이 프로토콜은 메타볼로믹스, 프로테오믹스 및 리피도믹, 핵 자기 공명 분광법 플랫폼을 사용하여 질량 분광법을 모두 사용하여 단일 시료의 포괄적이고 편견없는 분자 특성화를 위한 방법을 설명합니다. 이 접근법의 중요성은 우리가 대사와 분해 경로를 추론할 수 있도록 분자의 다른 모형을 확인해서, 게놈의 생물학 계통 하류를 특성화할 수 있다는 것입니다. 순차추출 기법은 물을 이용한 생체 이용 가능, 극성 화합물을 추출한 다음 MPLEx가 단일 샘플에서 단백질과 지질뿐만 아니라 추가극성 화합물또는 대사산물을 포획합니다.
이 방법의 시각적 데모는 두 번째 추출 단계에서 세 개의 레이어를 분리하고 다른 분석 기기 간에 추출을 분할하여 과학자를 안내하기 때문에 중요합니다. 통합다중 오믹 분석은 복잡한 생물학적 시스템에 대한 보다 효과적인 조사와 완전한 이해를 제공합니다. 이 견고한 방법은 다양한 분자를 추출하며 다양한 샘플 유형에 적용됩니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 수집 및 준비로 이 절차를 시작합니다. 에탄올 세척, 스테인레스 스틸 기구를 사용하여, 각 건조 된 샘플의 50 밀리그램을 개별 2 밀리리터 유리 튜브에 넣습니다. 각 샘플에 증류된 탈가스물을 1밀리리터추가 합니다.
그런 다음 바이알을 캡하고 셰이커 테이블에서 2 시간 동안 흔들어 줍니다. 30분 동안 15,000배의 중력으로 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 솔루션이 실온에서 20 분 동안 서 있도록 하십시오.
각 샘플에서 상체를 저장합니다. 이러한 추출 단계를 반복하여 현재 추출된 잔류물에 MPLEx 추출을 수행합니다. 증류, 탈가스물에 대한 메탄올 혼합물에 영하 20도 섭씨 4~3도클로로포름을 대체한다.
신중하게 파이프팅에 의해 상단 레이어를 제거하여 시각적으로 구별 될 두 가지 결과 용매 층을 분리합니다. 동결 건조기에서 낮은 비 극성 층을 건조. 건조하자마자 다음 며칠 내에 분석하면 클로로폼 5개소와 메탄올 195마이크로리터를 추가합니다.
4ier 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분광에 대한 전기 분무 이온화 효율을 향상시키기 위해, 직접 주입에 의해 약식 FTICR-MS. 메탄올에서 1대 1의 클로로폼 추출물을 희석시키고, 메탄올에서 2대 1의 수질 추출물을 추출한다. FTICR-MS에 약 100~1, 300달톤의 질량 범위에 걸쳐 조정 용액100마이크로리터를 직접 주입하여 FTICR 분광계를 교정합니다.
전기분무소 이온화 원에 수완강 풀빅산 표준의 마이크로리터 100마이크로리터를 직접 주입한다. 주사기 펌프를 통해 FTICR 분광계에 결합하여 분당 3.0 마이크로리터의 유량으로 설정됩니다. 바늘 전압을 양수 4.4 킬로볼트로 설정합니다.
1-100 질량을 충전하여 180°C의 유리 모세관을 큐에 담급다. 분석 소프트웨어를 사용하여 결과 스펙트럼을 검사하여 데이터의 품질을 확인합니다. 이제 분당 3.0 마이크로리터로 설정된 주사기 펌프를 통해 FTICR 분광계에 결합된 전기분무분화 원에 직접 주입을 통해 각 추출물의 100마이크로리터를 도입한다.
매개 변수를 이전과 같이 설정합니다. 탄소 농도의 변동을 고려하여 각 샘플 또는 샘플 그룹에 대한 이온 축적 시간을 조정합니다. 각 샘플에 대해 144개의 스캔을 수집하고 스캔을 평균한 다음 상동성 CH2 계열을 사용하여 내부 교정을 수행합니다.
