이 작품은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (보조금 번호 154833) 및 Universidad Nacional Autónoma de México에서 지원되었습니다. 저자는 Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos 및 Soledad Juárez에게 행정적이고 기술적 인 조언을 해주신 것에 감사드립니다.

1. CAPRRESI 프로토콜 참고 : 그림 1 은 전체 CAPRRESI 프로토콜을 나타냅니다. 이 기술은 in silico 디자인과 원하는 키메라의 후속 구성을 기반으로합니다. <ol><li> 클로닝 플라스미드, pUC18 또는 pUC19의 선택. <ol><li> 기술적 인 요구에 가장 적합한 pUC 벡터를 선택하십시오. 참고 : 두 벡터는 다중 복제 사이트의 방향을 제외하고는 동일한 순서를 갖습니다. 이것은 올리고 뉴클레오티드의 디자인과 PCR 플라스미드 파괴에 중요합니다. </li></ol></li><li> 야생형 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열에 대한 in silico 분석. <ol><li> 야생형 유전자의 DNA 서열을 얻어 FASTA 형식 파일 ( 예 : genes.fas)에 저장하십시오. 참고 : pUC18 / 19 벡터의 시퀀스는 pUC.fas 파일에 포함되어 있습니다 ( 그림 1 , 1 단계). </li><li> 어떤 제한 enz 결정ymes는 REsearch.pl 스크립트를 실행하여 wildtype 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열을 절단하지 않습니다. 또는 온라인 도구로 제한 효소 사이트 검색을 수행하십시오 ( 그림 1 , 2 단계). <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl REsearch.pl 유전자. perl REsearch.pl pUC.fas 참고 :이 명령은 다음 출력 파일을 생성합니다 : genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas 및 pUC_re.fas. </li><li> genes_re.fas와 pUC.fas 파일을 비교하여 선택한 pUC18 / 19 벡터의 다중 복제 사이트로 wildtype 유전자를 복제하기위한 적절한 제한 효소를 선택하십시오. pUC18 / 19 벡터의 암피실린 내성 유전자 ( ampR )에 상대적인 인서트의 방향을 선택하십시오. </li></ol></li><li> 야생형 유전자 (외부 올리고 뉴클레오타이드)의 코딩 영역을 증폭시키기 위해 포워드 및 리버스 올리고 뉴클레오티드를 디자인하십시오. 각 5 &#39;말단에 적절한 제한 효소 부위를 포함시킨다.올리고 뉴클레오티드; 이것은 삽입 방향을 정의합니다. <ol><li> 포워드 올리고 뉴클레오타이드에 기능적 리보솜 결합 부위를 포함시킨다. </li><li> 벡터 내에서 동일한 방향으로 두 야생형 유전자를 삽입하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 키메라 어셈블리 및 플라스미드 파괴에 대한 파괴 영역의 선택. <ol><li> translate.pl 스크립트 ( 그림 1 , 3 단계)를 실행하여 wildtype과 ampR 유전자의 아미노산 서열을 얻습니다. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl translate.pl 유전자. perl translate.pl ampR.fas 참고 :이 스크립트는 다음 출력 파일을 생성합니다 : genes_aa.fas 및 ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> 두 가지 야생형 아미노산 서열을 적절한 소프트웨어 ( 예 : 근육)로 전역 정렬하십시오. </li><li> 키메라 asse에 대한 원하는 휴식 영역 (3-6 아미노산)을 선택하십시오mbly. 