Name: light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
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우리는 기술 지원 스벤 플래스합니다. 글 리아 - 블루 형질 전환 라인은 그레고르 버처 (괴팅겐, 독일)에서 일종의 선물이었다. 이 연구는 괴테의 Buchmann 분자 생명 과학 연구소 (BMLS, 감독 엔리코 슐레이프)에서 EHKS 부분적으로 부여 Macromolecular의 단지 (CEF-MC, EXC (115), 스피커 폴커 도이치)에 대한 암마 우수 프랑크푸르트의 클러스터에 의해 투자되었다 Universität 프랑크푸르트 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 홈페이지입니다.

저자가 공개하는 게 없다. 저자 공헌 FS 및 EHKS는 연구를 잉태. FS는 유전자 변형 AGOC 라인을 생성. 광 시트 계 형광 이미징 FS 및 SK에 의해 수행되었다. FS 및 EHKS는 SK의 의견으로 원고를 썼다.

품질 관리 라이브 영상 분석에서, 준비 및 녹음 과정은 기계적 및 화학적 처리 (샘플 홀더에 장착 수집, dechorionation)도 관찰 기간 동안 집단 에너지 부하도, 즉 표본의 생존에 영향을해야, 비 침습적해야합니다. WT 개발의 특성을 연구 들어, 배아가 성공적으로 검색되고, 녹음 과정을 생존하고 건강한 성인으로 발전하는 실험에서만 사용 데이터를 권장합니?...

