T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

디자인을 대상으로 1 유전자 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 관심의 게놈 영역을 다루는 적절한 BAC 클론을 주문. 이 예를 수정해야 ES 세포의 종류에 동질 있는지 확인, 유전자 RPCI-23 및 RPCI-24 BAC 클론 C57BL / 6 ES 세포를 대상으로. </li><li> 대상 벡터를 설계 할 때 기준을 대상으로 기존의 유전자를 적용합니다. 주요 매개 변수는 수정이 인트론 카세트의 유전자 녹아웃 전략 및 간격과 배치를 삭제 중요한 엑손 (CE)을 정의, 구성 적 또는 조건부로 할 필요가 있는지 여부를 포함한다. 주 : 이들 각각은 다른 곳에서 열 상세히 논의되었다. </li><li> 대상 변형 사이트를 측면에서는 5~6킬로바이트 각각의 게놈 영역을 선택합니다. 주 : 상한 같은 플라스미드 p15A 서브 클로닝 적은 카피와 80킬로바이트만큼 높을 수 있지만 서브 클로닝 인서트의 크기는, 따라서, 전형적 10-12킬로바이트이다 인 pBR322 등과 BAC와 최대 200킬로바이트벡터. </li></ol> 2. 멀티 플렉스 Recombineering 올리고 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 플라스미드 백본 (서브 클로닝 플라스미드) 및 선별 마커 (삽입 카세트)에 대한 설계 올리고. 그것은 180 염기쌍의 HA의 측면에 게놈 대상 사이트와 삽입 카세트 또는 서브 클로닝 플라스미드 (그림 2)의 특정 프라이밍 서열의 20 bp의를 포함하도록 각 올리고 디자인. 참고 : 동성 암은 어떤 반복적 인 요소를 포함 할 수 없습니다, 반복적 인 요소의 존재가 잘못된 타겟팅 및 서브 클로닝 발생합니다. 반복 요소는 예컨대 &#39;&#39; &#39;가리개를 반복&#39;와 같은 웹 기반 툴을 이용하여 검출 할 수있다. </li><li> ES 세포 (그림 2)을 대상으로 유전자 대상으로 선형화 된 벡터를 벡터 올리고 중 하나에 고유 제한 효소 (RE) 사이트를 포함합니다. </li><li> 올리고 분석기 프로그램을 사용하여 올리고 매개 변수를 확인합니다. 프라이밍 지역에서 차 구조 않도록주의하십시오의. </li><li> 삽입 카세트의 짧은 HA (50 BP)은 허용과 재조합의 낮은 숫자를 산출하지만 서브 클로닝 플라스미드 HA가 이상 (180 BP) 항상 있는지 확인한다. </li><li> &#39;cloneDB&#39;추천 웹 기반 툴을 사용하여 특정 BAC 클론의 게놈 DNA 인서트의 방향을 결정한다. BAC 라이브러리의 구축에 사용 된 BAC 플라스미드 골격의 맵을 확인하여 오리스에서 복제의 방향을 설정. 참고 : 오리스 모든 일반적으로 사용되는 BAC 플라스미드의 클로람페니콜 (엽록소) 마커의 전사 방향과 반대 보통이다. </li><li> BAC 클론에 복제의 방향과 반대이다 올리고의 5 &#39;말단에 두 개의 터미널 포스 (PTO) 채권을 추가합니다. 역 올리고 (그림 2)에 5 &#39;인산 수정을 추가합니다. 참고 : 레드 소화에 따라 비대칭 phosphorothioated PCR 카세트는 수 소수 보온재 가닥 ssDNA를 중간 생성복제 포크의. 주 : 극대 다중화 재조합 빈도는 보온 스트랜드 보호 카세트로 관찰된다. 선도 가닥 보호 또는 이중 보호 카세트는 어떤 궤적에 상응하는 재조합 효율성을 생산하지 않을 수 있습니다. </li><li> PAGE 또는 HPLC 정제에 올리고 주문. </li></ol> pSC101 BADgbaA Recombineering 플라스미드 3. BAC 클론 변환. <ol style="margin-left: 40px;"><li> E.을 만들려면 실력 BAC의 recombineering 베어링 대장균은 레드 유전자 (16)를 포함하는 pSC101 BADgbaA 플라스미드로 변환. 참고 : pSC101 BADgbaA 플라스미드 아라비 노스 유도 ARAÇ-P BAD 프로모터, 테트라 사이클린 선택 마커 및 온도에 민감한 pSC101 플리의 제어 아래에있는 빨간색과 RECA 유전자가 포함되어 있습니다. <ol><li> BAC 한천 문화 멸균 피펫 팁을 찔러 원성 국물의 5.0 ml에 접종 (LB) 12.5을 포함하는 pH가 8.056; g ml의 -1 엽록소. 5 시간 200 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 성장. </li><li> 10 % (v / v) 글리세롤 용액, 마이크로 원심 분리 튜브 및 얼음에 전기 천공 큐벳 진정. 4 ° C에 냉장 대형 원심 분리기 및 마이크로 원심 쿨. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 배양 물의 광학 밀도 (OD)를 결정하고 600 nm에서 흡광도를 측정한다. 0.3 내지 0.8의 OD 판독이 600에 도달 할 때 (후술) electrocompetent 세포를 준비한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 1,216 XG에서 큰 원심 분리기 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포를 스핀 다운. </li><li> 냉장 10 % 글리세롤의 1 ml의 세포를 씻으 4 ° C에서 20 초 동안 17,949 XG에서 세포를 스핀 다운. 