이 작품은 암에 대 한 V 학자 상 (V2014-004)와 V 학자 플러스 퍼듀 대학 센터에서 암 연구를 위한 V 재단과 미국의 암 사회 제도적 연구 그랜트 (ACS IRG 그랜트 58-006-53) 수상 (D2016-030)에 의해 지원 되었다 연구입니다. E. G. P. Borch 대학원 기금 상을 퍼듀 대학 약 화학 및 분자 약리학 부에 의해 지원 되었다.

1. 준비 <ol><li>소형 솔루션 버퍼 a: 0.3 M의 준비 100 mL 자당, 60 m m KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 그리고 0.5 %NP-40. 스토어 4 º C. 
	참고: 일부 셀 라인, HEK293T, 등 덜 엄격한 lysing 조건 필요합니다. 핵 lyse 쉽게를 사용 하 여 수정 버퍼 a: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 m m KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 m m EDTA, 0.1 %NP-40, 및 10% 글리세롤.</li>
	<li>2 x mRIPA 솔루션의 250 mL 재고 솔루션을 준비: 100 mM Tris pH 8.0, 2 %NP-40, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate.</li>
	<li>5 M NaCl 100ml 재고 솔루션 준비.</li>
	<li>1 x mRIPA 솔루션 50 mL 6 소금 농도의 각각에 대 한 준비 2 x mRIPA와 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여: 0 m m, 100 m m, 200mm, 300mm, 400mm, 및 500 mM NaCl. 실험을 시작 하기 전에 차가운 얼음에 모든 솔루션</li>
	<li>성장 세포 원하는 조건에서 라인. 
	참고: 때 단백질 노크의 효과, 최저 라인에 대 한 SSE wildtype 셀에 비교 해야 합니다. 이러한 SSE는 병행 하 여 수행 되어야 합니다. 예제를 보려면 화학 억제제 또는 자극을 사용 하 여, 섹션 3-5을 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. 기본 순차적 소금 추출 각 <ol><li>수확 8 백만 세포 그리고 얼음 차가운 PBS의 5 mL로 두 번 세척. 
	참고: 그것은 같은 수의 셀을 해당 단백질 농도가지고 중요 합니다. 세포의 정확한 수는 개별 셀 라인 또는 특정 단백질에 대 한 최적화 할 수 있습니다. 그건 중요 하지 너무 많은 단백질 농도 있는 증가 평형 바인딩에 따라 차입 곡선의 관찰을 하지 것 이다. 그러나, 너무 셀 수 충분 한 단백질, 곡선을 감지 하 고 chromatin 펠 릿은 어렵게 시키고 분수 사이 손실 될 수 있습니다.</li>
	<li>다시 버퍼 A의 1 mL + protease 억제제 셀을 일시 중단, 전송 1.5 mL 마이크로 원심 튜브, 그리고 10 분에 대 한 4 º C에서 하단에 회전 톱으로</li>
	<li>4 º C에서 5 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 핵 분리. 
	참고:이 단계 후 핵 여전히 해야 합니다 그대로. 핵 봉투 그대로 경우 펠 릿 다시 일시 중단 완전히; 그러나 때 봉투 lysed는 염색 질은, 펠 릿 하지 다시 일시 중단 합니다. 핵 봉투는 버퍼 A 부 화 후 그대로입니다, 사용 하 여 버퍼 A. 수정</li>
	<li>추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 핵 펠 릿을. 1 mL 피 펫과 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질. 그러나 펠 릿을 쉽게 중단 다시 한다,, 핵 pipetted는 고 샘플 및 끈 적 하 고 두꺼운 플라스틱 어렵다 될 것 이다 lyse 것입니다.
	<li>펠 릿을 끝으로, 원심 분리기 튜브의 하단에 대 한 피 펫 팁의 끝을 가볍게 하기 위해 <ol>. 일단 DNA는 핵에서 발표 하지만 pipetting 않으려고 그것을 깰 것 이다 펠 릿 완벽 하 게 분해 되지 것입니다</li>
	</ol></li> <li>때 샘플 균질 되었습니다, 모든 3 분 ice에 모든 샘플을 품 어 
	참고: 보육 시간 관심사의 단백질에 따라 최적화 되어야 할 수 있습니다.</li>
	<li>Centrifuging 6500 x g 4 º C에 3 분에 대 한 샘플 하 여 펠 릿 격리 chromatin.</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기를 전송 상쾌한 튜브. 이 0 mM 분수 될 것입니다. 이 0 mM mRIPA 솔루션 lysis로 세척 단계는 핵 역할 하 고 chromatin와 관련 되지 않은 모든 느슨한 단백질 제거 수.</li>