어둠 속에의 딱정벌레의 대가족 (Tenebrionidae)에 속하는 붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum는 농업 및 생명 과학에서 오랜 역사를 가지고와 과일에 이어 두 번째로 최고의 연구 모델 곤충 모델 생물은 노랑 초파리 비행입니다. 지난 사십 년 동안, 여러 가지 이유로 배아 형태 형성에서, 지난 20 년 동안, 진화 발생 생물학의 발달 유전학 강력하고 인기있는 곤충 모델 생물되었고 : 초파리와 Tribolium 모두는 Holometabola에 속하지만, 약 300 만 년 전 1, 2, 3, 4 분기. 높은 파생 초파리의 배아 발달이 일반적으로 생각하는 동안, Tribolium는 (STABLE)보다 조상 모드를 보여줍니다곤충 종 5, 6, 7, 8, 9의 상당히 큰 비율로 발견 클럽 봉사. 그 구기 및 안테나는 배아 10, 11, 12, 13, 14, 15 중 이미 출현 즉 첫째 Tribolium는 비 involuted 헤드 현상을 나타낸다. 둘째, Tribolium는 짧은 배아 발달, 즉 복부 세그먼트 germband 신도는 16, 17, 18, 19 중 후방 성장 구역으로부터 순차적으로 추가의 원리를 따른다. 셋째, Tribolium 개발하고 나중에 저하두 개의 별도의 배아 멤브레인은 복부를 커버 배아 양막, 완전히 20, 21, 22 배를 감싸고 장막을 즉. 두 막은 중요한 형태 발생 (23)뿐만 아니라 미생물 24, 25 및 탈수 (26)에 대한 보호 역할을한다. 넷째는 embryonically 개발 다리는 애벌레 삶의 단계에서 완벽하게 작동하며, 번데기 변태 27, 28, 29, 30, 31 중 성인 다리의 primordia 역할을합니다. 때문에 작은 크기와 겸손한 요구에, 실험실에서 Tribolium의 재배는 매우 간단합니다. 야생형의 문화 (WT) 균주 또는 형질 전환 라인들은 전형적으로 약 100-300 성인 구성 및 전체 그레인 밀 구성 성장 배지 서너 센티미터 (약 50g 충전 한 리터 유리 병 (발자국 80cm 2)) 내에서 유지 될 수있다 밀가루는 비활성 건조 효모와 보충. 물 공급이 필요하지 않습니다. 이 소형 또는 중간 크기 상업적으로 이용 가능한 곤충 인큐베이터 내에서 딱정벌레 문화의 수십 유지하기 위해 아주 작은 실험실을 할 수 있습니다. Tribolium 이후 발달 단계 (유충 후 약 네번째 령, 번데기 어른) 쉽게 체질하여 성장 배지로부터 분리된다. 동기화 배아 알을 낳는 매체 단기간 성인 배양함으로써 얻어진다. 재고 유지는 일반적으로 22 ~ 25 ℃에서 수행되는 동안 급속한 발전을 위해, 딱정벌레 문화가 32 ° C (세대 당 약 4 주)에 보관 (약 십주 세대 당). 지난 십 년간 내에서, 많은 표준 절반신흥 모델 생물 책 (32)에 요약 된 바와 같이 hniques 점차 적응 Tribolium 위해 최적화되었다. 매우 중요한 배아 (33) 유전 적 방법, 유충 34, 35 또는 부모 36, 37 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운, 어느 피기 38, 39 또는 미노스 40 트랜스 장치 및 CRISPR / Cas9 기반 게놈 생식선 변환 전진 엔지니어링 41. 또한, Tribolium 게놈은 10 년 전의 42 내지 약 서열화되었으며, 효율적인 게놈 전체의 식별 및 유전자 44 체계적 분석이 가능 조립체 (43)를 해제 게놈 번째 라운드에서 지금 </s업&gt; 또는 기타 유전 적 요소 (45), (46). 또한, 다른 네 coleopteran 종의 게놈 비교 유전자 접근법 47, 48, 49, 50 가능하다. 게놈 시퀀싱에 대응하여 두 개의 대규모 유전자 분석은 삽입 성 돌연변이 유발의 스크린 (51) 및 체계적 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운 화면 (52), (53), 즉, 실행되었다. 위드, 촛점 또는 광 시트 기반 현미경 (LSFM)와 형광 라이브 영상 다차원 컨텍스트 (표 1)에서 시간의 함수 (즉, 형태 형성)로서 Tribolium 배아의 형태를 관찰 할 수있다. 위드와 공 초점 형광 현미경에서, excitATION과 출사 광은 동일한 대물 렌즈를 통해 안내된다. 두 접근법에서, 전체 시료마다 기록 된 2 차원 평면에 대해 조사된다. 따라서, 표본은 매우 높은 에너지 레벨을 실시한다. LSFM에서, 초점면에서 단지 형광 인해 두 개의 수직 배열 대물 렌즈 (도 1)를 이용하여 조명 및 검출 디커플링 기쁘게. 단일 평면 조명 현미경 (SPIM)와 디지털 스캔 레이저 광 시트 기반의 형광 현미경 (DSLM, 그림 2) - - LSFM 두 규범적인 구현으로 제공하고 기존의 방법에 비해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다 : (I) 고유의 광학 절편 기능, (ⅱ) 좋은 축 해상도, (Ⅲ) 광 표백 강하게 감소 레벨 (IV)의 매우 낮은 광 독성, (V)이 높은 신호대 잡음비 (VI)의 비교적 높은 수집 속도 (VII) 이미징 여러 방향 및 (VI 함께낮아서 개구 조사 대물 렌즈 (54), (55), (56)의 사용과 ⅱ) 깊은 조직 침투. LSFM 이미 성공적으로 거의 전체 배아 형태 형성 57을 기록하고 지느러미 폐쇄 (23)의 시작 부분에 여분의 배아 막 파열의 원칙을 분석 Tribolium에 적용되었습니다. 현미경은 편의성 될 곳은 표준 운영 절차를 수립하고, 방법, 프로토콜과 수준으로 자원의 풀을 개선하기 위해 매우 중요하다의 Tribolium 지역 사회와 일반 곤충 과학에 대한 LSFM의 매력을 높이려면 발달 생물학 실험실에서 표준 도구를 -USE, 생물학적 질문 관심의 중심에있어. 이 프로토콜은 Tribolium의 기초 &lt;시작/ EM&gt; 재배, 즉 유지 보수, 복제 및 배아 수집. 다음으로, 두 실험 전략들이 도시되어있다 : (I) 라이브 주문품 제닉 라인 화상 및 형광 염료 (표 2)으로 염색 하였다 고정 배아 (II) 촬상. (I) 아가로 오스 컬럼 (II) 아가 반구 및 (iii) 신규 거미줄 보유자 :이어서, 약간 다른 목적 세 실장 기술 상세 (도 3 및 표 3)에 설명되어있다. 이 프로토콜은 다음 LSFM와 데이터 수집 절차를 설명합니다. 이미징 양식 및 주요 고려 사항이 설명되어 있습니다. 마지막으로, 배아 검색 설명한다 기본 데이터 처리를위한 제안을 제공한다. 대표적인 결과, 라이브 영상 데이터 개의 신규 주문 제작 및 글 리아 블루 58 개 트랜스 제닉 라인이 도시되어 있고, 각 촬상 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 또한, 이미지형광 염료의 다양한 염색 고정 배아의 데이터가 표시된다. 토론은 품질 관리, 라이브 이미징 방식의 전류 제한 및 다른 종의 프로토콜의 적응에 초점을 맞추고 있습니다. 프로토콜은 샘플 챔버 통상적 직경 금속, 플라스틱 또는 유리로 만들어진 원통형 요소 표준 시료 홀더 (54), (59), (60)에 대해 회전 가능한 클램프기구가 장착되어 광 시트 계 형광 현미경 작성된 밀리미터 범위이다. 이 프로토콜은 두 규범적인 구현 예 및 SPIM DSLM뿐만 아니라 둘 이상의 조명 및 검출 아암 (61) (62) (63)에 대한 설정에 적합하다. 