세탁 3 회 총 단계 수행합니다. </li><li> 10 % 글리세롤 50 μl의 총 부피에 재현 탁하고 세포를 pSC101 BADgbaA의 recombineering 플라스미드 10-200 ng의 추가. 피펫에 의해 단일 ​​세포 현탁액을 수득최대 여러 번 다운 후 미리 냉장 1mm 간격 전기 큐벳에 세포를 전송합니다. </li><li> 1.8 KV, 25 μF 200 Ω의 설정을 사용하여 세포를 Electroporate. 참고 : electroporator의 각 브랜드에 대한 올바른 설정을 확인합니다. 보다 작은 4 일렉트로 시정 염 및 기타 불순물의 존재를 나타낸다. </li><li> 즉시 LB 1 ㎖에 균체를 회수하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다. </li><li> 2 시간 200 rpm으로 흔들어 30 ° C에서 BAC의 gbaA 문화를 성장. 참고 : 세포 인해 온도에 민감한 REPE 복제 인자의 불 활성화에 37 ° C에서 성장하는 경우 pSC101 BADgbaA 플라스미드가 손실됩니다. recombineering 기능을 유지하기 위해 30 ° C에서 gbaA 세포 성장. </li><li> 12.5 μg의 ml의 -1 엽록소 4 μg의 ml의 -1 테트라 사이클린 (구정) 복구 된 BAC의 gbaA의 문화를 포함하는 LB의 9 ML을 추가합니다. 성장BAC gbaA 문화 O / N (30)에서 &#160; ° C 200 rpm으로 흔들어. 참고 :, 수퍼 gbaA 플라스미드를 electroporating의 변환 효율은 액체 미디어에 포화 성장 O / N을 허용하기에 충분히 높다. </li></ol></li></ol> 삽입 카세트 및 서브 클로닝 플라스미드 4. 준비 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 후술하는 바와 같이 변형 된 긴 올리고 사용 (PCR)를, 카세트 삽입 (들) 및 서브 클로닝 플라스미드로 HA를 통합 중합 효소 연쇄 반응을 수행한다. <ol><li> 옵션 : recombineering 반응에 플라스미드 이월을 방지하기 위해 삽입 카세트를 증폭 R6K 원산지 또는 유사한 좁은 숙주 범위 플라스미드 템플릿을 사용합니다. </li><li> 대안 적으로, RE 다이제스트 (표 2)를 이용하여 플라스미드를 선형화 템플릿. PCR 증폭 영역 이외의 절단 및 열 불 활성화 RE를 선택합니다. 증명할에서 권장하는 열은 RE를 비활성화acturer. </li><li> 고 충실도 핫 스타트 DNA 중합 효소 시스템을 사용하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 설정한다. (표 3)를 자세히 설명 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. (표 3)과 같이 열 순환을 수행합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다. 로드 1-5 1 % 상 각 PCR ㎕의 0.5 MG ml의 -1 에티 디움 브로마이드 (EtBr이)를 포함하는 아가로 오스 겔 (/ V w). 주 : 비 - 특이 적 증폭 생성물의 존재 recombineering 반응에 간섭하지 않는다. 그러나 일부 경우, 프라이머 다이머는 recombineering 효율을 감소시킬 수있다. </li><li> PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제. <ol><li> 옵션 : PCR 청소 다음 DpnI으로 처리하여 PCR들에서 플라스미드 템플릿을 제거합니다. (제조업체에서 권장) 멸균 탈 이온수의 최소 볼륨에서 용출 DNA. 주 : DpnI 첨가 번째 개열의 저감 효율 PCR 반응 결과를하기 미정전자 메틸화 된 플라스미드 DNA 템플릿입니다. </li></ol></li><li> DNA 기준 예, λ를 HindIII 분해물 또는 집합에 대해 공지 nanodrop 분광 광도계를 이용하여 아가 로스 겔 분석에 의한 PCR 증폭 된 DNA 정량화. </li></ol> 5. 서브 클로닝 플러스 삽입 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 10 ㎖의 LB + 엽록소 + 구정에 200 μl를 추가하여 O / N BAC gbaA 문화 50 배 희석. 30 성장 &#160; ° C는 1 시간 50 분 동안 200 rpm으로 진탕. 샘플을 포함하는 음성 대조군으로 사용할 수있다. </li><li> 단계 3.1.2에 설명 된대로 4 ° C에 모든 recombineering 용 재료 및 장비를 진정. </li><li> LB 한천의 pH를 서브 클로닝 벡터 (표 4)를 선택할뿐만 아니라, 삽입 된 DNA 단편의 선택을 허용 할 것이다 적절한 항생제 선택 (들)의 정확한 농도를 함유하는 8 개의 플레이트를 붓는다. 참고 : 일부 항생제의 pH에​​ 민감하다. 