This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. 셀 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포의 문화 (HBMEC) <ol><li> 세포 배양 플라스크의 코팅 <ol><li> 상기 피브로넥틴 용액을 제조 15 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 150 μL의 피브로넥틴을 넣고 잘 섞는다. </li><li> 바닥을 덮는 T-25 세포 배양 물 플라스크 피브로넥틴 용액 2 mL를 넣고. 배양기에서 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 세포 배양 플라스크를 인큐베이션. 피브로넥틴 코팅 된 플라스크를 37 ℃ / 5 % CO 2에서 2 주 동안 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 시드와 HBMEC의 세포 배양 <ol><li> 세포 배양 플라스크의 바닥에서 대기음 피브로넥틴 용액. 6 mL의 ECM-B 배지에 현탁하고 7.2 × 104 HBMEC / cm² 이상 추가 (= ECM-B는 5 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 %의 내피 세포 성장 보충 보충). 37 ° C / 5 % CO 2에서 인큐베이션. 현미경을 사용하여 매일 세포의 성장을 확인하십시오. </li><li> 3 일마다 매체를 변경합니다.수확 또는 HBMEC 약 80 %의 합류에 도달 분할 세포. HBMEC 생리적 특성의 손실을 방지하기 위해 통로 (1) 및 (15) 사이에 사용한다. </li></ol></li><li> 수확 HBMEC. <ol><li> 1의 비율로 PBS로 accutase (1X)를 혼합하여 용액을 제조 accutase 1. 추가 사용까지 수욕에서 37 ° C에서 accutase 솔루션을 유지합니다. </li><li> 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 배양 플라스크에서 ECM-B의 매체에 옮긴다. 세포 배양 플라스크의 바닥에 5 ㎖의 PBS를 추가하여 HBMEC 씻는다. 대기음 PBS 및 세척 단계를 두 번 더 반복한다. </li><li> 2ml의 accutase의 미리 가온 용액을 첨가. 2 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 그 후, HBMEC 단단히 세포 배양 플라스크을 여러 번 눌러 다시 일시 중지됩니다. 세포 분리는 현미경을 사용하여 제어 </li><li> 이전에 15 ㎖의 튜브에 저장된 ECM-B 매체 빨리 HBMEC을 분리하기 시작 다시 세포 배양 플라스크에 첨가한다. 대부분의 HBMEC이 될 때까지 반복 플라스크의 바닥을 씻어다시 중단. </li><li> 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 실온에서 10 분 동안 300 XG 원심 분리기. 상등액을 버리고 1 mL의 ECM-B 배지에서 세포를 다시 일시. 세포를 세어 용액 ECM-B 배지 당 3 × 105 HBMEC의 최종 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석. </li></ol></li></ol> 셀 문화 삽입 2. 준비 <ol><li> 세포 배양 삽입의 코팅 중요 사항 : 세포 배양 삽입의 막을 만지지 마십시오. <ol><li> 각 세포 배양 용 삽입 100 μL의 피브로넥틴 용액 (1.1.1 참조) (도 1a)와 96- 웰 편평 바닥 플레이트의 한 웰 (광 제어 웰)를 추가한다. 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 배양. 배양 대기음 피브로넥틴 솔루션 후. </li><li> 100 μL HBMEC의 세포 배양 삽입 정학 잘 광학 컨트롤을 추가합니다. 셀의 하부 구획에 600 μL ECM-B 매체 추가문화 삽입합니다. 37 ° C / 5 배리어 무결성 (도 1b)까지의 CO 2 %에 도달시 사일 아니라 광 제어에 HBMEC 현미경 평가하여 세포 성장을 확인 - 3 부화. 참고 : 사일 이상 세포 성장은하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 선택적 : 염증 상태를 모방하는 하부 구획의 매체를 흡인하고 24 시간 마이그레이션 분석 전에 500 U / ㎖의 IFN-γ / TNF-α 보충 ECM-B 배지로 교체한다. </li></ol></li></ol> 윤회의 분석의 날에 에반스 블루 3. 품질 관리 <ol><li> 에반스 블루 용액의 제조 <ol><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하여 200 μL의 B27 보충제와 PBS / B27 솔루션 믹스 10 mL의 PBS를 준비합니다. 에반스 블루 원액을 희석 (20 ㎎ / ㎖ PBS) 1 : PBS / B27 1,000. </li></ol></li><li> 에반스 블루 투과성 분석 <ol><li> 상부 구획이어서 하부 구획에서 매체 기음합류 HBMEC 단층을 함유 한 세포 배양 인서트. 세포 배양 삽입에 100 μL 에반스 블루 솔루션을 추가합니다. </li><li> 상기 하부 구획에 600 μL PBS / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO 2에서 60 분 동안 배양한다. 조심스럽게 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 제거합니다. </li></ol></li><li> 에반스 블루 측정 <ol><li> 상기 하부 구획에서 PBS / B27를 제거하고 블랙 폴리스티렌 96- 웰 평면 바닥 플레이트의 웰에 두 100 μL를 각각 전송. 