우리는 기술 지원 스벤 플래스합니다. 글 리아 - 블루 형질 전환 라인은 그레고르 버처 (괴팅겐, 독일)에서 일종의 선물이었다. 이 연구는 괴테의 Buchmann 분자 생명 과학 연구소 (BMLS, 감독 엔리코 슐레이프)에서 EHKS 부분적으로 부여 Macromolecular의 단지 (CEF-MC, EXC (115), 스피커 폴커 도이치)에 대한 암마 우수 프랑크푸르트의 클러스터에 의해 투자되었다 Universität 프랑크푸르트 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 홈페이지입니다.

저자가 공개하는 게 없다. 저자 공헌 FS 및 EHKS는 연구를 잉태. FS는 유전자 변형 AGOC 라인을 생성. 광 시트 계 형광 이미징 FS 및 SK에 의해 수행되었다. FS 및 EHKS는 SK의 의견으로 원고를 썼다.

품질 관리 라이브 영상 분석에서, 준비 및 녹음 과정은 기계적 및 화학적 처리 (샘플 홀더에 장착 수집, dechorionation)도 관찰 기간 동안 집단 에너지 부하도, 즉 표본의 생존에 영향을해야, 비 침습적해야합니다. WT 개발의 특성을 연구 들어, 배아가 성공적으로 검색되고, 녹음 과정을 생존하고 건강한 성인으로 발전하는 실험에서만 사용 데이터를 권장합니?...

