림프구 환전은 면역 반응의 중요한 특징입니다. 따라서, 이 프로토콜은 연구원이 잘 정의된 체외 시스템에서 림프구의 이동성을 평가할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 케모키네가 군 2선 림프구 세포 또는 ILC2와 같은 최근 정의된 세포에서 이주를 유도하는 효과를 결정하기 위해 평가될 수 있다는 것이다.
두 번째 장점은 특정 케모키네 경로를 차단하는 것을 목표로 억제제 또는 생물학적 치료가 동물과 더 비싼 실험을하기 전에이 방법에 의해 테스트 될 수 있다는 것입니다. 그룹당 2~3마리의 동물을 사용하여 안락사 된 ova 처리 된 남성과 여성 마우스에서 폐와 비장을 절제하는 것으로 시작합니다. 조직 유형 및 동물 성별에 따라 별도의 해리 튜브에 절제된 조직을 배치합니다.
폐 조직을 500 마이크로리터의 폐 해리 튜브에 해리 튜브를 배치하고, 튜브를 자동화 된 조직 해리에 배치하고 폐 프로토콜을 사용하여 해리시화한다. 총 두 번 이 단계를 반복합니다. 비장을 소독하려면, 소각에 완전한 RPMI 미디어의 500 마이크로 리터에 배치 한 다음 비장 프로토콜을 사용합니다.
지금부터 멸균 기술을 사용하여 생물학적 안전 캐비닛에서 작업하고, 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 각 해리 된 조직을 필터링하고 50 밀리리터 원판 튜브로 수집합니다. 폐 균질화관을 함유한 해리튜브를 추가 폐 소화 매체의 5밀리리터로 헹구고, 비장을 함유한 튜브는 완전한 RPMI의 5밀리리터로 균질화하고, 해당 조직에 사용되는 필터를 통해 내용을 필터링한다. 폐 조직을 더 해리하기 위해 폐균질을 37도 의 이산화탄소로 37도 의 섭씨 인큐베이터에서 15~30분 동안 배양합니다.
그런 다음 폐와 비장 균질화 및 원심분리기 모두에 완전한 RPMI의 5 밀리리터를 추가합니다. 상체를 폐기한 후, 같은 성별의 동물 군으로부터 비장세포와 폐세포를 함유한 펠릿을 단일 50밀리리터 원내 튜브로 결합한다. 각 튜브에 10밀리리터의 완전한 RPMI를 추가하고 다시 중단합니다.
자동화된 셀 카운터를 사용하여 총 셀 수를 결정합니다. 분리 버퍼에서 밀리리터 당 1억 개의 세포로 수컷 및 암컷 세포 현탁액을 조정한 다음 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 추가합니다. 원고에 설명된 바와 같이 총 세포의 2/3에서 2개의 선천성 림프구 세포를 격리한 후, CD4 양성 T 세포 격리 절차에 대한 나머지 세포를 사용한다.
CD4 양성 T 세포 격리를 시작하려면 CD4 T 세포 농축 현탁액에 쥐 혈청을 추가합니다. 그런 다음 세포 샘플에 격리 칵테일을 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 30초 동안 소용돌이가 급속한 구체를 만들고, 셀 샘플에 추가하여 밀리리터당 75마이크로리터의 희석을 달성한다.
부드럽게 혼합하고 실온에서 2 1/2 분 동안 배양하십시오. 최대 3밀리리터의 분리 버퍼약 2밀리리터로 시료를 얹고, 5밀리리터 튜브를 8챔버 간편 분리 자석에 넣고 실온에서 5분간 배양합니다. 그런 다음 자석을 앞으로 팁, 깨끗한 5 밀리 리터 튜브에 각 셀 서스펜션을 파이펫.
각 튜브와 원심분리기에 1.5 밀리리터의 세럼 프리 RPMI를 추가합니다. 상체를 부어, 혈청없는 RPMI에서 밀리리터 당 1천만 세포에서 CD4 양성 T 세포 펠릿을 다시 중단. 프로토콜의 이 부분을 시작하려면 원고에 설명된 ILC2 및 CD4 양성 T 세포 모두에 대한 실험에 필요한 Transwell 삽입수를 결정합니다.
파이펫 팁과 장갑을 낀 손으로 동일한 24웰 플레이트의 상단및 하단 행으로 24웰 플레이트의 중간 줄에서 3미크로닌 트랜스웰 인서트를 부드럽게 이동합니다. CCL17과 함께 500 마이크로리터의 마이그레이션 미디어를 24웰 플레이트의 중간 줄에 우물의 1/3로 추가합니다. CCL22를 사용하여 500마이크로리터의 마이그레이션 미디어를 우물의 또 다른 1/3에 추가합니다.