테칸 무한 M200 프로 플레이트 리더로 플레이트를 삽입하고, Z 최적의 위치를 ​​결정한다. </li><li> (예 : 여기 620 nm의 방출 : 680 nm의 여기 대역 : 9 nm의 발광 대역 : 20 ㎚, 175x를 향상 25 개 깜박 통합 시간 : 20 μS) 에반스 블루 이용한 각 설정의 기준 여기. </li><li> HBMEC 장벽 기능이 씨앗 후 다른 시간 지점에서 HBMEC를 통해 에반스 블루 침투를 묘사 한 표준 곡선에 수집 된 데이터를 비교할 확인하려면보내고 셀 (우측도 1b). </li></ol></li></ol> 4. 마이그레이션 분석 <ol><li> 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 제조. <ol><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브에 10 mL의 RPMI를 추가하고 200 μL B27 보충제를 추가합니다. 5 분 동안 300 XG에 PBMC 세포를 원심 분리를 계산. 5 × 106 세포 / ml로 RPMI / B27 최종 농도 PBMC를 다시 일시. </li></ol></li><li> 마이그레이션 분석의 설정 <ol><li> 합류 HBMEC 단층 (도 1a)을 함유하는 세포 배양 물 삽입물의 상부 구획이어서 하부 구획에서 대기음 매체. 도너 단위 당 24 웰 플레이트의 한 웰 (시험관 제어)를 또한 세포 배양 인서트 100 μL PBMC 현탁액을 각각 추가하고. </li><li> 체외 제어 PBMC에 세포 배양 용 삽입 500 μL의 하부 구획에 600 μL RPMI / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO 2에서 6 시간 동안 배양한다. </lI&gt; </ol></li><li> 마이그레이션 된 PBMC의 수확 <ol><li> 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 꺼내 조심스럽게 멤브레인을 건드리지 않고 400 μL PBS와 바닥을 씻어. 세포 배양 삽입을 폐기하십시오. </li><li> 20 μL 유동 카운트 fluorospheres 추가 세포 배양의 하부 구획 (약 1,000 비즈 / μL)의 시험 관내 제어뿐만 아니라 넣고 잘 섞는다. 튜브 유동 세포 계측법 PBMC 현탁액을 수득 한 용액의 전송. </li></ol></li></ol> 5. 유동 세포 계측법 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG PBMC. </li><li> 100 μL에 형광 색소 - 컨쥬 게이트 항체를 첨가하여 항체 용액을 제조는 샘플 당 (PBS / 1 % BSA / 2 mM의 EDTA) 버퍼 유동 세포 계측법. 1 μL CD4-FITC 아래 제시된 결과, 1-μLCD3를 PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7 1 μL CD8-A700, 1 μL CD16-A750은 샘플 당 사용되었다. </li><li> PB를 다시 중단항체 용액 100 μL의 MC 및 4 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 250 μL를 5 분 동안 300 XG에 버퍼 원심 유동 세포 계측법에 추가. </li></ol></li><li> 샘플 획득 <ol><li> 필요한 양의 PBMC를 일시 중지 다시 버퍼의 유동 세포 계측법 (사용 사이토 흐름에 따라 다름). </li><li> 유동 계수 fluorospheres를 검출 (525) 및 700 nm 파장 간의 활성 검출기 플로우 사이토 미터를 사용하여 염색 PBMC 획득 (여기 488 nm의 발광 525 - 700 ㎚). (다음 단계 Kaluza G 소프트웨어 동작 사이토 Gallios 흐름이 사용되는 경우의 예이다 :. (1) 컴퓨터를 시작할 작동 시스템이 완전히 로딩 될 때 (2) 버튼 &quot;을 사이토의&quot;를 누름으로써 플로우 사이토 시작할 . (3) &quot;오픈 프로토콜&quot;버튼을 누름으로써 각각 획득 프로토콜로드. (4)에 필요한 프로토콜을 선택하고 &quot;열기&quot;를 선택한다. (5)과 우측 클릭하여 각 시료에 대한 프로토콜 중복가상 회전 목마 &quot;중복&quot;필드에 왼쪽 클릭에 표시 프로토콜에 마우스 버튼을 클릭합니다. (6) 샘플에서의 각각의 샘플에 라벨. (7) 슬라이드 쇼의 표시 위치에 샘플을 전송 및 획득을 시작한다.) </li></ol></li><li> 샘플 분석 <ol><li> 각각의 소프트웨어를 사용하여 데이터 흐름 계측법 열기 결과. 체외 대조군 웰의 PBMC transmigrated 대한 관심뿐만 아니라 세포 개체군의 수를 결정하고, 각 분석 소프트웨어를 사용하여 카운트 fluorospheres 흐름. (게이팅 전략의 예 (도 께 결과 1 부 C가 주어진다 : 전방 산란 채널 (FSC) 플롯 대 측방 산란 채널 (SSC)에서 림프구를 선택 우선, NK 세포 서브 세트의 윤회를 분석 림프구이다. 다음 CD56 플롯 대 CD3 및 CD56 + CD3 표시 -. NK 세포가 선택 NK 세포의 부분 집합을 구별하는, NK 세포에 표시되는CD56 CD16 CD56 대 플롯 및 밝은 CD16 / 어둡게 -뿐만 아니라 CD56 + CD16 희미 NK 세포가 선택된다. 또한, 유동 계수 fluorospheres 그들의 수를 결정하는 시간에 대한 525 내지 700 nm의 사이에 발광 갖는 채널의 그래프에 표시된 후속 FSC 대 SSC 플롯으로부터 선택된다.) </li><li> 각 샘플의 총 세포 수를 계산하기 위해, 유량 계수를 사용 fluorospheres 세포의 검출 수를 정규화 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> 이전 총 세포와 시험 관내 제어 총 셀 간의 비율로서 이전 셀의 비율을 결정한다. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

