우리는 토론을위한 소프트웨어 개발 및 제레미 Capoulade 특히 올리비에 블랑, 모든 Lenne의 회원들과 버트 랜드 연구소 감사합니다. 우리는 또한 기술 지원 PICsL-IBDM 영상 시설, 특히 클로드 모레티와 브라이스 Detailleur 감사합니다. 이 작품은 (P.-FL 및 VB에) CNRS에서 ATIP의 교부금에 의해 지원되었다, Labex은 (VB에) 사노피 - 아벤티스에서와 부여 (P.-FL 및 VB에) 부여를 알려 드리겠습니다. 우리는 (ANR-10-된 InSb-04-01 &quot;INVESTISSEMENTS D&#39; Avenir에서&quot;를 호출) 직원은 국립 드 라 공들인에서 지원하는 프랑스 바이오 이미징 인프라를 인정합니다.

1. 빛 시트 및 검색 경로 설정 그림 1은 광 설치의 일반적인 방식을 제공합니다. <ol><li> 광학 테이블에 현미경과 레이저를 삽입하고 고정합니다. </li><li> 레이저에게 488 nm의, 561 nm의 해당 이색 거울이 405 nm의 결합. 다이크로 익 미러 후, 레이저 공동 정확하게 정렬되어야한다. 레이저 파장, 다이크로 익 미러, 광학 필터의 선택은 실험에 사용 된 특정 형광 라벨의 흡수 스펙트럼으로부터 결정되는 것에주의. </li><li> 음향 광학 파장 가변 필터 (AOTF)를 놓습니다. AOTF의 주파수 및 전력을 조정하는 공급자 테스트 용지를 사용한다. 잘 맞춰지면 내 PowerMeter 의해 측정, 레이저 파워의 약 90 %의 최대 조정에 전송된다. AOTF 불필요한 만들 수있는 몇 가지 레이저가 완전히 소프트웨어에 의해 제어 할 수 있습니다. </li><li> 배치 및 수정망원경. 망원경은 같거나 조명 대물 렌즈의 배면 개구의 직경보다 큰 폭으로 확장 된 빔을 2 개의 렌즈로 구성되어 있습니다. 최소 초점 거리를 가진 렌즈가 먼저 와야한다. </li><li> 장소, 정렬하고 가까운 원통형 렌즈의 뒷면 구멍에 위쪽으로 광학 경로를 데리고 잠망경을 고정합니다. 잠망경의 두 개의 거울은 장축이 완전히 확장 된 빔을 반영하기 위해 미러의 경사에 누워있다 방식으로 장착되어 있습니다. </li><li> 다음 잠망경 출구 원통형 렌즈를 놓습니다. 원통형 렌즈가 한 방향으로 상기 빔을 포커스하고 그에 광 시트를 형성하는 다른 방향으로 평행 나뭇잎 유의. </li><li> 조명 대물 렌즈를 사용하여 얻어진 광 시트를 집중할. 조명 대물의 이미지 초점이 검출 목적의 물체 초점 포인트와 일치한다는 것을주의한다. 빔 프로젝트긴 거리에서 화면 (예 : 벽)에 대한 것입니다. 빛 시트의 화면 날카로운 윤곽을 얻기 위해 조명 빔의 축을 따라 조명의 목적을 이동합니다. </li><li> 현미경 (큐브)에서 예약 된 장소에서 쿼드 라인 (405/488/561/638) 방출 필터를 놓습니다. </li><li> 현미경 출력 포트에 EMCCD 카메라를 놓습니다. </li><li> 현미경 단계에 드릴 구멍에 나사에 의해 현미경 무대에서 첫 번째 매뉴얼 번역의 단계를 수정. 이동 스테이지의 에지가 큐벳이 검출 대물 렌즈 아래를 중심으로되도록 멀리 현미경 스테이지의 중심으로부터 약 2 ㎝에 배치되어야합니다. </li><li> 첫 번째 두 번째 매뉴얼 번역 단계를 수정. 두 단계의 방향 (X 및 Y 번역) 수직해야합니다. </li><li> 앞의 두 단계의 상단에있는 Z 압전 단계를 수정. 동력 스테이지 대신 압전 스테이지 사용될 수 있음을주의한다. </li><li> 큐벳 holde 수정R 스테이지의 상부에 (도 2 참조). 