사용 LB원칙적으로 한천의 pH 8. </li><li> L 아라비 노스의 솔루션 (V / W) 10 %를 준비합니다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 살균 여과. 주 : 아라비 노스가 gbaA 플라스미드로부터 recombineering 단백질의 발현을 유도한다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 BAC의 gbaA 문화의 OD를 확인합니다. 다음 단계에서 설명한 바와 같이 0.25 내지 0.3 600 도달 OD되면 recombineering 단백질을 유도한다. </li><li> 0.2 % 아라비 노스의 최종 농도를 달성하기 BAC 배양을 10mL의 10 % 아라비 노스 용액 200 μL를 추가한다. (아라비 노스)없이 유도되지 않은 배양을 포함하는 음성 대조군으로 사용할 수있다. </li><li> 37 BAC 문화를 전송 &#160; C 진탕 배양기를 °와 45 분 230 rpm에서 진탕 레드 발현을 유도. 참고 : 레드 단백질의 발현이 30 ° C에서 비효율적이다. </li><li> 세포를 스핀 다운 단계 3.1.5에 설명 된대로 10 % 글리세롤로 3 회 세척한다. </li><li> , 600-1 추가000 개의 서브 클로닝 플라스미드 recombineering 반응에 삽입 카세트 (S)의 각각 겨. 벡터와 카세트의 재조합 능력과 무결성을 확인하는 유일한 벡터 및 벡터 플러스 단일 삽입 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 위아래로 pipetting하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. BAC 벡터를 3 시간 동안 37 ° C에서 다중 카피 플라스미드 또는 LB 10ml에 1 시간 동안 37 ° C에서 1 ml의 LB 스텝 3.1.7 이후 회복에 기재된 전기 천공을 수행한다. </li><li> 회수 된 배양 예, 90 %, 10 %, 1 듀얼 선택 아가 플레이트에서 37 %의 성장 접시 다른 희석액 &#160; 16 시간 동안 C를 °. </li></ol> 재조합 6. 분석 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 옵션 : 6 ~ 12 식민지를 선택하고 HA 플 랭킹 프라이머 및 삽입 특정 프라이머를 사용하여 식민지 PCR을 수행합니다. 서브 클로닝 플라스미드와 삽입 캐스 포함SETTE 플라스미드뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 등의 부모 BAC 클론. <ol><li> 식민지의 PCR의 아가 로스 젤 분석을 수행합니다. 예상 크기에서 밝은 밴드의 존재에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. 주 : SPI 클로닝 과정의 높은 효율을 거의 정확한 재조합 체를 생성한다. </li></ol></li><li> 선택적 항생제가 포함 된 5 ㎖의 LB의 pH를 8로 식민지를 선택하고 37 ° C에서 O / N 성장. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 열 정제 키트를 사용하여 DNA의 minipreps를 준비합니다. </li><li> 표준 페놀 - 클로로포름 격리 또는 유사한 프로토콜을 사용하여 BAC 미니 프렙 DNA를 준비합니다. </li><li> 미니 프렙 DNA에 RE 다이제스트를 수행합니다. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리 DNA. 정확한 표적화 벡터 단편의 예상 크기를 포함하는 클론을 확인하는 RE 패턴을 분석. 분명히 벡터 부족 삽입 (들) 및 삽입물을 포함하는 벡터를 구별 RE를 선택합니다. </li><li> 옵티오NAL : E. 여전히 존재한다 BAC, 결여되어 세포를 수득 대장균 recombineering 후 DH5alpha 또는 DH10B E.를 변환하는 플라스미드 미니 프렙 DNA를 사용하여 대장균 세포. </li><li> 올리고 합성의 오류를 확인하기 위해 HA 및 삽입 카세트를 통해 DNA 시퀀싱을 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+1+(HDAC1),+but+not+HDAC2,+controls+embryonic+stem+cell+differentiation.">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li><li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice.">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li><li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4.">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li><li>Hasty, P., Rivera-P&#233;rez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells.">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