Floxed 카세트 알꼴 교환 돌연변이 발생은 유전자 삭제가 유전자 제품의 기능을 이해하기 위해 활용할 수 있는 귀중한 도구이기 때문에 중요한 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 유전자에 극성 효과를 가하지 않고 표적 유전자 삭제를 허용한다는 것입니다. 모동성 재조합을 위한 5개의 프라임 및 3개의 프라임 상동성 무기로 봉사하고 텍스트 프로토콜에 명시된 프라이머를 할당하기 위하여 삭제를 표적으로 한 유전자의 대략 3개의 킬로베이스 지구를 직접 상류 및 하류로 확인합니다.
PCR에 의해 새로 추출된 클라미톨 게놈 DNA로부터 3킬로베이스 5개의 프라임 및 3개의 프라임 상동성 팔을 하나 또는 두 개의 반응으로 증폭시켜 나중에 DNA 조립을 위한 충분한 단편을 산출합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 PCR 조각을 정화하고 농축한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 1개의 세포 1 단위와 SBF 1 단위의 1단위를 가진 20 마이크로리터 반응에서 500나노그램의 pSUmC-4.0 벡터를 소화한다. 소화 및 정제된 pSUmC-4.0 벡터와 5개의 프라임 호모로지 암 PCR 제품을 각각 0.09 피코몰 벡터에 0.09 피코몰 벡터의 비율로 결합한다.
제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 어셈블리 반응으로 조각을 조립합니다. DNA 조립 반응의 마이크로리터 1개로 전기유능한 대장균 50마이크로리터를 변환합니다. 변형된 대장균을 LB 한천 플레이트에 밀리리터 스펙티노마이신당 100마이크로그램을 함유하고 있습니다.
하룻밤 사이에 37도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 상형광 반전 현미경을 사용하여 녹색과 붉은 형광을위한 화면 식민지. 한천판당 총 5~30개의 식민지가 예상됩니다.
선택된 식민지의 야간 액체 배양 배양에 따라 각 성모리 암이 각 삽입을 증폭시키는 PCR 스크리닝 프라이머를 사용하여 벡터에 삽입되는 것을 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 일반적으로 클라미디아를 2개의 6웰 플레이트로 육성하기 위해 사용되는 마우스 섬유아세포인 종자 맥코이 세포. 1.5 밀리리터 튜브에서 C.trachomatis 야생 형 세로바 L2 초등체 또는 EB를 2의 MOI에서 6 웰 플레이트의 12 우물을 감염시키기에 충분한 부피로 추가하십시오.
30분 동안 20배, 000배 g이상의 EB를 펠렛하고 상퍼를 폐기합니다. 염화칼슘 완충제 600마이크로리터에서 EB를 부드럽게 재연하여 클라미얼 변환을 시작하십시오. 그런 다음 12 마이크로그램의 pSUmC-4.0 플러스 호모로지 암을 튜브에 넣고 가볍게 섞어 용액을 부드럽게 섞습니다.
10분마다 섞어 30분간 실온에서 튜브를 배양합니다. 변환 솔루션을 24밀리리터의 HBSS에 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다. 6웰 플레이트에 있는 컨실루물 맥코이 세포의 각 우물에 접종의 2밀리리터를 전송합니다.
섭씨 20도에서 1시간 동안 900회 g에서 원심분리에 감염하십시오. 접종을 제거하고 잘 RPMI 성장 미디어 번호 2 당 두 밀리리터로 교체합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
최소 7시간 이지만 12시간 이상 이후에는 미디어를 셀렉션 미디어 넘버 1당 2밀리리터로 교체합니다. 감염 시점으로부터 48시간 동안 섭씨 37도에서 잠복기를 계속하십시오. 세포 스크레이퍼를 사용하여 맥코이 단층층을 부드럽게 긁어 내어 세포를 매체로 들어 올려 수확하고 맥코이 세포의 신선한 단층으로 박테리아를 통과하십시오.
각 우물에서 2 밀리리터 튜브로 재료를 옮기십시오. 섭씨 4도에서 30분 동안 마이크로센심분리기에서 세포 물질을 20배, 000배 이상 으로 펠릿합니다. 상체를 폐기한 후, 부드럽게 파이펫팅하여 HBSS의 1 밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 놓습니다.
섭씨 4도에서 5분간 200배 g의 세포 잔해를 펠렛합니다. 상체를 컨물매코이 세포의 신선한 우물로 옮기. 각 웰에 1밀리리터의 HBSS를 추가하여 총 2밀리리터를 양으로 줄입니다.
섭씨 20도에서 1시간 동안 900회 g에서 원심분리에 감염하십시오. 감염 직후 선택 미디어 번호 1로 접종을 교체하십시오. 감염 후 24시간 후, 상색 및 녹색 포함물이 감염 후 24시간 반전된 현미경을 사용하여 검출될 때까지 48시간마다 McCoy 세포의 신선한 단층층으로 박테리아를 계속 전달합니다.