큐벳 따라서 조명 경로의 교차점과 서로 직각이 검출 경로에 배치 될 것이다. </li></ol> 2. 라이트 시트 확인 <ol><li> 형광 용액을 유리 큐벳을 가득 채운 두 개의 광 경로의 교차점에 샘플 홀더에 놓습니다. 빛 시트는 이렇게 볼 수 있습니다. 이는 수평이어야하고, 대칭 / 검출 대물 렌즈 중심에 대하여. </li><li> 원통형 렌즈를 제거하고 광 시트의 두께를 측정하기 위해 화상을 취득. 광 시트의 두께는 조명 대물 렌즈 (NA에 대해 3-4 = 0.3 μM)의 개구 수 (NA)에 의존한다는 것을주의한다. 관련 렌즈 것을 유의 광 시트의 두께는, 슬릿 배면 개구들이 빔의 크기를 감소시킴으로써 증가 될 수있다. 형광 마이크로 스피어는 AX를 측정하는데 사용될 수 있음을 유의현미경의 원점이라 횡 해상도. </li><li> 실험을 시작하기 전에 원통형 렌즈를 다시 넣습니다. </li></ol> 3. C.의 실장 엘레 태아 다음 단계는 (그림 3)됩니다. <ol><li> 10 × 20 ​​× 1 ㎜의 유리 슬라이드의 조각을 잘라 다이아몬드 마킹 펜을 사용합니다. </li><li> 5 % 박토 - 한천을 준비 60 ℃에서 물에 데쳐 및 히터 블록에서 그것을 유지 </li><li> 슬라이드의 절단 된 부분의 한면에 폴리-L-라이신의 50 μl를 추가, 건조시켜야합니다. </li><li> 벤치에 현미경 슬라이드를 삽입하고 고정합니다. </li><li> 고정 슬라이드와 슬라이드의 절단 된 부분을 나란히하고 상단에 녹은 한천의 드롭을 추가합니다. 얇은 한천 패드를 얻기 위해 다른 깨끗한 현미경 슬라이드를 사용하여 한천을 꽉. </li><li> 한천 패드 상단 슬라이드를 제거하기 전에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 약 3mm 오의 과잉을 남겨하기 위해 고정 된 슬라이드의 측면에있는 한천 패드를 잘라F 한천 부드럽게 고정 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 한천에 폴리-L-라이신의 50 μL를 추가하고 완전히 건조 보자. </li><li> 시계 유리에 M9 매체에 임신하는 벌레를 넣습니다. </li><li> 배아를 해제하는 메스와 외음부의 수준에서 벌레를 잘라. </li><li> 양안에서 관심 단계에서 배아를 식별하고 미세 모세관 피펫을 사용하여 그들을 수집. </li><li> 슬라이드의 절단 된 부분에서 돌출 폴리-L-라이신 코팅 한천의 부분에 배아를 놓습니다. 바로 옆에 슬라이드의 경계에 배아를 놓습니다. 그들은 충분히 안정하지 않기 때문에 한천의 국경에서 배아를 배치하지 마십시오. 배아는 폴리-L-라이신 층에 붙어 있도록 조심스럽게 액체를 제거합니다. </li><li> 빠르게 건조를 방지하기 위해 배아를 맞 춥니 다. </li><li> 플라스틱 페트리 접시에 잘라 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 슬라이드를 커버하는 M9 배지를 추가합니다. </li><li> 계란이 여전히 한천에 붙어있는 양안에서 확인하십시오. </리&gt; </ol> C. 4. 기록 엘레 개발 <ol><li> 샘플 홀더의 이전 준비 (컷 슬라이드, 한천 플러스 배아를) 수정하고 큐벳에 배치합니다. 그림 4는 수제 홀더를 설명하고 그림 5는 관측 맥락에서 큐벳의보기를 보여줍니다. </li><li> 압전 무대에 큐벳을 수정. </li><li> 시야 조명 태아의 위치를​​ 확인합니다. </li><li> AOTF, 카메라와 압전 단계를 제어하는​​ 집에서 만든 소프트웨어를 시작합니다. 