농축기를 사용하여 추출물을 건조시키고 후속 가스 크로마토그래피 질량 분광법, 액체 크로마토그래피 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광분석을 위해 추출물의 나머지 부분을 저장합니다. GC-MS를 준비하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 빈 제어 샘플을 준비합니다. 카비놀 그룹을 보호하기 위해 파라다인의 밀리리터 메톡사민 염산염당 20밀리리터를 메탄올 추출물, 물 추출물, 블랭크 및 FAME 교정 샘플을 포함한 각 샘플에 추가합니다.
대문자로 바이알을 밀봉합니다. 추출물을 20초 동안 소용돌이치게 한 다음 추출물을 60초 동안 초음파 처리합니다. 100배의 중력에서 90분간 섭씨 37도에서 추출한 추출물을 원심분리합니다.
각 샘플에 1%트리메틸클로로실레인으로 MSTFA 80마이크로리터를 추가합니다. 이전과 같이 추출물을 소용돌이게 하고 초음파 처리한 후, 100배 의 중력에서 30분 동안 37°C에서 추출물을 다시 원심분리합니다. 냉각 추출물을 실온으로 냉각한 후 GC-MS 자동 샘플러 바이알로 옮김합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 GC-MS 분석 및 데이터 처리를 진행합니다. 액체 상태 NMR 분석을 준비하기 위해 5 밀리머 DSS 내부 표준으로 나머지 물 추출물을 10%까지 희석시하십시오. 혼합물을 고품질의 3mm 외경의 borosilicate 유리 NMR 튜브로 옮길 수 있습니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 NMR 분석 및 데이터 처리로 진행합니다. LC-MS 리피도믹스 분석을 수행하려면 각 추출물의 10마이크로리터를 역상 충전 표면 하이브리드 컬럼을 사용하여 Orbitrap 질량 분광계에 결합하여 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템에 주입합니다. 분당 250 마이크로리터의 유량으로 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 34분 그라데이션을 설정합니다.
더 높은 에너지 충돌 해리와 충돌로 인한 해리와 함께 음수 및 양성 이온화 모드를 모두 사용합니다. 프로테오믹스 분석을 수행하기 위해, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 메탄올 단계의 나머지 부분에 대한 MPLEx 프로토콜에 따라 단백질을 추출한다. 토탄은 미국 미네소타의 변화하는 환경 이나 SPRUCE 사이트에서 가문비 나무와 토탄 응답에서 S1 수렁의 깊이와 비교되었다.
3, 312효소는 프로테오믹스 분석에서 확인되었다. 깊이를 가진 효소 활동의 분석은 효소의 수가 SPRUCE 보그에서 15 센티미터와 45 센티미터 사이에서 급격하게 감소한다는 것을 보여줍니다. 사이트가 대사 산물 및 효소 활동에서 어떻게 다를 수 있는지 보여주기 위해 SPRUCE 결과는 스웨덴 북부의 퍼머프로스트 보그와 펜의 결과와 비교됩니다.
전체 67, 040 대사 산물은 FTICR-MS, NMR, GC-MS 및 LC-MS 분석의 조합으로부터 모든 SPRUCE 토탄 샘플에서 확인되었다. 여기에 다른 깊이에서 다양한 기술을 통해 식별 된 다른 화학 클래스의 상대적 분획이다. 아미노산과 설탕은 깊이로 감소하는 동안, 이것은 지질에 대 한 관찰 되지 않습니다.
KEGG 데이터베이스에 대한 모든 분석에서 확인된 대사 산물을 교차 검증함으로써 확인된 화합물이 트리카박스실산 주기, 글리코리시스 및 당 대사와 같은 일반적인 대사 경로에 관여하는 것으로 확인되었다. 이 절차 전반에 걸쳐 잠재적인 오염 원인을 인식하는 것이 중요합니다. 분석을 통해 샘플 수집에서 시작하여 샘플은 이온화에 부정적인 영향을 줄 수 있는 페깅 플라스틱과 접촉해서는 안 됩니다.
추출 절차 중에 사용되는 많은 용매는 위험하거나 인화성이 있습니다. 항상 피부와 눈접촉을 방지하고 오염시 오염을 피하기 위해 적절한 PPE를 착용하십시오.