파일을 FASTA 형식의 파일 ( 예 : regions.fas)에 저장하십시오. </li><li> 두 가지 야생형 유전자에서 선택된 아미노산 스트레치를 코딩하는 DNA 서열을 찾습니다. </li></ol></li><li> 제한 효소 사이트를 포함하는 동의어 DNA 시퀀스의 in silico 세대. <ol><li> 절단 영역으로 선택된 각 아미노산 서열 스트레치를 코드하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻습니다 ( 그림 1 , 단계 4). 이러한 시퀀스는 regions.fas 파일에 저장됩니다. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl synonym.pl regions.fas 참고 :이 스크립트는 regions_syn.fas 출력 파일을 만듭니다. </li></ol></li><li> 동의어 DNA 서열에서 발견되는 제한 효소 부위를 검색하십시오. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오 : perl REsynonym.pl regions_syn.fas 참고 :이 스크립트는 regions_syn-re.fas 출력 파일을 만듭니다.. </li></ol></li><li> 두 야생형 유전자의 동의어 시퀀스간에 공유되는 하나의 제한 효소를 선택하십시오. 이 사이트는 제한 효소 소화를 통해 키메라를 조립하는 데 사용됩니다. 선택된 제한 효소가 야생형 유전자 나 pUC18 / 19 벡터 서열을 절단하지 않는지 확인하십시오. <ol><li> genes_re.fas, pUC_re.fas 및 regions_syn-re.fas 파일에있는 제한 효소를 비교하십시오. </li></ol></li><li> 실 리코 (Silico) 에서는 원산지를 두 야생형 유전자의 상응하는 유전자좌에서 동의어 DNA 서열로 대체합니다. synonym DNA sequence를 wildtype sequence file (genes.fas)에 추가합니다. </li><li> gene.fas 파일 ( perl translate.pl genes.fas )에 포함 된 유전자의 아미노산 서열을 얻습니다. </li><li> 야생형과 동의어 DNA 서열에서 번역 된 아미노산 서열을 정렬합니다. 두 시퀀스가 ​​동일한지 확인하십시오. </li><li> pU에 존재하는 ampR 유전자를 가지고이 절의 모든 단계를 반복하십시오C18 / 19 벡터입니다. 참고 : 목표는 ampR 유전자 (ampR.fas 파일)를 두 개의 보완적인 부분으로 나누는 것입니다. ampR 유전자를 파괴하기 위해 선택되는 제한 효소는 키메라 조립에 사용 된 제한 효소와 달라야 한다. </li></ol></li><li> 두 개의 야생형 유전자를 선택된 pUC18 / 19 벡터에 독립적으로 클로닝 (그림 1, 단계 3). <ol><li> 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 선택한 pUC18 / 19 플라스미드 DNA를 정제하십시오. <ol><li> 예를 들어, pUC18 플라스미드로 E. coli DH5α를 형질 전환시키고, 형질 전환 체를 고체 LB-0.3 mg / mL 암피실린 (Amp)상에서 37 ℃에서 밤새 성장시킨다. 형질 전환 콜로니를 선택하고 새로운 LB-0.3 mg / mL Amp 플레이트를 접종하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오. </li><li> 이전의 배양 물을 섭취하고 37 ℃에서 6 ~ 8 시간 동안 액체 LB-0.3 mg / mL Amp에서 배양하십시오. 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li><li> PCR은 approp를 사용하여 총 게놈 DNA에서 야생형 유전자를 증폭외부 oligonucleotides를 riate. 가능한 경우 높은 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하십시오. 수율을 최대화하는 DNA 중합 효소를 선택하십시오. 