이러한 마이크로 매니저와 같은 무료 소프트웨어는, 또한 사용할 수 있습니다. </li><li> 레이저 라인 및 전력 (AOTF)를 선택합니다. </li><li> 원통형 렌즈 및 조명용 렌즈를지지하는 세 방향으로 스테이지를 사용하여 광 시트의 위치를​​ 조정한다. 밝은 신호를 얻기 위해 가로 방향 (X)에 따라 단계를 이동합니다. 일을 구하는 다음 광 시트의 Z 위치 및 길이 방향의 위치 (Y)를 조정노이즈 비율 전자 최상의 신호. 빛 시트 초점의 위치가 빛의 경로 길이의 차이를 해결하기 위해 하나의 배아에서 다른 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 타임 랩스 영상을 획득하기 위해, 두 이미지뿐만 아니라, 취득되는 화상의 수와 레이저 파워 사이의 시간을 얻는, 노출 시간을 선택한다. 2 컬러 수집을 위해, 두 번째 레이저 라인을 선택합니다. 두 가지 색상 이​​미지를 연속적으로 획득된다. </li><li> AZ 스택을 획득하려면, 또한 두 조각 사이의 거리, 및 시작과 압전체의 위치를​​ 종료를 선택한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 C의 생체 내 이미징을위한 빛 시트 현미경의 쉬운 설치를 설명 엘레 배아. 레이저, 빔 익스팬더, 시준 및 초점 렌즈를 포함한 광 시트를 생성하고 정렬하기 위해 필요한 광학 소자는 용이하게 광학 벤치에 장착 될 수있다. 검출 경로와 카메라의 직립 현미경과 조합하여,이 설정에 대한 간단한 솔루션 가벼운 시트 현미경을 제공합니다. 이 형상은 샘플 환경이 간단하게. 살아있는 표본이 개최 위치 및 기계 조각의 작은 집합으로 이동 유리 큐벳에 배치됩니다. 시트 조명 현미경 능력을 가진 절편 넓은 분야의 기술이기 때문에, 단지 하나의 축 동력 이동은 3D 이미징을 위해 요구된다. 이것은 단일 스캔 소자에 동기화 요건을 제한하고, 소프트웨어 개발을 용이하게한다. iSPIM 6 우리의 수직 지오에 비해RY는 검출 용 고 NA 대물 렌즈의 사용을 허용한다. 수평면에서 대물 렌즈와 SPIM 셋업에 비해 샘플의 장착 및 배아의 일련의 이미징은 쉽다. 전부,이 기술의 구현은 간단하고 광학에 약간의 전문 지식을 얻을 수 있습니다. 이것은 더 빠른 속도와 더 감소 광독성하지만 낮은 축 해상도의 단점의 장점과 공 초점 현미경에 싼 대안이다. 우리는 또한 C.를 탑재 할 수있는 쉽고 재현성있는 방법을 개발 이 시스템을 사용하여 생체 내 이미징을위한 엘레 간스의 배아. 설치 절차는 빠르게 (15 분) 일상 실험에 적합합니다. C.에 대한 엘레 영상, 간단한 설치의 장점은 적어도 두 겹이다 : 토토 이미징 (i)는 회전하지 않고 가능하기 때문에 3D 재건은 간단합니다; (II) 샘플 설치가 용이하고 여러 개의 배아는 순차적으로 이미지화 할 수있다같은 슬라이드에. 우리는 세포 분열과 세포 모양의 변화를 관찰 할 수있는 충분한 시간 분해능과 시간 경과 영화의 예를 보여 주었다. C.을 연구하는 빛 시트 현미경의 힘 elegans의 개발도 최근 다른 6, 7, 8에 의해 설명되었다. 따라서,이 기술은 C.의 형태 형성 및 패터닝을 연구하는 것은 매우 유용 할 것이다 elegans의 배아. 이 시스템은 또한 다른 모델 생물의 발달을 분석하는 데 사용할 수 있습니까? 그것은 인식하는 것이 중요하다되도록 C. 