어둠 속에의 딱정벌레의 대가족 (Tenebrionidae)에 속하는 붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum는 농업 및 생명 과학에서 오랜 역사를 가지고와 과일에 이어 두 번째로 최고의 연구 모델 곤충 모델 생물은 노랑 초파리 비행입니다. 지난 사십 년 동안, 여러 가지 이유로 배아 형태 형성에서, 지난 20 년 동안, 진화 발생 생물학의 발달 유전학 강력하고 인기있는 곤충 모델 생물되었고 : 초파리와 Tribolium 모두는 Holometabola에 속하지만, 약 300 만 년 전 1, 2, 3, 4 분기. 높은 파생 초파리의 배아 발달이 일반적으로 생각하는 동안, Tribolium는 (STABLE)보다 조상 모드를 보여줍니다곤충 종 5, 6, 7, 8, 9의 상당히 큰 비율로 발견 클럽 봉사. 그 구기 및 안테나는 배아 10, 11, 12, 13, 14, 15 중 이미 출현 즉 첫째 Tribolium는 비 involuted 헤드 현상을 나타낸다. 둘째, Tribolium는 짧은 배아 발달, 즉 복부 세그먼트 germband 신도는 16, 17, 18, 19 중 후방 성장 구역으로부터 순차적으로 추가의 원리를 따른다. 셋째, Tribolium 개발하고 나중에 저하두 개의 별도의 배아 멤브레인은 복부를 커버 배아 양막, 완전히 20, 21, 22 배를 감싸고 장막을 즉. 두 막은 중요한 형태 발생 (23)뿐만 아니라 미생물 24, 25 및 탈수 (26)에 대한 보호 역할을한다. 넷째는 embryonically 개발 다리는 애벌레 삶의 단계에서 완벽하게 작동하며, 번데기 변태 27, 28, 29, 30, 31 중 성인 다리의 primordia 역할을합니다. 때문에 작은 크기와 겸손한 요구에, 실험실에서 Tribolium의 재배는 매우 간단합니다. 야생형의 문화 (WT) 균주 또는 형질 전환 라인들은 전형적으로 약 100-300 성인 구성 및 전체 그레인 밀 구성 성장 배지 서너 센티미터 (약 50g 충전 한 리터 유리 병 (발자국 80cm 2)) 내에서 유지 될 수있다 밀가루는 비활성 건조 효모와 보충. 물 공급이 필요하지 않습니다. 이 소형 또는 중간 크기 상업적으로 이용 가능한 곤충 인큐베이터 내에서 딱정벌레 문화의 수십 유지하기 위해 아주 작은 실험실을 할 수 있습니다. Tribolium 이후 발달 단계 (유충 후 약 네번째 령, 번데기 어른) 쉽게 체질하여 성장 배지로부터 분리된다. 동기화 배아 알을 낳는 매체 단기간 성인 배양함으로써 얻어진다. 재고 유지는 일반적으로 22 ~ 25 ℃에서 수행되는 동안 급속한 발전을 위해, 딱정벌레 문화가 32 ° C (세대 당 약 4 주)에 보관 (약 십주 세대 당). 지난 십 년간 내에서, 많은 표준 절반신흥 모델 생물 책 (32)에 요약 된 바와 같이 hniques 점차 적응 Tribolium 위해 최적화되었다. 매우 중요한 배아 (33) 유전 적 방법, 유충 34, 35 또는 부모 36, 37 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운, 어느 피기 38, 39 또는 미노스 40 트랜스 장치 및 CRISPR / Cas9 기반 게놈 생식선 변환 전진 엔지니어링 41. 또한, Tribolium 게놈은 10 년 전의 42 내지 약 서열화되었으며, 효율적인 게놈 전체의 식별 및 유전자 44 체계적 분석이 가능 조립체 (43)를 해제 게놈 번째 라운드에서 지금 </s업&gt; 또는 기타 유전 적 요소 (45), (46). 또한, 다른 네 coleopteran 종의 게놈 비교 유전자 접근법 47, 48, 49, 50 가능하다. 게놈 시퀀싱에 대응하여 두 개의 대규모 유전자 분석은 삽입 성 돌연변이 유발의 스크린 (51) 및 체계적 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운 화면 (52), (53), 즉, 실행되었다. 위드, 촛점 또는 광 시트 기반 현미경 (LSFM)와 형광 라이브 영상 다차원 컨텍스트 (표 1)에서 시간의 함수 (즉, 형태 형성)로서 Tribolium 배아의 형태를 관찰 할 수있다. 위드와 공 초점 형광 현미경에서, excitATION과 출사 광은 동일한 대물 렌즈를 통해 안내된다. 두 접근법에서, 전체 시료마다 기록 된 2 차원 평면에 대해 조사된다. 따라서, 표본은 매우 높은 에너지 레벨을 실시한다. LSFM에서, 초점면에서 단지 형광 인해 두 개의 수직 배열 대물 렌즈 (도 1)를 이용하여 조명 및 검출 디커플링 기쁘게. 단일 평면 조명 현미경 (SPIM)와 디지털 스캔 레이저 광 시트 기반의 형광 현미경 (DSLM, 그림 2) - - LSFM 두 규범적인 구현으로 제공하고 기존의 방법에 비해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다 : (I) 고유의 광학 절편 기능, (ⅱ) 좋은 축 해상도, (Ⅲ) 광 표백 강하게 감소 레벨 (IV)의 매우 낮은 광 독성, (V)이 높은 신호대 잡음비 (VI)의 비교적 높은 수집 속도 (VII) 이미징 여러 방향 및 (VI 함께낮아서 개구 조사 대물 렌즈 (54), (55), (56)의 사용과 ⅱ) 깊은 조직 침투. LSFM 이미 성공적으로 거의 전체 배아 형태 형성 57을 기록하고 지느러미 폐쇄 (23)의 시작 부분에 여분의 배아 막 파열의 원칙을 분석 Tribolium에 적용되었습니다. 현미경은 편의성 될 곳은 표준 운영 절차를 수립하고, 방법, 프로토콜과 수준으로 자원의 풀을 개선하기 위해 매우 중요하다의 Tribolium 지역 사회와 일반 곤충 과학에 대한 LSFM의 매력을 높이려면 발달 생물학 실험실에서 표준 도구를 -USE, 생물학적 질문 관심의 중심에있어. 이 프로토콜은 Tribolium의 기초 &lt;시작/ EM&gt; 재배, 즉 유지 보수, 복제 및 배아 수집. 다음으로, 두 실험 전략들이 도시되어있다 : (I) 라이브 주문품 제닉 라인 화상 및 형광 염료 (표 2)으로 염색 하였다 고정 배아 (II) 촬상. (I) 아가로 오스 컬럼 (II) 아가 반구 및 (iii) 신규 거미줄 보유자 :이어서, 약간 다른 목적 세 실장 기술 상세 (도 3 및 표 3)에 설명되어있다. 이 프로토콜은 다음 LSFM와 데이터 수집 절차를 설명합니다. 이미징 양식 및 주요 고려 사항이 설명되어 있습니다. 마지막으로, 배아 검색 설명한다 기본 데이터 처리를위한 제안을 제공한다. 대표적인 결과, 라이브 영상 데이터 개의 신규 주문 제작 및 글 리아 블루 58 개 트랜스 제닉 라인이 도시되어 있고, 각 촬상 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 또한, 이미지형광 염료의 다양한 염색 고정 배아의 데이터가 표시된다. 토론은 품질 관리, 라이브 이미징 방식의 전류 제한 및 다른 종의 프로토콜의 적응에 초점을 맞추고 있습니다. 프로토콜은 샘플 챔버 통상적 직경 금속, 플라스틱 또는 유리로 만들어진 원통형 요소 표준 시료 홀더 (54), (59), (60)에 대해 회전 가능한 클램프기구가 장착되어 광 시트 계 형광 현미경 작성된 밀리미터 범위이다. 이 프로토콜은 두 규범적인 구현 예 및 SPIM DSLM뿐만 아니라 둘 이상의 조명 및 검출 아암 (61) (62) (63)에 대한 설정에 적합하다. 대표적인 결과는 두 채널의 스펙트럼 데이터를 표시, 녹색 (IL488 nm의 레이저 검출 관통 필터 대역 통과 70분의 607 관통 필터)와 레드 (a 561 nm의 레이저로 조명 검출 대역 통과 50분의 525)하지만, 프로토콜 lumination 서너 스펙트럼 채널로 확장 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">full grain wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">405 fine wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: pastry flour, UK: soft flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">inactive dry yeast</td>
			<td style="width:119px;">Flystuff / Genesee Scientific</td>