제조업체의 지침과 올리고 뉴클레오타이드의 용융 온도에 따라 PCR을 수행하십시오. <ol><li> 사용 된 DNA 중합 효소, 앰플 리콘 크기, 주형 및 올리고 뉴클레오티드에 따라 PCR 사이클을 실행하십시오. 예를 들어, rpoD DNA를 증폭 하려면 50 μL 반응을 준비하십시오 : 10 μ 버퍼 5 μL, 50 mM MgSO 4 2 μL, 10 mM dNTP 믹스 1 μL, 각 10 μM 올리고 뉴클레오티드 2 μL (표 2), 2 템플릿 DNA ( 대장균 DH5α 총 DNA) μL, 초순수 35.8 μL, 고 충실도 DNA 중합 효소 0.2 μL를 넣었다. 다음 PCR주기를 실행하십시오 : 초기 변성을 위해 94 ℃에서 1 분, 30 사이클의 증폭 (94 ℃에서 30 초 변성, 60 ℃에서 30 초, 올리고 뉴클레오티드 어닐링, 68 ℃에서 2 분) 확장). </li><li> 1.2 g의아가로 오스에 두 배 증류수 100 mL에 넣고 전자 레인지로 가열한다. 젤 받침대를 조립하고 빗을 수평 젤 캐스터에 넣으십시오. 겔 트레이에 용융 된 아가로 오스 용액을 채우고 고형화하십시오. 빗을 제거하십시오. </li><li> 전기 영동 챔버에 젤을 넣으십시오. 1x Tris-acetate-EDTA 완충액으로 챔버를 채 웁니다. 겔 우물에 PCR 제품 50 μL를로드합니다. 시료를 전기 영동하십시오 ( 예 : 110V에서 1 시간). </li><li> 전기 영동 후 느린 흔들림으로 1 mg / mL ethidium bromide 용액 100 μL를 포함하는 2 회 증류수 100 mL에서 10 분간 겔을 염색한다. 느린 흔들림에서 두 번 증류수로 겔을 10 분 동안 씻으십시오. 수평 쉐이커를 사용하십시오. 주의 :에 티듐 브로마이드는 독성 화합물입니다. 보호용 장갑과 면화 실험용 코트를 착용하십시오. </li><li> 키트를 사용하여 젤의 해당 밴드에서 야생형 유전자 DNA를 정제하십시오. 얼룩이 진 젤을 UV 챔버에 넣음으로써 밴드를 시각화하십시오 (권장 파장 : 300 nm). 젤의 노출을 최소한으로 유지하십시오. DNA 정제 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 주의 : 자외선은 위험합니다. 보호용 방패, 안경 및 면화 실험 코트를 착용하십시오. </li></ol></li><li> 정제 된 야생형 유전자와 pUC18 / 19 플라스미드 DNA를 제조자의 지침에 따라 제한 효소로 분해하십시오. 가능한 경우 빠른 소화 효소를 사용하십시오. 예를 들어, 10 μL의 초순수, 2 μL의 10X 버퍼, 1 μL의 Kpn I 제한 효소 및 1 μL의 Xba I 제한 효소에서 6 μL의 pUC18 DNA (300 ng / μL)를 소화 합니다. 반응을 37 ℃에서 30 분간 둔다. <ol><li> 제조자의 지침에 따라 제한 효소를 비활성화하십시오. 예를 들어, 이중 소화 반응 Kpn I- Xba I을 80 ℃에서 5 분 동안 비활성화시킨다. </li></ol></li><li> 믹스 인서트 : 체적 비율의 벡터 DNA3 : 1이다. 라이 게이션 반응에 대해서는 제조업체의 지침을 따르십시오. 가능한 경우 빠른 연결 효소를 사용하십시오 (25 분 동안 반응을 10 분 동안 그대로 두십시오). 참고 : 일반적으로 키트를 사용한 정제 후 DNA 농도는 소화 및 라이 게이션 반응에 충분합니다. 예를 들어, rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL) 6 μL, pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL) 3 μL, 2 배 완충액 10 μL, 초순수 1 μL 물, 및 T4 DNA 리가 아제 1 μL. 25 ° C에서 10 분 동안 연결 반응을 남겨주세요. </li><li> Supplementary Materials에 설명 된대로 2 ~ 4 μL의 라이 게이션 반응으로 대장균 DH5α를 형질 전환하십시오. 형질 전환 된 세포를 고체 LB / Amp / X-gal / IPTG 플레이트에 플레이트한다. 