작은 투명 유기체 시트 조명 현미경의 구현 엘레은 Drosophila의 배아와 같은 큰 생물보다 덜 엄격하다. 초파리의 토토 영상에서 일반적으로 회전 및 멀티 뷰 복원 9, 10. 선상 여기 대물 렌즈와 두 가지 측면에서 흥분도 attenuat에 의한 그림자 효과를 감소 할 수 있습니다 필요합니다빛 (11)의 이온. 그러나, 여기에 제시된 설정은 여전히 낮은 표백과 낮은 photoxicity으로, 초파리 배아의 이미지를 한쪽으로 구성된다. 이 설정은 또한 멍게 또는 제브라 피쉬와 같은 이미지를 작은 투명 배아에 도움이 될 수 있습니다.

유기체의 형성과 형성 세포의 움직임, 세포 모양의 변화, 세포 분열과 세포 분화를 포함한다. 이러한 프로세스의 진행과 조정을 이해하는 세 가지 차원으로 기능과 세포 내 해상도와 빠른 이미징 도구가 필요합니다. 이러한 생체 내 이미징 기능과 기술 사이, 빛 시트 조명 현미경은 단일 / 선택적 비행기 조명 현미경이라고 저 광독성 효과 및 1,2 낮은 photobleaching에 생산의 고유 한 장점이있다. 시트 조명 현미경에서 시료를 광학 단면 처리를 행하는 광 시트에 의해 측으로부터 조명된다. 조명 경로와 검출 경로는 서로 수직 및 광 시트는 검출 대물 렌즈의 물체 초점면과 일치하도록 정렬된다. 샘플은 두 경로의 교차점에 배치된다ND 3D 이미징을 허용하도록 검출 축을 따라 이동 될 수있다. 또한 남은 평면은 조명되고,이 평면의 모든 포인트가 동시에 검출된다. 이것은 상당히 수집 속도를 증가시키고 공 초점 현미경 (3)에 비해 광표백뿐만 아니라 광독성을 감소시킨다. 이 차원 화상에 대해, 제공된 스캔 탐지 부분은 없으며, 조명 부분은 어느 것도 필요하지 않다; : 실용 시트 조명 현미경 설정 및 정렬하기 쉬운 기능 구획으로 광 시야 기술로서, 3 차원 화상은 샘플을 잡고 스테이지의 하나의 축 이동에 의해 얻어 질 수있다. 여기에서 우리는 C의 토토 영상에 대한 간단한 빛 시트 현미경과 그 구현의 설정까지 제시 elegans의 배아. C. 엘레 배아 잘 생체 IMA 살고 적합투명도로 인해 ging를, 불변의 혈통과 셀에 박힌 4,5를 배치합니다. 개발 된 광 시트 설치가 검출을위한 표준 직립 현미경을 기반으로합니다. 아래에 제시 프로토콜을 구축하고 정렬 여기 모듈 / 경로, 테스트 및 빛 시트의 특성과 3D 영상의 샘플을 장착하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 또한 형광 마커를 표현하는 다양한 균주의 설정과 획득 시간 경과 영화의 예를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

빠른 속도와 낮은 광독성 이미징 기술은 토토의 유기체의 발달을 연구하는 전제 조건이다. 세포 내 해상도로 3D 영상을 제공하면서 빛 시트 기반 현미경, 사진 표백 및 공 초점 현미경에 비해 광독성 효과를 감소시킨다. 여기에 우리가 직립 현미경과 빛 시트의 생성을위한 광 - 기계 요소의 작은 집합으로 구성되어 가벼운 시트 기반의 현미경의 설정을 제시한다. 이 프로토콜은, 빌드 현미경을 정렬하고 빛 시트의 특성을하는 방법에 대해 설명합니다. 또, C. TOTO의 이미징에 대한 방법을 구현하는 방법을 상세 elegans의 간단한 관찰 챔버를 이용하여 배아. 이 방법은 개발의 몇 시간 이상 3D 두 색상 시간 경과 영화를 캡처 할 수 있습니다. 이 기능은 장시간 세포의 모양, 세포 분열 및 태그 단백질의 추적을 용이하게한다.

