The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).

세포 배양 및 시약 1. 준비 <ol><li> 10 % (v / v)의 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지 불리는) 보충 제조자의 권장 배지에서 세포 배양을 유지한다. 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 세포 배양 플라스크 유지. 거꾸로 현미경으로 세포의 증식 및 포화 상태에 따라 (10X 위상 대비 목표를 사용). </li><li> 세포가 적절한 포화 상태에 도달하면, 배지를 제거하고 2-3 ㎖, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 배양을 씻는다. PBS를 제거하고 세포 배양 물 0.5 ㎖, 멸균 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 추가하고 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 트립신을 중지하고 멸균 원심 분리기 튜브로를 전송하는 데 3 ~ 4 mL의 멸균 완전 배지에서 세포를 일시 중단합니다. 실온에서 4 분 (RT) 150 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 무시하고 페이지를 일시 중단2 ~ 3 mL의 멸균 완전 배지에서 ellet. </li><li> 세포 현탁액 100 μL를 가지고 죽은 세포를 얼룩, 100 μL 0.4 % (m / V를) 트리 판 블루 용액을 혼합한다. 로드 혈구로이 혼합물을 10 μL와 도립 현미경으로 생존 세포의 수를 결정한다. </li><li> 4 × 104 세포 / ㎖를 함유하는 멸균 완전 배지 10 ㎖에 13 단계에서 제조 된 세포 현탁액의 요구량을 희석. </li><li> 첫 번째 유리 바닥 8 잘 현미경 슬라이드의 일곱 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 (104 세포 / 웰). 의 GnRH 흡수 방법이 슬라이드를 사용합니다. </li><li> 제 8 잘 현미경 슬라이드의 다섯 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 (104 세포 / 웰). 이 슬라이드는의 GnRH-IR 발현 방법에 사용된다. </li><li> 추가 1도 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액의 용액 (4 × 104 세포 / 웰) 일곱 아에12 웰 플레이트의 LS. 이 판은 GnRH의 정량 방법에 사용된다. </li><li> 세포는 두 현미경 슬라이드 플레이트에 부착하자. 48 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서이를 부화. </li><li> 배양 후 (10X 위상 대비 목표를 사용) 거꾸로 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포가 건강하고 연결된 경우 다음 단계를 계속 진행합니다. </li><li> 세 접합체 (18)의 각각에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 밀리미터의 GnRH-FITC 스톡 용액을 제조 하였다. 의 GnRH-I, 16.97 μg의 / μL [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II 및 16.47 μg의 / μL [리스 8 (16.43 μg의 / μL [D-리스 6 (FITC)] : (이 희석 농도를 사용하여 FITC)] -의 GnRH-III)을 실온에서 어두운 장소에서 이러한 재고 솔루션을 유지하고 몇 주 이내에 그들을 사용합니다. </li><li> 1.7 μL 1.7 mL를 완전 배지에서 10 세의 GnRH-FITC mM의 스톡 용액을 각각 희석. 이러한 솔루션을 흔들어. (살전전자 미디어의 치료 10 μM의 GnRH-FITC 수 있습니다.) 1.35 mL를 완전 배지에 150 μL 세 10 μM의 GnRH-FITC 치료 매체의 각 희석. 뿐만 아니라 이러한 솔루션을 흔들어 (이것들은 1 μM의 GnRH-FITC 치료 중간). 주 : 치료 매체를 포함하는 모든의 GnRH-FITC가 빛으로부터 보호하고 몇 시간 내에 사용하여야한다. </li><li> 37 ° C까지 6의 GnRH-FITC 처리 매체 (단계 1.12에서 제조) 및 4 mL의 완전 배지를 예열. </li><li> 5 mM의 형광 프로브 솔루션의 3 μL 5 μm의 3 mL의 PBS에 (재료 목록에 언급 된 핵 Counterstain과)를 희석. 이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다. </li></ol> 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) <ol><li> GnRH에 흡수 방법 <ol><li> 단계 1.6에서 제조 된 최초의 현미경 슬라이드를 타고 잘 칠 각각에서 전체 매체를 피펫. 예열이 완료 메디칼의 250 μL를 추가제 1 웰에 음. 음성 대조군으로 사용합니다. (1 μM, 3과 10 μM로 3 우물) 향후 6 우물 각 (1.13부터) 미디어를 처리 예열의 GnRH-FITC의 250 μL를 추가합니다. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> 각 웰의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 고정 용액 (10 % 중성 완충 포르말린)의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 고정 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫, 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 마지막으로, 각 웰에 장착 매체의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 이미징 때까지 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. </리&gt; </ol></li><li> 의 GnRH-IR 발현 방법 <ol><li> 단계 1.7에서 제조 된 제 8 잘 현미경 슬라이드를 타고 다섯 우물에서 각각 전체 매체를 피펫. </li><li> 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가이 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 너무 두 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가하고 GnRH에 처리하기 전에의 GnRH-IR 발현을 조사 할 때 사용합니다. </li><li> 향후 3 우물에 250 μL 세 예열 된 10 μM의 GnRH-FITC 치료 미디어의 각을 추가합니다. 의 GnRH-IR 발현을 조사하기 전에의 GnRH-FITC 접합체와 세포를 전처리하는이 우물을 사용합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> GnRH의 처리 후는 GnRH-IR의 발현을 조사하고 예열 된 완전 배지 250 μL 이러한 웰을 세척하는 데 사용되는 각각의 3 개 웰로부터 처리 매체를 피펫. 250 추가μL의 세 각 웰에 완전 배지를 예열. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> 다섯 우물 각각의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 솔루션을 고정의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 고정 솔루션을 피펫과 PBS 250 μL와 세포를 씻는다. 1 시간 동안, 각각의 웰에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블록 함유 PBS 용액 250 μL를 첨가하고 RT에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> (: 100 비율 1) 1 mL의 PBS에서의 GnRH-IR 차 항체의 10 μL를 희석. RT에 그것을 유지하고 몇 시간 내에 그것을 사용합니다. </li><li> 음성 대조군 (제 1도)를 제외한 각 웰에서 BSA 차단 솔루션을 피펫. (음성 대조군 잘 제외) 250 μL PBS로 세포를 씻으십시오. 250 μL PBS는 EAC로 단계 2.2.7에서 제조의 GnRH-IR 차 항체를 포함의 추가(음성 대조군 제외) 시간 잘. 어두운 곳에서, 1 시간 동안 RT에서 슬라이드를 부화. </li><li> (: 500 비율 1) 1.25 mL의 PBS에 알렉사 546 레이블 차 항체의 2.5 μL를 희석. 참고 :이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 다섯 우물 각각의 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 2.2.9에서 제조 된 AF 546 레이블 차 항체를 포함하는 PBS 250 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 용액을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 RT에서 10 분 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 후, 각 웰에 장착 미디어의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 어둠 속에서 슬라이드를 유지RT의 미세한 이미지까지. </li></ol></li><li> 영상 <ol><li> 이미지 (63X 오일 침지 대물 사용) 반전 공 초점 레이저 주사 현미경으로 세포 <ol><li> 다음 여기 / 방출 파장을 사용합니다. GnRH에 콘쥬 게이트 : 514분의 488 nm의 알렉사 546 표지 된 항체 : 546분의 488 나노 미터 (만의 GnRH-IR 표현 방법 사용), DRAQ5 형광 프로브 : 680분의 633 nm의. </li><li> 음성 대조군 세포를 이용한 촬상 파라미터를 설정한다. 이미지 처리 된 세포에 이러한 매개 변수 (그림 3)를 사용합니다. 재조정 분석의 시작에서 각각의 미세한 슬라이드에 촬상 파라미터. 필요한 경우 제조업체가 제공하는 소프트웨어와 미세 조정과 수출 이미지. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) <ol><li> GnRH에 정량 방법 <ol><li> 단계 1.8에서 제조 된 판을 가지고 개에서 완전 배지를 피펫일곱 우물 채널. 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 1 ML을 추가합니다. 음성 대조군으로 사용합니다. 추가 1 mL의 향후 6 우물에 미디어 (1 μM, 10 μM 3 우물 3 우물)을 치료 예열 여섯의 각. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 각 웰의 매체를 피펫. 조심스럽게 2 mL의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 각 우물에 트립신 EDTA 용액 500 μL를 추가합니다. 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 트립신을 중지 아니라 각에 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다. 접시를 흔들어. 피펫으로 부드럽게 세포를 일시 중지하고, FACS 튜브에 각 우물에서 현탁액을 전송합니다. 4 ℃에서 4 분 동안 150 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 하나의 움직임으로 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 세포를 일시 중지 다시 부드럽게 각 FACS 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 500 μL를 추가하고. 이 끝날 때까지 얼음에 튜브를 유지실험. </li></ol></li><li> 분석 및 계산 <ol><li> 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다. 여기 들어, 488 nm의 아르곤 레이저 파장을 사용하여 검출을위한 530 nm 파장을 사용한다. 음성 대조군 세포를 실행하여 매개 변수 흐름 cytometer를 설정합니다. 처리 된 세포 (그림 4A)을 분석하려면이 매개 변수를 사용합니다. 제조업체의 소프트웨어와 데이터를 평가 중간 형광 세기 (MFI) 값을 결정하고, MFI 상대 값을 계산한다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Innovations+in+Peptide+Based+Targeted+Drug+Delivery+to+Cancer+Cells.">Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells.</a> Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).</li><li>Majumdar, S., Siahaan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-mediated+targeted+drug+delivery.">Peptide-mediated targeted drug delivery.</a> Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).</li><li>Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH+in+non-hypothalamic+reproductive+tissues.">GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues.</a> Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).</li><li>Schally, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+hormones+and+cancer.">Hypothalamic hormones and cancer.</a> Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).</li><li>Limonta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH+receptors+in+cancer:+From+cell+biology+to+novel+targeted+therapeutic+strategies.">GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies.</a> Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).</li><li>Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+drug+delivery+system+based+on+gonadotropin-releasing+hormone+analogs:+Research+advances.">Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances.</a> J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).</li><li>Manea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+antitumour+effect+of+daunorubicin-GnRH-III+derivative+conjugates+on+colon+carcinoma-bearing+mice.">In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice.</a> Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).</li><li>Argyros, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-Drug+conjugate+gnrh-sunitinib+targets+angiogenesis+selectively+at+the+site+of+action+to+inhibit+tumor+growth.">Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth.</a> Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).</li><li>Karampelas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH-Gemcitabine+conjugates+for+the+treatment+of+androgen-independent+prostate+cancer:+pharmacokinetic+enhancements+combined+with+targeted+drug+delivery.">GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery.</a> Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).</li><li>Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+actions+of+GnRHs+mediated+by+ligand-induced+selective+signaling.">Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling.</a> Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).</li><li>Millar, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+receptors.">Gonadotropin-releasing hormone receptors.</a> Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).</li><li>Olberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+in+vitro+evaluation+of+small-molecule+[18F]+labeled+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH)+receptor+antagonists+as+potential+PET+imaging+agents+for+GnRH+receptor+expression.">Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression.</a> Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).</li><li>Zoghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Ga-68+labeled+triptorelin+analog+for+GnRH+receptor+imaging.">Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging.</a> Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).</li><li>Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+indium-111-labeled+gonadotropin-releasing+hormone+peptide+for+human+prostate+cancer+imaging.">A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging.</a> Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).</li><li>Nederpelt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+12+GnRH+peptide+agonists+-+A+kinetic+perspective.">Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective.</a> Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).</li><li>Szabo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+in+vitro+biological+evaluation+of+daunorubicin+containing+GnRH-I+and+GnRH-II+conjugates+developed+for+tumor+targeting.">Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting.</a> J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).</li><li>Leurs, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH-III+based+multifunctional+drug+delivery+systems+containing+daunorubicin+and+methotrexate.">GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate.</a> Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).</li><li>Mur&#225;nyi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization+and+systematic+comparison+of+FITC-labelled+GnRH-I,+-II+and+-III+analogues+on+various+tumour+cells.">Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells.</a> J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