빨간색과 녹색 포함이 감지되면 선택 미디어 번호 2를 사용하기 전에 모노 레이어를 계속 전달합니다. pSUmC-4.0 벡터의 손실과 loxP 선택 카세트의 통합을 나타내는 24시간 감염 후 녹색 전용 포함이 검출될 때까지 단층을 계속 전달한다. 수확하고 SPG에서 녹색 전용 포함을 동결.
0.5에서 1.0 사이의 MOI에 녹색 전용 포함을 보강하고 텍스트에 설명된 대로 단층을 SPG로 수확합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 50 마이크로리터의 알리쿼터를 얻고 영하 80도에서 동결하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 McCoy 세포를 가진 384웰 조직 배양 판을 시드한다.
HBSS에 있는 녹색 전용 박테리아의 알리쿼트20 밀리리터 당 대략 50의 EBs를 달성하기 위하여 희석하십시오. 희석된 접종을 저수지 트레이로 옮기습니다. 전체 플레이트를 거꾸로 뒤집어 폐 용기로 단단히 밀어 넣음으로써 384웰의 매코이 셀 플레이트에서 미디어를 제거합니다.
멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 C.trachomatis 접종소 50마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 20도에서 1시간 동안 900회 g에서 원심분리에 감염하십시오. 깜박임으로 접종을 제거하고 성장 미디어 번호 2의 웰 당 50 마이크로 리터로 교체하십시오.
이산화탄소5%와 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 5~12일 동안 플레이트를 배양한 후, 상피 반전 현미경 또는 고함량 스크리닝 플랫폼을 사용하여 녹색 형광 포함으로 개별 우물을 식별합니다. P10 팁으로 모노레이어를 긁어 녹색 전용 으로 우물을 수확하십시오.
우물의 전체 내용을 HBSS의 2밀리리터가 들어있는 튜브로 옮기. 감염을 위해 6웰 플레이트에 신선한 컨실릭 맥코이 단층층에 2밀리리터의 접종을 부드럽게 혼합하고 발라주세요. 농축, 동결 및 티터 클론 인구.
정량적 PCR을 사용하여 복제 로 분리 된 C.trachomatis에서 표적 유전자의 삭제를 확인합니다. 복제격리된 C.trachomatis FRAEM 돌연변이, pSU-Cre 벡터 및 선택 미디어 번호 3을 사용하여 변환 프로세스를 반복합니다. 단층은 선택 카세트의 손실을 나타내는 빨간색 전용 포함이 감지될 때까지 통과합니다.
복제는 이전과 같이 384웰 플레이트에서 희석을 제한하여 레드 전용 포함을 분리합니다. 0.1의 MOI까지 통과하여 복제 인구를 풍부하게합니다. 보강되면 선택 매체를 성장 미디어 2번으로 교체하여 pSU-Cre 벡터의 손실을 시작합니다.
복제로 이전과 같이 비 형광성 박테리아를 분리합니다. 그러나, 수동으로 포함을 감지하는 브라이트 필드 현미경으로 플레이트를 스캔. 박테리아를 풍부하게 하고 얼려보시면 됩니다.
이전에 설명된 바와 같이 정량적 실시간 PCR, 서양 블로팅 및 전체 게놈 DNA 염기서열분석을 사용하여 돌연변이 균주를 위한 스크린. 대표적인 데이터는 tmeA가 유전자 삭제를 표적으로 하는 것으로 나타났습니다. C.트라코마티스 tmeaA 삭제 균주는 FRAEM을 사용하여 생성되고 C.trachomatis tmeA-lx 균주는 FLAEM을 사용하여 생성된다.
tmeA 및 다운스트림 tmeB의 상대DNA 카피 번호, pSUmC-4.0 선택 카세트에 포함된 gfp, pSU-Cre 벡터에 포함된 크레등이 모두 표시됩니다. 두 돌연변이 균주는 tmeA 궤적의 삭제를 포함합니다. 그러나, tmeA-lx는 gfp DNA의 부재에 의해 표시된 선택 카세트를 포함하지 않는다.
tmeA 돌연변이 균주는 mRNA 및 단백질 수준에 의해 도시된 것과 같이 tmeB의 발현을 감소시켰습니다. FLAEM이 tmeA-lx 돌연변이 균주를 생성하는 데 사용되는 경우, tmeB의 발현은 mRNA 및 단백질 수준에 의해 검출된 바와 같이 복원됩니다. 상동성 팔을 가진 pSUmC 벡터의 신중한 구조는 유전자의 표적 삭제를 위해 필수적입니다.
클라미다이얼 변환 전에 정확한 벡터 어셈블리를 보장하기 위해 시간을 가져야 합니다. FLAEM은 연구자들이 특정 유전자를 연구하고 연구를 혼동할 수 있는 표적 유전자의 감소된 발현없이 표적 삭제를 하는 도구를 제공했습니다. FLAEM에 의해 생성된 C.trachomatis 삭제 돌연변이는 발달 및 병원성 메커니즘을 포함하여 클라미원 생물학의 다양한 양상을 연구하기 위하여 이용될 수 있다.