	<li>추가 200 µ L mRIPA 100 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 chromatin 펠 릿을. 15 번 위아래로 펠 릿 pipetting으로 chromatin 펠 릿 헤어. 
	참고:이 시간에 펠 릿 pipetted의 수와 일치 하도록 중요.</li>
	<li>3 분 동안 얼음에 품 어입니다. 이 인큐베이션 단계 여러 샘플 있을 때 특히 중요 하다는 평형 상태에 도달 하는 모든 샘플 수.</li>
	<li>4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>나머지 소금 농도 대 한 2.6-2.10 반복. 
	참고: 400 m m NaCl, 후 mRIPA 펠 릿 명확 하 고 효험이 고 튜브의 맨 아래에 유지 되지 않습니다. 펠 릿 절연 상쾌한 동안 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 놓일 수 있습니다.</li>
	<li>단백질 로드 x 4의 추가 70 µ L 각 분수를 염색 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 아크릴 아 미드 젤에 각 분수의 30 µ L 로드. 
	참고: 단백질의 바인딩 프로필을 확인, 그것은 로드 로드 보다 lysate, 동등한 단백질 농도의 동일한 볼륨에 중요 한.</li>
	<li>표준 서쪽 오 점 막에 전송 하 여 수행 하 고 기본 항 체를 사용 하 여 관심사의 단백질에 대 한.</li>
	<li>Quantitate는 chromatin에서 eluted 단백질을 적외선 형광 IRDye 2 차 항 체에 오와는 이미징 이미지 오 품 어. 개발의 다른 방법을 사용할 수 있습니다, 하는 동안 좋습니다 형광 또는 적외선 이미징, 그것은 자연에서 더 양적.</li>
	<li>사용 ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 각 소금 농도에서 eluted 단백질에 대 한 강도 계산. 소금 농도 대 한 밴드 강도 그래프, 관심사의 단백질의 차입 패턴 확인할 수 있습니다.</li>
</ol> 3. 순차적 소금 추출의 존재는 &#34; 리더 &#34; 억제제 <ol><li>셀 (4 백만)의 두 세트를 수확 하 고 표준 SSE에서 핵 분리.</li>
	<li>다시 mRIPA 0 m NaCl m의 200 µ L에 두 집합을 일시 중단 하 고 3 분 동안 품 어. 이것은 모든 무료 핵 단백질의 제거에 대 한 수.</li>
	<li>추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl 각 펠 릿을. 컨트롤 집합을 하나의 샘플을 DMSO (1 mM (+) JQ1의 2 µ L) 억제제를 추가.</li>
	<li>동요는 펠 릿으로 15 번 pipetting 및 5 분 ice에 품 어</li>
	<li>4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>모든 소금 농도 대 한 3.3-4를 반복 하 고 수행 하는 표준 서쪽 오 점.</li>
</ol> 4. 순차적 소금 추출의 존재는 &#34; 작가 &#34; 억제제 <ol><li>억제제 (10 µ M 사)와 세포 치료 또는 3 h. 위해 DMSO</li>
	<li>각 치료에 대 한 4 백만 셀 수확.</li>
	<li>억제제 모든 버퍼에 추가 된 샘플에 대 한 표준 SSE 수행.</li>
</ol> 5. 순차적 소금 추출 다음 DNA 손상 <ol><li>1 헤에 대 한 1 µ M 독 소 루비 셀 치료</li>
	<li>셀에 미디어를 변경 하 고 3 h. 위해 복구 하도록 허용</li>
	<li>8 백만 세포를 수확 하 고 기본적인 SSE 수행.</li>
</ol> 6. 비-순차 소금 추출 <ol><li>12 백만 세포를 수확 하 고 PBS로 세척.</li>
	<li>분할 세포는 마이크로 원심 튜브 당 2 백만 셀.</li>
	<li>버퍼 A의 500 µ L에 다시 일시 중단 하 고 10 분에 대 한 품 어</li>
	<li>6000 x g.에서 원심 분리 하 여 핵을 분리</li>
	<li>MRIPA 버퍼 + NaCl의 각각의 200 µ L에서 알 약을 다시 중단.</li>
	<li>1 mL 피 펫 팁 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질.</li>
	<li>3 분에 대 한 얼음에 품</li>
	<li>6500 x g에서 원심 분리 하 여는 chromatin를 분리 하 고 튜브를 청소 상쾌한 전송. 염료를 로드의 70 µ L을 추가 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 페이지 젤에 30 µ L을 실행.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