실험은 선별을 위해 선택적으로 부착 표지의 GnRH 유사체를 사용하여 본원에 기재된 시험 관내 세포 배양. 공 초점 현미경과 세포 계측법 방법은 추적에 적합하고, 시간과 농도 의존적으로 이들의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량화되어 흐른다. 이 실험은 다음과 같은 중요한 단계 : 1) 멸균 건강한 세포 배양 물을 유지하는 단계; 2)의 GnRH 펩타이드는 고품질이어야합니다; 3) 적당한...

<html> 펩타이드 계 표적 약물 전달 시스템은 지난 몇 년 동안 1, 2를 통해 암 치료에 빠른 개발 및 유망 영역이되었다. 인간의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체 타입 I (는 GnRH-IR) 주로 뇌하수체에 위치뿐만 아니라 3자가 재생산을 담당 여러 다른 조직에 존재한다. 의 GnRH-IR은 생식계 -4,5- 관련된 또는 무관 한, 암 조직의 개수로 표현된다. 건강한 조직과 비교하여 여러 가지의 악성 종양 세포의 GnRH-IR의 높은 발현은 표적 치료 (5, 6)에 대한 기회를 제공한다. 많은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에) 유사체 잔기를 표적으로 사용할 수 지난 수십 년에 개발되어왔다F &quot;&gt; 7, 8, 9. 이러한 펩티드는 악성 종양 세포에 높은 선택성을 가진 항암제를 제공 할 수있는 위에 표현의 GnRH-IR 6. 대응하는 접합보다 높은 선택성 및 더 나은 효율 몇몇 GnRH의 공액 항암 약물 무료 약물, 9 8 7보고되었다. 의 GnRH 펩타이드 및 그 수용체에 대한 이전 서적은의 GnRH-IR은 GnRH에 10 유사체에 대해 서로 다른 선택이 다양한 입체를 가정 할 수 있다고보고했다. 고도로 변수의 GnRH-IR은 복잡하고 다양한 신호 전달 경로는 자연과 인공 리간드 (11)에 대한 다른 활동이 부여되어있다. 이러한 사실은 GnRH에 기반 시스템의 조사가 도전합니다. 한편,<html> Y는 유망한 치료 가능성을 가지고있다. 방사성 표지의 GnRH 펩티드와 몇 가지 실험을 이전하는 형광 표지의 GnRH 유사체가 사용 된 12, 13, 14, 15,하지만 실험을보고되었다 여전히 제한되어 있습니다. 방사성 표지는 고감도를 제공하는 동안, 형광 표식은 여러 다른 장점, 예를 들면, 취급이 용이하고, 다른 형광체와 Counterstain과 능력을 갖는다. 성공적 약물 전달에 사용 된 일반적인 세의 GnRH 유사체는 -GnRH-I, [D-리스가 6] -GnRH-II와의 GnRH-III 있지만 타겟팅 잔기 이들 펩타이드의 효과 인 [6 D-리스]입니다 거의, 17 (16)을 비교합니다. 한편, 다른 암세포의 GnRH 유사체 사용 된 별도의 실험 결과는 다양하다. 이러한 고려 사항을 바탕으로 ntent는 &quot;&gt; 우리는 이들의 GnRH 펩티드의 대상으로 종양 및 약물 전달의 가능성에 집중하여 합성하고, [D-리스 6 (FITC)] 특징 -의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC를 )] -는 GnRH-II 및 [리스 8 (FITC)] -의 GnRH-III 펩티드 접합체 (18)이 유사 선택적 그들의리스 또는 D-리스 (펩티드 FITC 비 측쇄 1 FITC로 표지되어 각각에서 하나. 접합체). 아이디어는 선택적 형광 표식이 펩티드에 대한 새로운 정보를 제공하고, 그 양호한 추적 및 신뢰성 정량화를 허용 할 수 있다고 하였다. 이들 콘쥬 게이트는 쉽게 그들의 종양 타겟팅 효율을 비교할 수 있도록 안전한 취급 및 신뢰성 검출 능력을 가지며, 악성 종양 세포의 많은 종류의 선별. 우리는 최대 이러한 펩티드 접합체와 날짜 실험의 GnRH - 약물 접합체를 타겟팅하는 신규 한 암의 발전에 기여하고, 새로운 치료 타르를 식별하는 데 도움이 될 수있는 희망뿐만 아니라 가져옵니다. 본 원고의 GnRH-FITC 접합체 일부 잘 재현하고 빠른 실험을 보여줍니다. 는 GnRH-R의 세포 표면 발현은 거기서 동시에 시험 세포주에서의 GnRH-IR의 세포 표면 수준을 조사, GnRH에 대한 흡수 한정적 조건이다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)으로의 GnRH-IR과의 GnRH-FITC 접합체를 시각화 한 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="496">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">EBC-1</td>
			<td style="width:79px;">JCRB Cell Bank</td>
			<td style="width:79px;">JCRB0820</td>
			<td style="width:191px;">Human lung squamous cell carcinoma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">BxPC-3</td>
			<td style="width:79px;">ATCC</td>
			<td style="width:79px;">CRL-1687</td>
			<td style="width:191px;">Human pancreatic adenocarcinoma</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:149px;">Detroit-562</td>
			<td style="width:79px;">ATCC</td>
			<td style="width:79px;">CCL-138</td>
			<td style="width:191px;">Human pharyngeal carcinoma</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:79px;">Lonza</td>
			<td style="width:79px;">BE12-702F</td>
			<td style="width:191px;">Culture medium for BxPC-3 cells</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:149px;">Eagle&#39;s Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:79px;">Lonza</td>
			<td style="width:79px;">&#160;BE12-611F</td>
			<td style="width:191px;">Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:79px;">Euro Clone</td>
			<td style="width:79px;">ECS0180L</td>
			<td style="width:191px;">Complements the culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">MycoZap Plus-CL&#160;</td>
			<td style="width:79px;">Lonza</td>
			<td style="width:79px;">VZA-2012</td>
			<td style="width:191px;">Complements the culture medium (antibiotics)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Standard Line Cell Culture Flasks</td>
			<td style="width:79px;">VWR</td>
			<td style="width:79px;">10062-872</td>