세 가지 다른 C.로부터 3 3D 시간 경과 기록 실험 엘레 균주는 상술 광 시트 현미경 설정을 사용하여 획득 될 수있는 데이터의 종류를 나타낸다. 우리는 이러한 조건에서 배아 SPIM 이미징 C.에서만 광독성 낮은 수준의 원인을 나타내는 이전 보고서와 일치, 정상 속도로 개발하고 영상 살아남을 것을 확인 엘레 6,7 배아. 첫 번째 변형 GFP (; stIs10024 zuIs178)에 융합 히스톤을 표현한다. 기록마다 37 초 촬영 20 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 더미를 가진 2 시간 동안 실시 하였다. 6가 서로 다른 시점에서 스택의 한면을 보여줍니다 그림. 두 interphasic 핵 (화살표)과 농축 유사 분열 염색질 (화살표 머리)를 명확하게 볼 수 있습니다. 두 번째 변형 GFP (ruIs57)에 융합 튜 불린과 히스톤을 표현mCherry (; stIs10226 itIs37)에 융합. 기록마다 105 초 촬영 20 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 스택과 함께 16 분 동안 수행 하였다. 7 스택과 다른 시점의 서로 다른면을 보여줍니다 그림. 관련 영화 1 표시 3 연속 시점에서 복원을 3D로. 분열 동안, 유사 분열 스핀들 (그린) 및 응축 염색체 (레드) 깨끗이 발달 동안 세포 분열 방향의 추적을 허용하는 표시이다. 세 번째 변형 GFP (pwIs23)에 융합 아포 지단백 VIT-2를 표현하고 mCherry (ltIs44) 바인딩 막. 기록이 매 30 초 촬영 10 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리)의 스택과 함께 25 분 동안 수행 하였다. 8 스택과 다른 시점의 서로 다른면을 보여줍니다 그림. 세포 내에서 노른자 지방 단백질 입자 (녹색)의 빠른 이동을 쉽게 할 수 있습니다다음. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 : 조명 및 검출 장치, 전면과 바닥 전체로 구성 SPIM 광 설치. 조명 유닛에서는, 다이크로 익 미러에 의해 결합 된 레이저는 각각 독립적으로, 레이저의 파워를 제어 AOTF를 입력한다. 이어서, 망원경은 4 배에 의해 빔의 크기를 증가시키고, 잠망경 현미경의 높이로 가져온다. 원통형 렌즈는 조명 목적으로 재 집중되는 광 시트를 형성한다. 검출부는 직립 현미경에 통합되어 있으며, 주로 검출 렌즈, 필터, 튜브 렌즈와 EMCCD 의해 구성된다. 샘플은 조명 및 검출 경로 사이의 교차점에 위치된다. 압전 단계 수있는 샘플의 수직 (Z) 변위3D 획득을위한. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 큐벳 홀더 홀더는 3 알루미늄 플레이트로 구성되어 있으며, 압전 무대에 나사 결합된다. 유리 베트는 (빨간색) 스프링에 의해 유지된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3 : C. 실장 프로토콜 SPIM의 실험 elegans의 배아. 유리의 절단 된 부분은 폴리-L-라이신으로 코팅되어 있습니다. 한천의 패드는 코팅 표면 상에 위치된다. 폴리-L-라이신은 다음 한천 패드에 추가됩니다. 마지막으로, C. 엘레 배아는 폴리-L-라이신 코팅 한천 패드에 정렬됩니다. 그림 4 : 샘플 홀더. 