연구

신경과학

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...