			<td style="width:191px;">Provide consistent, sterile growth environment for cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:149px;">Trypsin-EDTA Mixture&#160;</td>
			<td style="width:79px;">Lonza</td>
			<td style="width:79px;">BE17-161E</td>
			<td style="width:191px;">Remove attached cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:79px;">Lonza</td>
			<td style="width:79px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:79px;">D8418-100ML</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:149px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:79px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:79px;">15250061</td>
			<td style="width:191px;">Used to counting cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I</td>
			<td style="width:79px;">made by us</td>
			<td style="width:79px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Purity &#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II&#160;</td>
			<td style="width:79px;">made by us</td>
			<td style="width:79px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Purity &#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">[Lys8(FITC)]-GnRH-III</td>
			<td style="width:79px;">made by us</td>
			<td style="width:79px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Purity &#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">glass bottom 8-well microscopic slide</td>
			<td style="width:79px;">Ibidi</td>
			<td style="width:79px;">80826</td>
			<td style="width:191px;">Use in CLSM experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Corning Costar cell culture plate, 12 well</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:79px;">CLS3513-50EA</td>
			<td style="width:191px;">Use in FACS experiment</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:149px;">Fixing solution (10% neutral buffered formalin)</td>
			<td style="width:79px;">Bio-Optica</td>
			<td style="width:79px;">01V60P</td>
			<td style="width:191px;">Fix adherent cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:79px;">A7906-10G</td>
			<td style="width:191px;">Prevent the nonspecific binding of the antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:149px;">GnRHR Antibody</td>
			<td style="width:79px;">Proteintech</td>
			<td style="width:79px;">19950-1-AP</td>
			<td style="width:191px;">Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:149px;">Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:79px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:79px;">A11035</td>
			<td style="width:191px;">Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:149px;">Fluorescent probe solution (Draq5)</td>
			<td style="width:79px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:79px;">62254</td>
			<td style="width:191px;">Counterstain nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:79px;">F4680-25ML</td>
			<td style="width:191px;">Use in CLSM experiment, preserving fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:79px;">Elektro-Optika Ltd.&#160;</td>
			<td style="width:79px;">Alpha XDS-2T</td>
			<td style="width:191px;">Check the phenotype and confluency of cell cultures</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">Inverted confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:79px;">Zeiss</td>
			<td style="width:79px;">LSM-710</td>
			<td style="width:191px;">Use in CLSM experiment</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:149px;">Flow cytometer</td>
			<td style="width:79px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:79px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:191px;">Use in FACS experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro imaging and quantification of the drug targeting efficiency of fluorescently labeled gnrh analogues