홀더 유리 큐벳의 내부 크기에 적합하다. (빨간색) 두 개의 스프링 (그림 3 참조) 유리 슬라이드를 개최합니다. 이 홀더는 다음 유리 큐벳 안에 넣을 수 있습니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> 도 5 :... 샘플 홀더가 관찰 컨텍스트에서 배아 프로토콜이도 3에 요약에 따른 유리 슬라이드에 고정화 슬라이드가도 4에 설명 된 샘플 홀더에 의해 유지되는 샘플 홀더 유리 큐벳에 삽입되어, 그림 2에 설명 된 홀더에 의해 개최. 빛 시트는 내가 수평 및측면에서 배아를 lluminates. 피검 렌즈를 샘플 위에 수직이다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6 : C.의 기록 히스톤 :: GFP 융합을 표현 elegans의 배아 유전자 변형 배아의 단일 평면 이미지 히스톤 :: GFP 융합 (zuIs178; stIs10024) 표현하는 서로 다른 시간 지점에서를 3D 시간 경과 기록에서 추출한 이미지 :.. 20 조각 (만든 스택 조각 1 μm의 사이의 거리); 조각 당 노출 시간 : 30 밀리 초; 스택 사이의 시간 간격 : 37 초; 총 수집 시간 : 2 시간. 화살표 : interphasic 핵, 화살표 머리 : 응축 유사 분열 염색질. t = 0 분에서 배아는 2 세포 단계에 있으며, 정상 발달의에서 예상대로 t에서 = 120 분 배아는 70 셀이(하나의 평면에 포함 된 유일한 세포가 배아의 모든 세포가 아닌 그림에서 볼 수 있으며주의) 오줌. 조명의 전력 (조명 목적의 출구에서 측정) 488 nm에서 30 μW했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7 : C.의 기록 엘레의 튜 블린 :: GFP 융합을 표현 배아와 히스톤 :: mCherry 융합. C.의 3D 시간 경과 기록에서 추출한 이미지 튜 블린 :: GFP 융합 (ruIs57)와 히스톤 :: mCherry 융합 (; stIs10226 itIs37)을 표현 elegans의 배아. 촬영 조건 : 조각 1 ~ 20 조각 (거리의 스택의 인수μm의) 모든 105 초; 총 수집 시간 : 16 분; 노출 시간 : 각 채널에 대해 200 밀리 초. 패널은 동일한 스택의 10 조각을 보여줍니다. 패널 B는 동일한 슬라이스마다 210 초를 보여줍니다. 조명의 전력 (조명 목적의 출구에서 측정) 각각 488 및 561 nm의 레이저, 30 μW 300 μW했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> 그림 8 : C.의 기록 VIT-2 :: GFP 융합을 표현 elegans의 배아와 C의 3D 시간 경과 기록에서 추출한 막 대상 mCherry. 이미지 엘레 배아 VIT-2 :: GFP 융합을 표현 (PWIS23) 및 막 - 대상 mCherry (ltIs44). 촬영 조건 : 10 조각 (조각 1 μm의 사이의 거리) 매 30 초 스택의 인수; 총 수집 시간 : 25 분; 채널 당 노출 시간 : 200 밀리 초. 패널은 동일한 스택의 제 5 슬라이스를 나타낸다. 패널 B는 동일한 슬라이스마다 30 초를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K 조회수.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아. 

비디오: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.