접시를 밤새 37 ° C에서 방치하십시오. </li><li> 흰색의 형질 전환 대장균 콜로니를 선택하고 새 LB / Amp 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 접시를 밤새 37 ° C에서 방치하십시오. &lt;/ li&gt; <li> 보충 교재에 설명 된대로 반응을 시퀀싱 할 후보를 선택하기 위해 식민지 PCR을 수행합니다. 후보자로부터 플라스미드 DNA를 추출하십시오. 또는 인서트를 클로닝하기 위해 사용 된 것과 동일한 제한 효소로 후보 플라스미드 DNA를 분해하십시오. </li><li> 시퀀싱 서비스 공급자가있는 시퀀스 후보 구성 10 . DNA 어셈블러 11 ( 그림 1 , 단계 5)을 사용하여 silico로 서열 을 조립하십시오. </li></ol></li><li> PCR에 의한 플라스미드 파쇄와 제한 효소 소화. <ol><li> 야생형 및 ampR 유전자의 경우 브레이크 영역에서 전방 및 후방 올리고 뉴클레오타이드를 각각 디자인하십시오. silico 에서 해당 동의어 DNA 서열 (1.4 단계에서 얻음)에 대해 야생형 단편을 대체하십시오. 참고 :이 동의어 DNA 서열은 제한 효소 부위를 포함합니다. 정방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드는 t그는 효소 부위를 제한한다. 올리고 뉴클레오타이드는 21-27 개의 뉴클레오티드, 시토신 또는 구아닌으로 끝나야하며, 제한 효소 부위를 포함해야한다. 순방향 올리고 뉴클레오타이드는 주형 DNA상의 그 표적 부위와 동일한 서열을 갖는다. 역전 올리고 뉴클레오타이드는 주형 DNA상의 표적 부위의 역 상보 서열이다. </li><li> PCR 반응 ( 예 : pUC18 rpoD 및 pUC18 sigA )에 대한 DNA 템플릿으로 두 wildtype 유전자 구조를 사용하십시오. 각 구조물 (pUC18 rpoD σ1- σ2 , pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 및 pUC18 sigA σ3-σ4)의 두 가지 보완 부분을 얻습니다 ( 그림 1 , 단계 6). </li><li> DNA 샘플을 아가로 오스 겔 1-1.2 % [w / v]에 넣으십시오. 전기 영동 ( 예, 110V에서 1 시간)에 의해 DNA 주형으로부터 PCR 생성물을 분리한다. 또는 Dpn I로 PCR 반응을 분해하여 DNA 주형을 파괴 할 수 있습니다. 참고 : DpnI 효소는 메틸화 된 DNA 서열 (5&#39;-GATC-3 &#39;)만을 인식합니다. <ol><li> DNA 정제 키트를 사용하여 샘플을 정제하십시오. 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 모든 상보 적 DNA 단편을 적절한 제한 효소로 이중 절단하십시오. 가능한 경우 빠른 분해 효소를 사용하십시오. 예를 들어, 제조사의 프로토콜을 사용하여 Afl II 및 Spe I로 pUC18rpoDσ1-σ2 DNA 단편을 이중 절단하십시오. 37 ° C에서 15 분 동안 소화 반응을 남겨 둡니다. </li><li> 제조자의 지침에 따라 제한 효소를 비활성화하십시오. 예를 들어, Afl II Spe I을 80 ℃에서 20 분 동안 비활성화시킵니다. </li></ol></li><li> DNA 라이 게이션 및 세균 변형을 이용한 플라스미드 회수. <ol><li> 원하는 키메라 유전자를 조립하기 위해 용적 1 : 1 비율로 적절한 DNA 조각을 섞는다.1, 단계 7). 참고 : 이렇게하면 ampR 유전자의 무결성이 복원되어 기능성 단백질을 생성합니다. <ol><li> 예를 들어 pUC18 rpoD σ1- σ2 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL로 분해 됨) 4 μL, pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL) 4 μL, 2 배 완충액 10 μL, 초순수 2 μL 및 T4 DNA 리가 제 1 μL; 키트 정제 후 DNA 농도는 소화 및 후속 연결에 충분합니다. 라이 게이션 반응을 25 ℃에서 10 분 동안 남겨 두십시오. </li></ol></li><li> 키메라 어셈블리 연결 반응 (보충 자료) 3 ~ 5 μL와 대장균 DH5α를 변환합니다. 