이 프로토콜은 전임상 유방암 모델에서 정밀도와 효율성을 증가, 유방암 관련 죽음의 공격적이고 일반적인 원인인 폐 전이를 정량화합니다. 원래 기술에 비해,이 프로토콜은 연구원에게 더 빠르고 일관된 결과를 제공합니다. 사용하기 쉬운 컴퓨터 기술을 통해 사람의 계산 오류를 완화합니다.
이 기술은 연구원이 성공적인 처리 다음 감소 전이성 부담을 입증하는 것을 허용해서 폐 전이에 유방암 치료의 효력을 연구하는 전임상 연구로 절대적으로 확장될 수 있습니다. 조직 샘플을 위해 15 밀리리터 원원튜브를 라벨링하여 시작합니다. 그런 다음 4형 콜라게나아제 혼합물의 2.5밀리리터와 30단위의 엘라스타아제를 튜브에 첨가한다.
깨끗한 1X HBSS로 폐를 잘 이동시키고 남은 혈액을 제거하기 위해 집게로 소용돌이치고 빈 3.5 센티미터 조직 배양 판으로 옮춥시다. 가위로 폐를 다진 다음, HBSS2.5 밀리리터로 플레이트를 헹구고 폐 조각으로 HBSS를 콜라게나아제와 엘라스타제 칵테일로 준비된 15 밀리리터 원뿔 튜브로 옮습니다. 로커 또는 회전 휠에서 섭씨 4도에서 75분 동안 튜브를 배양합니다.
한편, 각 마우스에 대해 50밀리리터 원심분리기 튜브와 10센티미터 조직 배양 플레이트 1개를 라벨로 지정합니다. 희석을 하는 경우 희석을 위해 충분한 조직 배양 판을 라벨로 지정합니다. 1X HBSS로 튜브의 부피를 최대 10 밀리리터로 가져온 다음 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원유형 튜브에 내용물을 붓습니다.
1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 샘플을 부드럽게 갈아냅니다. 350회 G에서 5분간 튜브를 원심분리하고 상류제를 폐기한 다음 1X HBSS 10밀리리터로 펠릿을 두 번 세척합니다. 펠릿을 60 마이크로몰라 6-티오구아닌 완전 배양 배지의 10밀리리터로 재보중단하고, 원하는 경우 희석 체계를 이용하여 10cm 세포 배양판에서 샘플을 플레이트한다.
5일 동안 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 접시에서 배양 미디어를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 세포를 고치려면 각 플레이트에 희석되지 않은 메탄올 5밀리리터를 넣고 실온에서 5분 동안 배양하여 메탄올전체를 덮도록 합니다.
메탄올을 접시에서 적절한 폐기물 용기에 붓고 각 접시에 증류수 5밀리리터로 헹구습니다. 플레이트당 0.03%의 메틸렌 블루 5밀리리터를 추가하고 실온에서 5분간 배양하여 메틸렌 블루 용액을 소용돌이시켜 전체 플레이트를 덮습니다. 메틸렌 블루를 적절한 폐기물 용기에 붓고 5밀리리터의 증류수로 각 접시를 다시 헹구십시오.
접시를 거꾸로 뒤집어 종이 타월에 얼룩을 두어 여분의 액체를 제거합니다. 접시를 뚜껑에 놓고 밤새 공기를 건조시키십시오. 전이성 식민지는 파란색이 될 것입니다.
플레이트가 건조되면 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다. 샘플의 명확한 식별을 보장하기 위해 주의, 플레이트에서 라벨 된 뚜껑을 제거합니다. 깨끗하고 밝은 표면에 얼룩진 모든 폐 판을 정렬합니다.
조명이 잘 된 공간에서 플레이트 컬렉션을 촬영하여 반사를 최소화하십시오. 플레이트의 반사는 이미지 분석에 영향을 미치며 피해야 합니다. 찍은 사진에 주의를 기울이고 여러 각도에서 여러 장의 사진을 찍습니다.
플레이트를 촬영한 후 이미지를 자르면 뚜껑이나 백그라운드에서 아무것도 제외합니다. 피지 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지를 클릭하여 흑백으로 변경, 조정 및 색상 임계값. 그런 다음 임계값 에 대한 기본값, 임계값 색상에 대한 흑백 및 색상 공간에 대한 랩을 선택합니다.
어두운 배경 상자가 선택되지 않았는지 확인합니다. 이제 이미지가 흑백이어야 합니다. 검은색은 밝은 배경을 나타내고 흰색은 파란색 전이성 콜로니를 나타냅니다.
원 도구를 사용하여 분석할 영역을 선택합니다. 각 플레이트가 동일한 크기의 영역에 대해 분석되도록 모든 플레이트에 사용할 원 1개를 그립니다. 플레이트 가장자리에 나타나는 배경 잡음을 최소화하면서 플레이트의 분석 영역을 최대화하는 크기를 선택합니다.
크기가 그릴 때 도구 모음에 나타납니다. 선택한 원을 분석하여 흰색 영역의 백분율을 결정합니다. 파티클을 분석하고 분석한 다음 크기에 대해 0에서 무한대로, 원형에 대해 0에서 1로 선택하고 표시할 수 없습니다.
요약 된 상자를 확인하고 괜찮아. 원을 중앙에 잡고 해석을 반복하여 그림의 다음 플레이트로 이동합니다. 결과를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
선택한 영역의 백분율인 백분율 영역은 전이성 부담을 나타냅니다. 모든 플레이트와 이미지를 분석한 결과 각 플레이트의 서로 다른 이미지 간의 백분율 영역 결과를 평균하여 사진 간의 불일치를 완화합니다. 피지 ImageJ 분석은 수동 계수 및 조직 병리학 적 분석과 비교되었다.
3명의 개별 연구원이 수동으로 전이성 식민지를 계산했을 때, 결과는 카운터 사이에서 일치하지 않았습니다. 피지 ImageJ 결과는 세 이미지 각각에 대한 카운터 사이에 일관성이 있었다. 3개의 심상및 3개의 카운터에서 결과는 각 폐 판에 대해 결합되었습니다.
결과는 카운터 사이의 일관된 결과를 제공하는 이미지 사이의 변형을 설명하기 위해 각 플레이트에 대해 평균화되었습니다. 대부분의 전이성에서 가장 적은 전이성까지 플레이트를 순위를 매길 때 수동 계산은 가장 혼잡한 플레이트에 동의했지만 다음 순위는 모두 일치하지 않았습니다. 평균 피지 ImageJ 결과에서 순위는 카운터 사이 훨씬 더 일관성 했다.
이미지의 반사를 피하는 것의 중요성을 입증하기 위해 손의 반사와 후속 피지 ImageJ 분석이 반사되지 않은 동일한 플레이트의 이미지와 함께 표시됩니다. 더러운 배경 표면이나 플레이트의 혈액 샘플 잔류물에서 어두운 결점이 피지 ImageJ 분석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 혈액 판은 두 개의 전이성 식민지를 가지고 있지만 어두운 잔류물은 피지 ImageJ가 31.6 %의 전이성으로 간주하게했습니다.
이 프로토콜을 시도할 때는 반사를 위해 사진을 주의 깊게 검사하고, 이미지의 각 플레이트에 대해 동일한 크기의 원을 사용하고, 각 플레이트의 결과를 적어도 세 개의 개별 이미지 간에 평균화해야 합니다.