li><li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors.">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li><li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-strand-break+repair+model+for+recombination.">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li><li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F., Soriano, P. M., Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+pipeline+to+make+conditional+targeting+constructs.">A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs.</a> Methods Enzymol. 477, 125-144 (2010).</li><li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli.">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li><li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination.">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli.">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li><li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering.">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+&#955;+red+recombination.">An improved recombineering approach by adding RecA to &#955; red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li><li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria.">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting.">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li><li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecE/RecT+and+Redalpha/Redbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners.">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li><li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination.">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).</li><li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate.">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li><li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations.">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li><li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction.">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).</li><li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli.">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li><li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA.">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis.">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li><li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes.">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li><li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors.">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li><li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease.">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li><li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

ES 세포주 및 마우스 모델의 제작은 역사적 변성 대립 유전자를 포함하는 플라스미드 (4) 구조를 이용하여 표적 유전자를 포함하고있다. 그러나, 이러한 복잡한 유전자 타겟팅 벡터의 구성은 이러한 모델 적시 생산 상당한 병목 것으로 입증되었다. recombineering 기반 벡터 건설 전략의 개발은 개선 된 벡터 설계 및보다 효율적인 벡터 조립체를 허용했다. 그럼에도 불구하고, 현재의 recombineering 프로토콜은 여전히​​ 여러 단계를 포함하는 중간 플라스미드 정화를 필요로 다른 균주를 사용합니다. 플러스 삽입을 서브 클로닝하면 상주 BAC 호스트 변형 한 전기 이벤트에서 수행 할 수 벡터 건설에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 유전자 타겟팅에서 SPI의 유틸리티는 벡터 건설 다양한 응용 프로그램을 여기에 테스트되었습니다. 여기에 검사를 모든 경우에, SPI 효율적인 것으로 입증하고 올바른 재조합 플라스미드를 제조 하였다.대부분의 경우, 다른 복수의 카세트가 제대로 타겟팅 벡터에 삽입 하였다. 큰 DNA 카세트 및 벡터에 용이 SPI 프로토콜에 수용하고이 시스템의 융통성을 증명 하였다. SPI는 긴 상 동성 서열과 선형 DNA 카세트 포스 (PTO) 보호의 사용에 의존한다. PTO 수정은 선형 DNA (20, 21)에 exonucleases에 대한 보호를 부여하고 긴 HA 다중화를 허용하는 재조합 효율을 증가시킨다. 그러나, 더 긴 서열의 올리고 합성 에러에게 특히 결실 축적 가능성을 증가시킨다. 그들은 단백질 코딩 영역을 포함하는 경우 올리고 돌연변이 특히 유해 할 수 있습니다. DNA의 HA를 통해 시퀀싱 및 삽입 된 카세트의 전체 길이를 커버는 매우 어떤 순서 변경과 클론을 제거하는 것이 좋습니다. 고 충실도 DNA 폴리머 라제 시스템의 사용은 또한 도입을 피하기 위해 제안Y PCR 오류가 발생합니다. 서브 클로닝 플라스미드의 HA의 길이 및 조성이 삽입 카세트의 그것보다 상대적으로 중요하다 (데이터는 보이지 않음). 엑손 영역에 어떤 돌연변이가 용납되지 올림피아 벡터, 건설 등의 특히 중요한 애플리케이션의 경우, 삽입의 카세트 HA 긴 올리고와 연관된 문제를 피하기 위해 (50~120 BP)을 단축 할 수있다. 삽입은 카세트 (복제의 방향에 대한 지식을 사용할 수없는) 변성 또는 이중 phosphorothioated 남게 될 수있다. 그러나이 경우에 다중 여전히 긴 HA 서브 클로닝 플라스미드 보호가 필요합니다. 이 특정 전략의주의 할 점은 잠재적으로 다른 궤적에서 SPI 복제에 영향을 줄 수있는 다중 효율의 저하이다. 카세트 삽입 및 서브 클로닝 플라스미드의 길이는 SPI 클로닝 또 다른 중요한 파라미터이다. 큰 DNA 분자는 덜 효율적 electroporate 및 효과는 다시 주어진 누적동일한 셀의 모든 카세트를 도입하는 조건을 가지 (데이터는 보이지 않음). 다중 작은 삽입 카세트와 가장 효율적입니다. DNA보다 큰 3킬로바이트도 3킬로바이트 30까지 가장 효율적인 레드 매개 ssDNA의 처리에 제한을 두지 파편입니다. 3킬로바이트를 초과 삽입 카세트 절제된 듀얼하고 베타 독립적 인 통로 (20)를 통해 덜 효율적으로 재결합. 따라서, 정확한 복제를 식별 할 수있는 충분한 식민지의 심사는 이러한 경우에 중요합니다. 재조합 포스트 전기의 긴 기간은 어려운 SPI 운동의 올바른 클론의 회복의 가능성이 높아집니다. 4 개의 소형 카세트 (&lt;1.5 KB) 다중화 효율이 각각의 추가적인 카세트와 함께 감소하지만, SPI 프로세스와 동시에 삽입 될 수있는 최대 (데이타 미기재). 그러나 이것은 최적의 SPI 실험의 결과를 반영하며 많은 대형 카세트를 사용하는 경우 다중의 한계를 고려하는 것이 바람직하다. </P&gt; 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 같은 게놈 편집 도구의 개발은 (CRISPR) -cas9 효소 시스템은 새로운 게놈 수정의 생성을 활성화하고보다 효율적으로 게놈 엔지니어링 (36)하게되었다. 그러나 이러한 새로운 기술은 유전자 대상 벡터를 보완하기보다는 그들을 대신하게했다. 그것은 CRISPR-CAS 시스템은 항생제 선택을 교체하고 추가 멀티 플렉스 recombineering 프로토콜을 구체화 할 수 있다는 예상된다.