의 GnRH 유사체 효과적인 표적 부분과 선택적으로 악성 종양 세포에있는 높은 표현의 GnRH 수용체에 항암제를 제공 할 수 있습니다. 그러나의 GnRH 유사체 &#39;세포 흡수의 정량 분석의 GnRH 계 약물 전달 시스템의 연구 세포 종류는 현재 제한된다. 이전에 도입, 선택적으로 표지 된 형광의 GnRH I, -II 및 -III 유도체 좋은 검출 감도를 제공하고, 그들은 재현하고 강력한 실험에 적합한 화학적 특성이 있습니다. 우리는 이러한 라벨의 GnRH 유사체에 해당하는 최신 방법은 GnRH에 기반 약물 전달 시스템에 대한 새로운 정보를 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II와 [리스 8 (FITC)] - GnRH에이 원고는 [D-리스 6 (FITC)]의 세포 흡수에 관한 몇 가지 간단하고 빠른 실험을 소개합니다 EBC-1 (폐)에 -III의 BxPC-3 (췌장)와 디트로이트-562- (인두)에 악성 tumor 세포. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로는 GnRH-I 수용체의 세포 표면 수준은 이전과 공 초점 레이저 주사 현미경으로 GnRH의 처리 후에 이들 세포주를 조사 하였다. 의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수는 형광 - 활성화 세포 선별에 의해 정량화 하였다. 이러한 실험에서의 GnRH 유사체 및 세포 유형 간의 주요 차이점 중 사소한 차이가 관찰되었다. 세포주 간의 유의 한 차이는 세포 표면의 GnRH-I 수용체의 자신의 고유 한 수준의 상관 관계가있다. 도입 된 실험은 시각화, 정량화 및 각종 접착 세포 배양에 시간과 농도 의존적으로의 GnRH-FITC 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실제적인 방법을 포함한다. 이러한 결과는 소정의 세포 배양에서의 GnRH 접합체 약물 타겟팅 효율을 예측하고, GnRH에 기반 약물 전달 시스템의 시험에서 추가 실험을위한 좋은 기초를 제공 할 수있다.