37 ° C 밤새 LB / Amp / X-gal / IPTG 플레이트에서 변형 세포를 성장시킵니다. </li><li> 흰색의 형질 전환 대장균 콜로니를 선택하고 새 LB / Amp 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 37시에 하룻밤 사이에 둡니다.기음. </li><li> 보충 교재에 설명 된대로 시퀀싱 반응에 대한 후보자를 선택하기 위해 식민지 PCR을 수행합니다. 전기 영동 (단계 2.3.2.1에서 설명)을 수행하여 1-1.2 % (w / v) 아가로 오스 겔에서 밴드를 시각화하십시오. </li><li> 긍정적 인 후보자로부터 문화를 성장시킵니다. 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li></ol> 2. 서열 후보 키메라 구조물 <ol><li> 플라스미드 DNA의 품질이 서열 분석 서비스 제공자의 지침에 따라 서열 분석 반응에 충분한 지 확인하십시오. 정화 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 예를 들어, 시퀀스 서비스 제공 업체의 인터넷 페이지에서 샘플에 대해 권장되는 DNA 농도에 특히주의하십시오. DNA 정량 도구를 사용하여 시료의 농도를 구하십시오. </li><li> 시퀀싱 서비스 제공 업체와의 서열 후보 키메라 구조 10 . </li><li> se 조립<html> in silico DNA 어셈블러 11을 사용하여 읽기를 시작합니다. </li><li> 서열 정렬 도구 9 , 12를 사용하여 실 리코 설계 키메라 시퀀스 대 어셈블 된 어레이를 정렬합니다. 키메라 유전자가 성공적으로 융합되었는지 확인하십시오. </li></ol> 3. 준비하기 참고 : 살아있는 세포와 관련된 모든 단계는 분젠 버너가 켜져있는 깨끗한 층류 후드에서 수행되어야합니다. <ol><li> 대장균 DH5α 유능한 세포를 생산. <ol><li> 대장균 - 경쟁 세포를 생산하기 위해서는 공개 된 프로토콜 13을 따르거나 보충 자료를 참조하십시오. 또는 상업적으로 이용 가능한 적격 세포를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 대장균 DH5α 유능한 세포를 형질 전환. <ol><li> 대장균 배양 물의 화학적 형질 전환을 위해, 공개 된 프로토콜을 따른다.class = &quot;xref&quot;&gt; 13 또는 보충 자료 참조. 또는 박테리아 형질 전환을 위해 일렉트로 포 레이션을 사용하십시오. 상업적으로 이용 가능한 적격 세포를 사용하는 경우에는 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> E. coli DH5α로부터 게놈 및 플라스미드 DNA 정제. <ol><li> 보충 교재에 명시된대로 핵산 추출을 시중에서 구할 수있는 키트를 사용하거나 출판 된 프로토콜을 사용하십시오 13 . </li></ol></li><li> 식민지 PCR을 수행하십시오. <ol><li> 이 기술을 사용하여 후속 시퀀싱 반응을위한 후보 형질 전환 콜로니를 확인하십시오. 참고 :이 방법은 서열의 무결성에 대한 최종 검증을 나타내지 않습니다. 이 기술에 대한 자세한 설명은 보충 자료 에서 제공됩니다. </li></ol></li><li> 솔루션 준비. <ol><li> 만나다 <strong&gt; 솔루션 준비에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> CAPRRESI 프로토콜에 필요한 스크립트 및 시퀀스 파일을 다운로드하십시오. <ol><li> 원하는 종의 완전한 게놈 서열을 포함하는 유전자 뱅크 파일을 다운로드하고, 게놈 브라우저를 사용하여 선택한 유전자의 DNA 서열을 추출하여 fasta 파일 형식으로 저장하십시오. CAPRRESI 프로토콜에 필요한 Perl 스크립트를 다운로드하십시오. 스크립트와 시퀀스 파일을 같은 디렉토리에 저장하십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