유전자 타겟팅 기술들의 개발은 다른 생물학적 시스템 1-3 조사 세포주 및 마우스 모델의 구성을 가능하게했다. 게놈 서열의 변형 키를 제 4 단계는 벡터를 표적 유전자의 설계 및 시공된다. 타겟팅 벡터는 선별 마커 (예를 들면, 네오 마이신)에 의해 측면 원하는 변형 (들)을 포함하는 관심있는 대립 유전자를 운반하는 플라스미드 구조체, 및 포유 동물 세포에서 5 ​​효율적인 상동 재조합에 필요한 긴 게놈 영역이다. 정확한 유전자 변형은 배아 줄기로 타겟팅 벡터의 도입 (ES) 세포를 6 또는 체세포 7에 의해 달성된다 타겟팅 벡터의 DNA 서열과 동일 뻗어 간의 상동 재조합과 의도 변형 예의 전사의 유전자좌 결과 유전자 변환 (8)에 의해 게놈. 그런 후 변형ED ES 세포는 배아 9 통해 이러한 대립 유전자 변형을 전송할 수있는 자손 (키메라)를 생성하기 위하여 마우스 포배 내로 주입 될 수있다. 트랜스 제닉 마우스를 제조하는 다른 경로는 마우스 게놈에서의 열 벡터의 임의의 통합에 이르게 단세포 마우스 접합체로 유전자 발현 벡터의 마이크로 인젝션을 포함한다. 벡터 건설의 전통적인 방법은 기존에 의존 한 벡터 백본에 다른 선택 마커 및 유전자 조각을 복제하는 제한 효소와 DNA 리가 제를 사용하여 복제 &#39;잘라 내기 및 붙여 넣기&#39;. 그러나, 기존의 복제 제한 요소는 고유 포지셔닝 및 제한 부위의 선택은 특히 긴 DNA 서열로이다. 이것은 종종 다수의 서브 클로닝 단계를 필요로하고 또한 종종 표적 유전자의 낮은 효율에 이르게 벡터 내로 외래 DNA 서열을 도입한다. Recombineering (재조합 성 ENGineering) E. 파아지 재조합 단백질에 의해 매개 된 상 동성 재조합 (HR)를 사용하여 이러한 한계를 극복 DNA 공학적이며 대장균 세포 (11, 12). 상동 서열의 어느 지역이 recombineering의 기판 역할을 할 수 있기 때문에, 제한 사이트의 가용성의 제약이 제거됩니다. 큰 DNA 서열은 따라서 원활 또한 구조적 일체 (13)을 보존, 생체 내에서 직접 변형 될 수있다. Recombineering 짧은 동성 (50 BP) (14), 따라서 동성 암 (HA)을 편리하게 합성 올리고 시퀀스에 통합 할 수 있습니다 매우 효율적입니다. 전형적인 recombineering 실험, 올리고 또는 ​​HA를 포함하는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 조각에서 recombineering 관할 E.에 electroporation됩니다 염색체 나 플라스미드 (15)에 하나있는 대상을 포함하는 대장균 세포. 재결합 가능성은 레드 녹화의 유도 식으로 수여ombination 파지 16, 17의 단백질 또는 RAC의 프로 파지 (18)의 RecET 단백질. 레드 / RECE의 엑소 뉴 클레아 제는 파트너, 레드 / RECT, 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAP) (19)에 의해 결합되어 중간 단일 가닥 DNA (ssDNA를), 선형의 dsDNA를 변환합니다. ssDNA를 길게하거나 상보 표적 서열에 짧은 올리고의 어닐링 복제 포크의 보온 가닥 발생 및 표적 부위에서 서열의 혼입에 이르게. 스트랜드 ssDNA를 재결합하는 래깅 recombineering의 높은 효율의 기초와 &#39;베타&#39;재결합 모델 (20, 21)에 의해 설명 될 수있다. 일반적인 recombineering 워크 플로우는 유전자 표적 벡터는 다음과 같은 두 가지 경로 중 하나를 포함 빌드합니다. 하나의 경로에 loxP 재조합 사이트 순차 삽입, 선택 마커이어서 플라스미드로 마우스 BAC 클론에서 원하는 게놈 영역을 서브 클로닝 포함 <s업&gt; (22) 등, 또는 대체 경로가 10,23을 recombineering 후 24, 25 복제 갭 수리하여 플라스미드로 수정 된 궤적을 서브 클로닝의 여러 라운드로 다른 타겟팅 벡터 요소 BAC 유전자좌를 대상으로 포함한다. 이 테마에 큰 변형 마우스 제작 프로그램 (26, 27)의 일부로서 다른 높은 처리량 recombineering 파이프 라인에서 사용되어왔다. 그러나, 이들 절차가 복잡하고 긴 스테이지들을 포함 특수 벡터와 E.의 사용을 필요 대장균 균주 (예, Cre 호텔은 발현 세포) 및 벡터 DNA를 정제하고 다시 변환 (표 1)의 하나 이상의 중간 단계를 이용한다. 플러스 삽입 (SPI)를 서브 클로닝하는 베타 재조합 단일 프로세스로 복제 갭 수리 (그림 1)를 결합하는 새로운 recombineering 기술이다. SPI 벡터 조립, 단순 신속하고 유연하며 표준 recombi에 상당한 개선을 제공합니다어링 (표 1)에 접근한다. 여기서는 용이성 및 비표준와 도전 벡터 디자인 구성에 특정 중점을 다른 벡터 건설 애플리케이션에 SPI를 사용하는 유틸리티를 보여준다. 테스트 케이스는 형광 리포터 올림피아 벡터의 구조, 듀얼 태그 올림피아 단백질 발현 벡터, BAC 형광 리포터 벡터 및 조건부 녹아웃 벡터를 포함. 이들은 각종 핵 단백질 복합체를 세포 표면 수용체 지역화 정화 요구 조건을 조사하거나 유전자의 발현을 브레이션.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.3K 조회수.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

비디오: Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

연구

생물학

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

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The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...