대표적인 결과는 두 채널의 스펙트럼 데이터를 표시, 녹색 (IL488 nm의 레이저 검출 관통 필터 대역 통과 70분의 607 관통 필터)와 레드 (a 561 nm의 레이저로 조명 검출 대역 통과 50분의 525)하지만, 프로토콜 lumination 서너 스펙트럼 채널로 확장 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>full grain wheat flour</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E+08</td><td>US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td></tr><tr><td>405 fine wheat flour</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E+08</td><td>US: pastry flour, UK: soft flour</td></tr><tr><td>inactive dry yeast</td><td>Flystuff / Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>425044-250ML</td><td>Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td></tr><tr><td>low-melting agarose</td><td>Carl Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Orange Scientific</td><td>4430300</td><td></td></tr><tr><td>glass capillaries, internal &amp;Oslash; 0.46 mm</td><td>Brand GmbH + Co KG</td><td>7087 09</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>57020</td><td>Staining solution preparation is explained in Table 2</td></tr><tr><td>YOYO-1 Iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Staining solution preparation is explained in Table 2</td></tr><tr><td>BOBO-3 Iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B3586</td><td>Staining solution preparation is explained in Table 2</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Staining solution preparation is explained in Table 2</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22283</td><td>Staining solution preparation is explained in Table 2</td></tr><tr><td>sieve, 800 &amp;micro;m mesh size</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-051</td><td></td></tr><tr><td>sieve, 710 &amp;micro;m mesh size</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-050</td><td>for growth medium preparation (step 1.1)</td></tr><tr><td>sieve, 300 &amp;micro;m mesh size</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-040</td><td></td></tr><tr><td>sieve, 250 &amp;micro;m mesh size</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-038</td><td>for egg laying medium preparation (step 1.2)</td></tr><tr><td>glass dish, &amp;Oslash; 100 mm &amp;times; 20 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165102</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer, 100 &amp;micro;m mesh size</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>paint brush, head &amp;Oslash; 2 mm</td><td>VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr><tr><td>syringe, 1.0 mL</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>scintillation vials</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1152-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td></tr><tr><td>n-heptane &amp;ge;99%</td><td>Carl Roth</td><td>8654.1</td><td>Caution: n-heptane is flammable and toxic</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Caution: Trition X-100 is corrosive</td></tr></tbody></table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum 발달 유전학 진화 발생 생물학에서 중요한 곤충 모델 생물이되었다. 광 시트 계 형광 현미경 Tribolium 태아의 관찰은 통상 위드와 공 초점 형광 현미경을 통해 여러 장점을 갖는다. 인해 광 시트 기반 현미경의 고유 특성에 살아있는 검체의 3 개 차원 이미지는 높은 신호대 잡음비로 기록 될 수 있고 상당히 여러 지속 기간 동안 광 탈색뿐만 아니라, 다 방향을 따라 광 독성 감소 일. 방법론 개발 및 지속적인 데이터 증가의 4 년 이상으로, 시간은 Tribolium 지역 사회에서 빛 시트 기술의 사용에 대한뿐만 아니라 곤충 사회에서 큰에서 표준 운영 절차를 수립하는 것이 적절 보인다. 이 프로토콜은 F 적합한 세 실장 기술을 설명또는 다른 목적은, 장기 라이브 영상에 적합한 두 개의 새로운 맞춤형 유전자 변형 Tribolium 라인을 제시 고정 배아의 세포 내 구조 레이블을 다섯 형광 염료를 제안하며, 기록 된 데이터의 적절한 평가를위한 데이터 후 처리에 대한 정보를 제공합니다. 대표 결과 장기 라이브 영상 광학 절편 복수 방향을 따라 동일한 태아의 관찰에 집중한다. 각 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 마지막으로, 프로토콜은 라이브 영상 분석, 전류 제한 및 다른 곤충 종에 설명 된 절차의 적용을위한 품질 관리에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 주로 표준 실험실 장비를 능가 이미징 솔루션을 추구 발달 생물 학자를위한 것입니다. 그것은 개발하고 마이크로을 수정 기술적으로 지향 실험실 / 지역 사회 사이의 격차를하기 위해 지속적인 시도를 촉진방법 론적으로 복사 및 기술 문제에 &#39;플러그 앤 플레이&#39;솔루션을 필요로 생명 과학 연구소 / 사회. 또한, 관심의 중심에 생물학적 질문을 움직이는 공리 접근 방식을 지원합니다.

이 프로토콜은 생활의 형광 이미징 또는 LSFM와 고정 및 스테인드 Tribolium 배아에 대한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 인해 광 표백 광 독성, 그 단면 광학 성능의 직접적인 결과의 낮은 수준으로, LSFM 장기 라이브 영상에 특히 적합하다. 신규 AGOC {} mEmerald ATub&#39;H2B-1 형질 전환 라인은 알파 - 튜 불린 1 촉진제 <sup ...

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Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

10.5K 조회수.  Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS).  광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다. 

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 배아를 위한 개선된 Multiview Light Sheet Microscopy 프로토콜

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 고해상도 멀티뷰 광시트 현미경을 위한 제브라피시 배아 장착 전략 — 이미징 및 이미지 재구성 기법

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

생물학

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드

요약

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