그리고 마지막으로, 우물의 마지막 1/3에 화학모키네를 함유하지 않은 세럼이 없는 RPMI 500마이크로리터를 추가합니다. 하단 웰에 배치된 적절한 마이그레이션 미디어의 이름으로 플레이트의 뚜껑을 명확하게 레이블을 지정합니다. 그런 다음 트랜스웰 인서트를 다양한 치료법을 포함하는 우물에 다시 배치합니다.
CD4 T 셀 또는 ILC2 의 100 마이크로리터를 각 인서트의 상단 우물에 부드럽게 추가하여 트랜스웰에서 셀 서스펜션을 위아래로 혼합하거나 파이펫하지 않도록 합니다. 각 웰에 배치된 셀 타입으로 플레이트의 뚜껑을 명확하게 표시하고 세포가 첨가된 날짜와 시간을 적어 둡니다. 모든 세포가 매체를 가진 Transwell 인서트에 배치될 때까지 플레이트에서 Transwell 삽입을 제거하는 것부터 시작하는 이 과정을 반복합니다.
관심있는 세포가 고립되면, 가장 중요한 단계는 특히 우물에 배치 된 케모키네 및 세포 유형을 추적하고, 상단 챔버에 세포를 부드럽게 추가하고, 마지막으로 48 시간 배양 동안 환원 플레이트와의 불필요한 접촉을 피하는 것입니다. 플레이트를 37도 의 섭씨 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 부드럽게 배치하고 48시간 동안 배양하여 인큐베이션 기간 동안 플레이트와의 접촉을 최소화하십시오. 인큐베이터에서 플레이트를 부드럽게 제거한 후 중간 행에서 모든 Transwell 삽입을 바로 위 또는 아래 빈 우물로 제거합니다.
CCL17, CCL22 또는 미디어, 셀 유형 및 복제 번호로 표시된 튜브에 Transwell 삽입물의 위쪽 및 하단 우물에서 세포를 수집합니다. 1x PBS의 500 마이크로리터로 하단 우물을 헹구고 해당 튜브로 수집하고 상단 우물에서도 동일한 작업을 수행합니다. 5 분 동안 실온에서 378 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다.
파이펫을 사용하여 모든 수퍼나티를 부드럽게 제거한 다음 T 셀 및 ILC2 펠릿을 1x PBS 50 마이크로리터로 재축합니다. 세포 현탁액의 마이크로리터 10을 제거한 후 90마이크로리터를 0.4%의 트라이팬 블루로 추가합니다. 자동화된 셀 카운터의 셀을 계산합니다.
그리고 각 샘플에 대해 밀리리터당 생존력과 세포 수의 백분율을 기록하고, 상부 및 하단 챔버에서 치료당 총 세포 수를 결정한다. CCR4 발현이 유동 세포측정에 의해 CD4 양성 T 세포와 ILC2 모두에서 평가되었을 때, 남성과 여성 호스트 사이에는 차이가 없었습니다. 그러나, ILC2에 대한 세포별 기준으로 CCR4의 발현은 CD4 양성 T 세포에 비해 높았다.
트랜스웰 장치의 바닥 챔버가 처리되지 않은 세포 배양 매체, CCL22 를 포함하는 배지 또는 CCL17을 포함하는 매체로 채워졌을 때, 세포의 14% 미만이 미디어 제어 조건에서 마이그레이션되었다. CCL22에 응하여, 둘 다 세포 모형은, 남성 또는 여성 호스트에게서 왔는지에 관계없이, CCL22에 반응했습니다. 또한, CCL22는 남성 ILC2에서 CCL17보다 더 큰 이주를 유도했다.
한편, CCL17은 미디어에 비해 여성 CD4 T 세포 및 ILC2의 상당한 이주를 유도하였다. CCL17 치료는 남성 CD4 양성 T 세포 또는 남성 ILC2에 대한 미디어와 다르지 않았다. 최적이 아닌 조건에서, CD4 셀을 가진 플레이트가 처음 24 시간 동안 실온에 남아 인큐베이터로 이동했을 때 CCL22 및 CCL17로의 이주가 없었습니다.
더욱이, 세포의 생존가능성은 바닥 챔버내의 세포에 대해 특히 낮았으며, 최적의 결과를 달성하기 위해 이 프로토콜에 기재된 올바른 온도 및 조건을 사용하는 것의 중요성을 나타냈다. 마이그레이션 절차가 완료되면 미디어 제어 우물과 비교하여 관심 있는 케모키네로상당한 마이그레이션이 표시됩니다. 중요한 마이그레이션이 보이지 않는 경우 절차가 제대로 작동하지 않거나 림프구가 문제의 chemokine에 반응하지 않는다고 가정 할 수 있습니다.
이 기술은 그 림프구가 생체 내 처리의 넓은 범위를 겪었을 때 림프구 이동을 이해하기 위하여 광범위하게 이용될 수 있습니다.