소금 기사를 통해 chromatin와 단백질 상호 작용의 일반적인 고용 되어 수십 년14,15; 그러나, 이것은 하지 되어 체계적으로 최적화 하기 전에 그것의 전체 유틸리티를 공개. 이 순차 방법 단백질 또는 환경을 변경 하는 때 chromatin 바인딩에 변화를 구별 하는 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. SSE 매우 적응 하 고, 최적화할 수 이며 중?...

진 핵 세포에서 DNA 규칙은 세포내와 세포 외 자극에 응답을 협조 하는 단백질의 구색에 의해 엄격 하 게 제어 하는 복잡 하 고 정교한 시스템 이다. DNA는 히스톤 octamers 느슨하게 DNA 따라 분포 하거나 꽉 코일1로 압축 될 수 있는 형태로 nucleosomes 주변 감 쌌 다. DNA와 히스톤의이 구조 배열 읽기, 쓰기 및 지우기 히스톤2포스트 번역 상 수정 (PTM)는 단백질의 네트워크에 의해 통제 된다 chromatin로 알려져 있다. 일부 히스톤 PTMs, acetylation, 등 그들은 히스톤과 DNA2사이 상호 작용을 변경, 입금은 아미노산의 변경. 히스톤 PTMs 모집 transcriptional 레 귤 레이 터, chromatin remodelers, DNA 손상 복구 기계, 및 게놈3의 특정 지역에 DNA 복제 기계를 또한 제공 합니다.
대부분 방법 chromatin 상호 작용을 공부 하 고 작은 규모의 상호 작용을 조사 하거나 큰 게놈 넓은 분석을 포함 합니다. 바인딩 연구 생체 외에서 종종 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 등온선 적정 열 량 측정, 형광 편광, 펩 티 드 pulldowns 등 분석 실험에서 히스톤 펩 티 드 또는 DNA 재조합 개별 도메인을 사용합니다. 이 분석 실험 일반적으로 개별 단백질 도메인에 초점을, 때문에 그들은 퍼즐의 작은 조각의 이해를 촉진 하지만 다중 단백질에서 협력 성격의 다중 도메인 단백질, 혼자 그들의 역할을 이해 하 고 우리를 허용 하지 않습니다. 단지입니다. 필연적인의 또 다른 레이어는 대부분 포유류 chromatin 수정 복합물의 이기종 구성에 의해 추가 됩니다. 이 단백질이 질 chromatin 프리의 동적 특성을 함께에서 하면 도전 하는 비보에 바인딩 chromatin 단백질의 상호 작용 chromatin 시험관을 정리 있습니다.
Vivo에서 방법을 만든 중요 한 발전; 그러나, 그들은 종종 비싼, 시간이 소모 및 기술적으로 도전입니다. 그러나 그것 요구 한다 상당한 최적화4chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 이어서 전체 게놈, 단백질 및 히스톤 수정 현지화를 결정 하는 데 매우 유용 하다. 단백질 상호 작용; 보존 하는 chromatin 가교 화 들은 그러나,이 인공 상호 작용을 일으켜서 고5마스킹 epitope를 발생할 수 있습니다. 또한, immunoprecipitations (IP) 매우 특정 항 체와 DNA 전단 및 칩-정량은 종종 사용할 수의 선험적으로알려진된 바인딩 사이트를 사용 하 여 IP 조건의 광범위 한 최적화를 필요로 합니다. 칩 조건의 최적화, 후 샘플의 처리 비용이 많이 드는 고 시퀀싱 분석을 개월에 몇 주를 요구 한다. 이 방법은 유용 하지만 게놈, 비용에서 단백질 바인딩된 chromatin의 지역화를 식별 및 약속 시간을 작은 변화 글로벌 바인딩 속성에 영향을 미칠 수 있습니다 방법에 대 한 가설을 생성 하려면이 메서드를 사용 하 여 금지 .
이 문서에서 우리는 chromatin-바인딩 단백질의 글로벌 바인딩 프로필을 검토 하 고 단백질, 복잡 한, 또는 글로벌 PTM 프로필에 변경 상호 작용을 변경할 수 있습니다 어떻게 구별 하는 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 사용 하는 방법을 설명 합니다. 소금 기사는 일반적으로 광범위 하 게 사용된 하는 기술, 어떻게이 순차적 방법은 매우 재현 가능 하 고 다양 한 설명 합니다. SSE 특성을 어떻게 복잡 한 또는 심지어 단일 도메인의 단일 소 단위 대량 chromatin에 대 한 복잡 한의 전반적인 선호도에 기여 수 있습니다. SSE 경우 단백질의 바인딩을 영향을 변화 chromatin 풍경에 의해 칩 seq와 다른 게놈 넓은 연구를 사용 하 여 확인 될 수 있는 히스톤 마크 대상에 대 한 흥미로운 가설을 제공 하는 결정을 하기 위해 사용할 수 있습니다.
우리는 원래 적응이 방법에서 우 외., Polybromo1의 기능 검사 (PBRM1) PBAF chromatin remodeler6,7의 바인딩에. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 PBAF chromatin 개장 하는 복잡 한 내에서 chromatin 바인딩에 대 한 PBRM1의 역할을 결정 하 고이 함수7에 6 개의 개별 bromodomains의 상대적 기여도 결정.