여기서 우리는 인간의 혈액 - 뇌 장벽에 걸쳐 림프구의 윤회를 조사하기 위해 기술을 제시한다. 중추 신경계에 림프구 이동의 체외 분석에서 림프구의 혈관 외 유출, 잠재적 인 질병 관련 변경 및 새로운 치료 방법의 기본 프로세스를 연구하는 것이 중요하다. 혈액 - 뇌 장벽 모델의 몇 가지 수정이 가능합니다. 예를 들어, 상기 상부 구획으로부터 세포 이주되지 않은 ?...

조직에 혈액에서 림프구 마이그레이션은 면역 감시 중요하다. 특정 분자 상호 작용의 시퀀스는 소장, 피부, 림프절, 중추 신경계 (CNS), 및 기타 조직으로 한 부위 특이 적 혈관 외 유출을 보장한다. 림프구 이동에 변화가 넓은 확산 질환이 다수의 병태 생리에 참여하고 있습니다. 면역 특권 CNS로 마이그레이션 단단히 통제 목적에 따라이 프로세스의 변화는 뇌척수염 3, 시신경 척수염, 뇌졸중, 및 다발성 경화증 (MS) 2, 4, 5, 6, 7과 같은 CNS 관련 질환에 관여한다. 따라서 더 나은 질병의 병태 생리를 이해하고 도구를 개발하는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 것이 중요하다<html> 질병 부담이 8, 9, 10, 11, 12의 간척. 림프구는 별개의 경로를 통해 중추 신경계로 이동한다. 혈액 - 뇌 장벽 맥락총 내의 전역 혈액 - 뇌척수액 장벽을 통해 거미 막밑 공간에 모세관 세정맥을 통한 혈관 외 유출 1, 13, 14, 15가 설명되었다. 뇌 혈관 장벽을 통과 마이그레이션은 내피 세포 (14)와 림프구의 상호 작용에 의해 수행된다. 주변부에서 내피 세포는 대조적으로, CNS의 내피 세포함으로써 엄격 혈액 - 뇌 장벽을 횡단 할 수있는 세포와 단백질의 양을 제한하는 단단한 접합부 분자의 높은 발현 양아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 16. 단단히 접합 염증 완화 결과 및 부착 분자의 발현을 유도한다; 따라서, CNS 1, 17, 18로 림프구 이동을 향상. 혈액 - 뇌 장벽을 통해 혈관 외로 유출 다단계 과정이다. 내피 세포 테더 림프구 다음 주로 셀렉틴 1 (15)에 의해 매개되는 과정에서 내피 굴러. 이어서, 림프구상에서 발현 내피 세포에 의해 분비 케모카인 및 각각의 케모카인 수용체 간의 상호 작용함으로써 내피 세포를 1 밀착성을 촉진 인테그린의 구조적 변화를 유도한다. 마지막으로, 혈관 주위 공간으로 transmigrating 전에 혈액의 흐름에 대한 내피 장벽을 따라 하나 크롤링을 림프구, 즉시 직접 기어 박스 실속확고한 부착 1, 19, 20의 사이트 igrate. 림프구의 혈관 외 유출의 이러한 모든 단계는 별개의 기술 (21)를 사용하여 체외에서 분석 할 수 있습니다. 시간 경과 비디오 현미경은 초기 테 더링 및 15 롤링을 연구하는 데 사용됩니다. 접착 분석은 장벽 (22) 내피 회사 체포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 여기에서 입증 된 바와 같이 윤회 분석은 면역 세포 윤회 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의 분석을 허용한다. 체외 혈액 뇌 장벽 모델에서 인간을 사용하여, 우리는 더 높은 마이그레이션 백분율이 보여 최근 수CD56 밝은 CD16의 atory 용량 / 어두워 - NK 세포 CD16 + 대조 물이 막내 실 21이 NK 세포 서브 세트의 우세에 의해 반사 된 희미한들은 CD56에 비해. 따라서, 우리의 실험 장치는 생체 내 상황을 모방하기에 적합한 것 같다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>without CaCl2 or MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin 1mg/mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 cell culture flask</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBMEC</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pelobiotech</td>
			<td>PB-H-6023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-b</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth supplement</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>clear, 6.5mm diameter, 3.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50x concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200Pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black flat bottom plate</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>675086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Count Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios 10-color flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza 1.5a</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300430</td>
			<td>clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-PC7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A21692</td>
			<td>clone N901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16-A750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66330</td>
			<td>clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300506</td>
			<td>clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-A700</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66332</td>
			<td>clone B9.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