			<td style="width:71px;">62-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">425044-250ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">low-melt agarose</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass capillaries, internal &#216; 0.46 mm</td>
			<td style="width:119px;">Brand GmbH + Co KG</td>
			<td style="width:71px;">7087 09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">SYTOX Green</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">57020</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">YOYO-1 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">Y3601</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">BOBO-3 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">B3586</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A22283</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 800 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-051</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 710 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-050</td>
			<td style="width:167px;">for growth medium preparation (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 300 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-040</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 250 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-038</td>
			<td style="width:167px;">for egg laying medium preparation (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass dish, &#216; 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">CLS70165102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">cell strainer, 100 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:71px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">paint brush, head &#216; 2 mm</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">149-2121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">syringe, 1.0 ml</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun Medical AG</td>
			<td style="width:71px;">9166017V</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">scintillation vials</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">M1152-1000EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">158127</td>
			<td style="width:167px;">Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">n-heptane &#8805; 99%</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">8654.1</td>
			<td style="width:167px;">Caution: n-heptane is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Trition X-100 is corrosive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum 발달 유전학 진화 발생 생물학에서 중요한 곤충 모델 생물이되었다. 광 시트 계 형광 현미경 Tribolium 태아의 관찰은 통상 위드와 공 초점 형광 현미경을 통해 여러 장점을 갖는다. 인해 광 시트 기반 현미경의 고유 특성에 살아있는 검체의 3 개 차원 이미지는 높은 신호대 잡음비로 기록 될 수 있고 상당히 여러 지속 기간 동안 광 탈색뿐만 아니라, 다 방향을 따라 광 독성 감소 일. 방법론 개발 및 지속적인 데이터 증가의 4 년 이상으로, 시간은 Tribolium 지역 사회에서 빛 시트 기술의 사용에 대한뿐만 아니라 곤충 사회에서 큰에서 표준 운영 절차를 수립하는 것이 적절 보인다. 이 프로토콜은 F 적합한 세 실장 기술을 설명또는 다른 목적은, 장기 라이브 영상에 적합한 두 개의 새로운 맞춤형 유전자 변형 Tribolium 라인을 제시 고정 배아의 세포 내 구조 레이블을 다섯 형광 염료를 제안하며, 기록 된 데이터의 적절한 평가를위한 데이터 후 처리에 대한 정보를 제공합니다. 대표 결과 장기 라이브 영상 광학 절편 복수 방향을 따라 동일한 태아의 관찰에 집중한다. 각 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 마지막으로, 프로토콜은 라이브 영상 분석, 전류 제한 및 다른 곤충 종에 설명 된 절차의 적용을위한 품질 관리에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 주로 표준 실험실 장비를 능가 이미징 솔루션을 추구 발달 생물 학자를위한 것입니다. 그것은 개발하고 마이크로을 수정 기술적으로 지향 실험실 / 지역 사회 사이의 격차를하기 위해 지속적인 시도를 촉진방법 론적으로 복사 및 기술 문제에 &#39;플러그 앤 플레이&#39;솔루션을 필요로 생명 과학 연구소 / 사회. 또한, 관심의 중심에 생물학적 질문을 움직이는 공리 접근 방식을 지원합니다.

이 프로토콜은 생활의 형광 이미징 또는 LSFM와 고정 및 스테인드 Tribolium 배아에 대한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 인해 광 표백 광 독성, 그 단면 광학 성능의 직접적인 결과의 낮은 수준으로, LSFM 장기 라이브 영상에 특히 적합하다. 신규 AGOC {} mEmerald ATub&#39;H2B-1 형질 전환 라인은 알파 - 튜 불린 1 촉진제 <sup ...

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Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

10.5K 조회수.  Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS).  광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다. 

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드

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