여기 우리가 화학 억제 물에 의해 단백질 chromatin에서의 변위를 검사를 다른 세포 유형, 단지, 수정 하는 비슷한 chromatin의 상대적 바인딩 선호도 평가에서 chromatin 바인딩 탐험이 방법을 최적화 하는 방법에 설명 하 고 chromatin 바인딩 chromatin 풍경에 변경 후의 효과 결정 합니다.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &gt;=99.9% (titration), crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&amp;uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>GLYCEROL, 1L</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1 antibody</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4 antibody</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Macron</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Bovine (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td></tr><tr><td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td><td>Macron</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td><td>Amresco</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td><td>Amresco</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine,for electrophoresis, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>22035-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>APROTININ, 10 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>20550-0.01</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>PEPSTATIN A, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>30100-0.005</td><td>Used for Protease inhibitor solution.</td></tr><tr><td>OVCA429 cells</td><td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A media</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power Source</td><td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Chromatin 대상으로 단백질의 바인딩 속성의 매우 chromatin의 복잡 한 본질 및 가장 포유류 chromatin 수정 복합물의 다른 유형의 자연 전하실 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 우리 chromatin 바인딩된 단지의 상대적 바인딩 선호도 평가 하기 위한 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 적응 시켰다. 이 쉽고 간단 분석 결과 비 전문가 바인딩 두 관련된 복합물, 복잡 한 소 단위는 손실 또는 개별 도메인 비활성화의 선호도 변화 및 변화에의 선호도에 상대적 차이 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. chromatin 가로로 변경 후 바인딩 선호도입니다. 순차적으로 다시 소금의 양을 증가에 대량 chromatin 중단, 우리 chromatin에서 특정 단백질의 차입을 프로 파일링 할 수 있습니다. 이러한 프로필을 사용 하 여, 우리 chromatin 수정 복잡 한 변경 또는 변경 chromatin 환경에 미치는 바인딩 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에 SSE 결합해, 개별 도메인 및 다양 한 염색 질 환경에서에서 복잡 한 기능에 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다 우리.

이 논문에서는, 장점과 우리 문학6에서 적응 하는 일반적으로 사용 되 순차적 소금 추출 (SSE) 메서드의 응용 프로그램을 설명 합니다. 그림 1, 우리는 비-순차적으로 ARID1a와 PBRM1의 차입 패턴을 감지 하 여 단백질을 추출에 SSE의 재현성을 비교 합니다. 우리는 지속적으로 ARID1a, BAF 소 단위 NaCl 및 PBRM1, 독점적인 PBAF 소 단위 200mm에서 주?...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.3K 조회수.  Purdue University. Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

연구

유전학

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

의학

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

암 연구학

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

생물학

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

크로마틴 면역침전반응

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...