공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 얻어진 영상은 시간 및 농도 의존적으로 주어진 세포 배양에서의 GnRH-FITC 접합체의 흡수에 대한 훌륭한 정보를 제공한다. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병행하여, 세포 표면에의 GnRH-IR의 존재는 CLSM 실험에 의해 검증 가능하다. 또, 원적외선 DNA 염색 형광 프로브를 이용하여, 그것과는 GnRH의 GnRH-IR 외에도 세포의 핵을 Counterstain과 수있다....

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In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다.

체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

in-vitro-imaging-quantification-drug-targeting-efficiency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

7.5K 조회수.  Semmelweis University.  선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다. 

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found overexpressed in many diseases, including cancer. TGF-&#946; is strongly implicated in metastasis during late stage cancer progression, activating a subset of migratory and invasive tumor cells. Current methods for signaling pathway analysis focus on endpoint models, which often attempt to measure signaling post-hoc of the biological event and do not reflect the progressive nature of the disease. Here, we demonstrate a novel adenovirus reporter system specific for the TGF-&#946;/Smad3 signaling pathway that can detect transcriptional activation in live cells. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. The use of a fluorescent reporter allows for imaging of live single cells in real-time with direct identification of transcriptionally active cells. Stimulation of infected cells with TGF-&#946; displays only a subset of cells that are transcriptionally active and involved in specific biological functions. This approach allows for high specificity and sensitivity at a single cell level to enhance understanding of biological functions related to TGF-&#946; signaling in vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 transcriptional activity of cells implanted in vivo can be analyzed through conventional IVIS imaging and monitored live during tumor progression, providing unique insight into the dynamics of the TGF-&#946; signaling pathway. Our protocol describes an advantageous reporter delivery system allowing for quick high-throughput imaging of live cell signaling pathways both in vitro and in vivo. This method can be expanded to a range of image based assays and presents as a sensitive and reproducible approach for both basic biology and therapeutic development.

Here, we present a protocol for live cell imaging of TGF-&#946;/Smad3 signaling activity using an adenovirus reporter system. This system tracks transcriptional activity in real-time and can be applied to both single cells in vitro and in live animalmodels.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic spread has already occurred. However, ovarian cancer has a unique pattern of metastatic spread, in that tumor implants are initially contained within the peritoneal cavity. This feature could enable, in principle, the complete resection of tumor implants with curative intent. Many of these metastatic lesions are microscopic, making them hard to identify and treat. Neutralizing such micrometastases is believed to be a major goal towards eliminating tumor recurrence and achieving long-term survival. Raman imaging with surface enhanced resonance Raman scattering nanoprobes can be used to delineate microscopic tumors with high sensitivity, due to their bright and bioorthogonal spectral signatures. Here, we describe the synthesis of two &#39;flavors&#39; of such nanoprobes: an antibody-functionalized one that targets the folate receptor &#8212; overexpressed in many ovarian cancers &#8212; and a non-targeted control nanoprobe, with&#160;distinct spectra. The nanoprobes are co-administered intraperitoneally to mouse models of metastatic human ovarian adenocarcinoma. All animal studies were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The peritoneal cavity of the animals is surgically exposed, washed, and scanned with a Raman microphotospectrometer. Subsequently, the Raman signatures of the two nanoprobes are decoupled using a Classical Least Squares fitting algorithm, and their respective scores divided to provide a ratiometric signal of folate-targeted over untargeted probes. In this way, microscopic metastases are visualized with high specificity. The main benefit of this approach is that the local application into the peritoneal cavity &#8212; which can be done conveniently during the surgical procedure &#8212; can tag tumors without subjecting the patient to systemic nanoparticle exposure. False positive signals stemming from non-specific binding of the nanoprobes onto visceral surfaces can be eliminated by following a ratiometric approach where targeted and non-targeted nanoprobes with distinct Raman signatures are applied as a mixture. The procedure is currently still limited by the lack of a commercial wide-field Raman imaging camera system, which once available will allow for the application of this technique in the operating theater.

Ovarian cancer forms metastases throughout the peritoneal cavity. Here, we present a protocol to make and use folate-receptor targeted surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobes that reveal these lesions with high specificity via ratiometric imaging. The nanoprobes are administered intraperitoneally to living mice, and the derived images correlate well with histology.

표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

체외 및 비보에서 마우스 수지상 세포를 대상으로 하는 전체 길이 단백질을 가진 정제 된 DEC-205 지향 항체의 화학 적 융합

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...