CAPRRESI는 PRM 2 의 대안으로 설계되었습니다. 원본 PRM은 강력한 기술입니다. 그것은 선택된 유전자의 어떤 부분을 따라 DNA 서열의 융합을 허용한다. PRM의 경우 야생형 유전자를 동일한 플라스미드에 클로닝해야합니다. 그 후, 올리고 뉴클레오타이드는 플라스미드에서 발견되는 야생형 및 항생제 내성 유전자 내에서 설계된다. 플라스미드 혼란은 둔기가 끝난 고 충실도의 DNA 중합 ...

키메라 유전자 어셈블리는 단백질 기능을 밝히고 생물 공학적 목적으로 분자 생물학에서 널리 사용되어왔다. 중첩 PCR 산물 증폭 1 , 플라스미드 회수 2 , 상 동성 재조합 3 , CRISPR-Cas9 시스템 4 , 부위 유도 재조합 5 및 깁슨 어셈블리 6 과 같은 유전자 융합에 대한 다른 방법이있다. 이들 각각은 서로 다른 기술적 이점을 제공합니다. 예를 들어 중복 된 PCR 디자인의 융통성, 플라스미드 회복 동안 구조의 생체 내 선택, CRISPR-Cas9 및 Gibson 시스템의 고효율성 등이 있습니다. 반면에 이러한 방법 중 일부를 수행하는 동안 약간의 어려움이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 처음 두 접근법은 둔기가 끝난 DNA 단편에 의존하며 이러한 유형의 산물의 결찰은 stic에 비해 기술적으로 어려울 수 있습니다연말 결찰. Site-directed 재조합은 Creoxox 시스템과 같이 원래 DNA 서열 (흉터)의 흔적을 남길 수 있습니다 5 . CRISPR-Cas9는 때로는 대상 사이트 4 이외에 다른 게놈 지역을 수정할 수 있습니다. 여기에서 플라즈미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 소개합니다.이 프로토콜은 플라즈미드 회수 방법 (PRM)과 동의어 DNA 서열상의 제한 효소 부위 삽입을 결합하여 결찰 효율을 향상시키는 단백질 코딩 유전자 융합 프로토콜입니다 . 아미노산 서열의 완전성을 보장하기 위해, 제한 효소 부위는 동의어 DNA 서열 연장 부에 삽입된다. CAPPRESI의 이점 중 하나는 일반 실험실 시약 / 도구 ( 예 : 효소, 능력있는 세포, 용액 및 열 순환기)를 사용하여 수행 할 수 있으며 신속한 결과를 줄 수 있다는 것입니다 (적절한 효소가 사용되는 경우). 제한에 의존동의어 DNA 서열로부터 나오는 효소 부위는 관심있는 단백질 내부의 정확한 융합 지점의 선택을 제한 할 수있다. 그러한 경우, 중복되는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 표적 유전자를 융합시키고, 벡터의 내성 유전자에 제한 효소 부위를 삽입해야한다. CAPRRESI는 7 가지 간단한 단계로 구성됩니다 ( 그림 1 ) : 1) 클로닝 벡터 pUC18 또는 pUC19 6의 선택 ; 2) 융합 될 야생형 서열의 실 리코 (silico) 분석; 3) 키메라 조립 및 플라스미드 파괴에 대한 파괴 영역의 선택; 4) in silico 세대의 동의어 DNA 제한 효소 부위를 포함하는 염기 서열; 5) 선택된 플라스미드로의 야생형 유전자의 독립적 인 클로닝; 6) PCR에 의한 플라스미드 파괴,이어서 제한 효소 소화; 및 7) DNA 라이 게이션 및 세균 변형을 이용한 플라스미드 회수. 이 기술로 생산 된 키메라 유전자는 검증되어야한다.ith 시퀀싱. pUC18 / 19 벡터는 작은 크기 ( 즉, 2,686 염기쌍), 높은 카피 수, 유리한 서열화 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 클로닝 및 키메라 조립에 기술적 장점을 제공합니다. 여기에 박테리아 배양이 저렴하고 빨리 자라기 때문에 대장균 (Escherichia coli) 숙주를 사용하여 키메라를 조립하고 처리했습니다. 이를 고려하여, 최종 표적 플라스미드로의 융합 단편의 후속 클로닝 ( 예 : 박테리아의 pRK415 또는 포유류 세포의 pCMV와 같은 발현 벡터)이 필요할 것이다. CAPRRESI는 두 가지 주요 시그마 인자 유전자 인 E. colirpoD 와 Rhizobium etlisigA 를 융합시켜 시험 하였다 . 1 차 시그마 인자는 전사 개시에 관여하는 RNA 중합 효소 서브 유닛이며, 4 개의 도메인 ( 즉, σ1, σ2, σ3, σ4)으로 이루어져있다. 아미노산 서열은 길다.rpoD 및 sigA에 의해 인코딩 된 단백질은 각각 613 및 685이다. RpoD와 SigA는 48 %의 동일성 (98 % 적용 범위)을 공유합니다. 이러한 1 차 시그마 요인은 영역 σ2와 σ3 사이에서 두 개의 보완적인 조각으로 나뉘어졌습니다. 키메라 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4)과 키메라 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3- σ4)의 두 가지 키메라 유전자가이 디자인에 따라 조립되었다. DNA 융합 생성물은 시퀀싱에 의해 확인되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">11304011</td>
			<td style="width:355px;">Produces a mix of blunt/3&#8217;-A overhang ended PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pure plasmid isolation kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11754785001</td>
			<td>Used for all plasmid purification reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pure PCR product purification kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11732676001</td>
			<td>Used for all PCR purification reactions from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0520L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-CTTAAG-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KpnI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3142L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-GGTACC-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SpeI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3133L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-ACTAGT-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0145L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-TCTAGA-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">A0166-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">N8878-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">Y1625-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casein peptone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">70171-500G</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S9888-1KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">05040-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0684</td>
			<td>Fast digest XbaI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0524</td>
			<td>Fast digest KpnI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">M2200S</td>
			<td>Fast DNA ligation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0834</td>
			<td>Fast digest AflII enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpeI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD1253</td>
			<td>Fast digest SpeI enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion

여기, 우리는 플라스미드 복구 및 제한 효소 사이트 삽입 (카프레 리)에 의한 키메라 조립을 제시한다. CAPRRESI는 원래의 플라스미드 회수 방법의 많은 장점을 활용하고 제한 효소 소화를 도입하여 DNA 라이 게이션 반응을 완화합니다 (키메라 조립에 필요함). 이 프로토콜의 경우 사용자는 야생형 유전자를 동일한 플라스미드 (pUC18 또는 pUC19)에 복제합니다. 키메라가 조립되어야하는 아미노산 서열 영역의 in silico 선택 후, 사용자는 그들을 암호화하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻는다. Ad Hoc Perl 스크립트를 사용하면 사용자가 모든 동의어 DNA 시퀀스를 결정할 수 있습니다. 이 단계 후에 다른 Perl 스크립트는 모든 동의어 DNA 시퀀스에서 제한 효소 사이트를 검색합니다. 이 in silico 분석은 pUC18 / 19 플라스미드에서 발견되는 암피실린 내성 유전자 ( ampR )를 사용하여 수행됩니다. 사용자는 synonym region 내에서 올리고 뉴클레오타이드를 디자인하여 PCR로 wildtype과 ampR 유전자를 파괴합니다. obt 후상보적인 DNA 단편을 정제하고 정제하고, 제한 효소 소화를 수행한다. 키메라 조립은 적절한 상보적인 DNA 단편을 연결함으로써 달성된다. PUC18 / 19 벡터는 작은 크기 (2,686 염기 쌍), 높은 카피 수, 유리한 시퀀싱 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 기술적 이점을 제공하기 때문에 CAPRRESI를 위해 선택된다. 키메라 조립을위한 제한 효소의 사용은 무딘 - 종단 제품을 생산하는 DNA 중합 효소의 필요성을 제거합니다. CAPRRESI는 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

그림 1 은 CAPRRESI를 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 2 개의 키메라 유전자를 2 개의 박테리아 1 차 시그마 인자 ( 즉, 대장균 RpoD 및 R. etli SigA)의 도메인을 교환함으로써 조립 하였다. rpoD 및 sigA 유전자의 DNA 서열은 각각 GenBank 게놈 파일 NC_000913 및 NC_007761에서 Artemis Genome Browser 14 를 사용하여 얻었다. pUC18 벡터의 DNA ?...

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CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

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11.5K 조회수.  Universidad Nacional Autónoma de México.  여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다. 

비디오: CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

특정 사이트 Recombinase (SSR) 기술의 원리

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

연구

생물학

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...