중추 신경계 (CNS)에 넘쳐 림프구는 면역 감시 중요하다. 림프구의 혈관 외 유출의 질병 관련 변경은 CNS의 병태 생리 학적 변화 될 수 있습니다. 따라서, CNS에 림프구 이동의 조사 염증성 CNS 질환을 이해하고 새로운 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 체외 모델을 제시한다. 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC)는 confluently 혈액 - 뇌 장벽의 내피를 모방 삽입 트랜스 웰 다공성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 상에 성장된다. 배리어 기능 zonula occludens 면역, transendothelial 전기 저항 (티이)의 측정뿐만 아니라, 에반스 블루 투과 분석에 의해 확인된다. NK 세포를 -이 모델은 / 어두워 CD56 밝은 CD16으로 드문 림프구 아형의 diapedesis의 조사를 할 수 있습니다. Furtherm철광석, 다른 세포, 사이토 카인 및 케모카인, 질병과 관련된 변경, 및 림프구의 이동성에 대한 구별 능력 치료법의 효과를 연구 할 수있다. 마지막으로, 내피 장벽의 염증성 자극의 영향뿐만 아니라, 다른 치료법이 분석 될 수있다.

NK 세포 및 인간 혈액 - 뇌 장벽 모델 (도 1A)를 사용하여 T 세포의 서브 세트 윤회를 나타내는 대표적인 결과를 나타낸다. HBMEC 단층의 무결성은 단단히 접합 분자 ZO-1, transendothelial 전기 저항 (티이) 측정 및 에반스 블루 투과 (도 1b)의 염색에 의해 확인 하였다. 다음 3 - 사일 배양 HBMEC가 꽉 접합 분자 ZO-1 (왼쪽 그림 1B 등)를 표시했다. 또?...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

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연구

면역학 및 감염병학

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

개발<em&gt; 체외</em의 상호 작용을 연구&gt; 모델 시스템<em&gt; 에쿠스</em&gt;<em&gt; caballus</em높은 친 화성 수용체 FcεRI에&gt;의 IgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...