저자는 원고에 대한 의견에 대한 제프리 파렐, 제임스 가뇽, 제니퍼 버그만에게 감사의 말씀을 전합니다. KWR는 FDAP 분석의 개발 기간 동안 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 활동 프로그램에 의해 지원되었다. 이 작품은 AFS에 NIH로부터 보조금과 독일 연구 재단 (에미 뇌터 프로그램), 막스 플랑크 사회, 오후에 인간 프론티어 과학 프로그램 (경력 개발 상)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. Photoconvertible 퓨전 구축 및 삽입하기 Dechorionated Zebrafish의 배아를 생성 <ol><li> 다음 뮐러 등., 2012 (19)에서와 같이 융합 단백질을 코딩하는 캡핑 된 mRNA를 생성하는 시험 관내 전사를 사용하여, 녹색 대 적색 photoconvertible 단백질 (설명 참조)에 융합 된 관심있는 단백질을 함유하는 기능성 구조체를 생성한다. </li><li> 하나의 세포 단계에서 약 30 제브라 피쉬 배아에서 chorions을 제거하는 프로 나제​​를 사용합니다. 또한, 수동 집게 (28)를 사용하여 배아를 dechorionate. 주 : 태아의 후속 이미징 dechorionated해야합니다. 원하는 경우, 배아는 촬상 직전에, 나중에 융모막 통해 주입하고 dechorionated 수있다. <ol><li> 표준 제브라 피쉬 배아 매체 (19)의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서 프로 나제의 5 ㎎ / ㎖ 원액을 확인합니다. 10 분은 단백질 분해 효소가 분해 할 수 있도록하기 위해 부드럽게 실온에서 솔루션을 바위. 나누어지는 2m-20 ° C에서의 microcentrifuge 튜브에 L과 동결. </li><li> 배아 ~ 8 ml의 배지를 함유 5cm 직경 유리 또는 코팅 된 플라스틱 아가 페트리 접시로 이동 한 세포 단계 배아. 접시에 해동 프로 나제​​ 원액 2 ㎖를 추가하고 5 ~ 10 분 동안 실온에서 품어. </li><li> dechorionated 배아가 파열 될 것 중 하나와 접촉으로, 공기 또는 플라스틱으로 배아를 노출시키지 마십시오. 배아 매체와 200ml의 유리 비커를 입력합니다. 매체에 침수 동안 배양 접시를 기울여 비커에 배아를 전송합니다. </li><li> 배아는 비커의 바닥에 정착 한 후, 다음 비커에 신선한 배아 매체를 부어, 배아 매체의 대부분을 부어. 비커에 쏟아져 매체의 가벼운 소용돌이는 배아가 약화 chorions을 잃게됩니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.4. </li></ol></li><li> 골조 팁 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 아가로 오스 코팅 분사 요리 (29)에 dechorionated 배아를 전송합니다. 불타는피펫 팁은 부상 배아에서 가장자리의 계단 현상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> (그림 1B, 제안 mRNA와 Alexa488 - 덱스 트란 양의 토론 참조) mRNA와 3 kDa의 Alexa488 - 덱스 트란 결합체 (29, 30)을 공동-주입. 분열이 시작되면도의 mRNA의 분포와 형광 염료를 보장하기 위해 셀 (안 노른자)의 중심에 직접 주입한다. 주 : Alexa488 신호는 세포 내 및 세포 외 형광을 구별하기 위해 구획되지 마스크를 생성하기 위해 데이터 분석에서 사용된다. </li><li> 배아 매체 가득 여섯 아니라 플라스틱 접시의 1 ~ 2 % 아가로 오스 코팅 잘로 전송 주입 배아. 배아 늦게 구 단계 31 (약 5 시간 포스트 수정을)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 어둠 속에서 품어. 실체 현미경을 이용하여 배아마다 한 2 시간을 확인하고 사망 한 배아에 의해 생성 된 이물질을 제거합니다. </li></ol> 2. P에 대한 Zebrafish의 배아를 장착거꾸로 공 초점 현미경에 hotoconversion 및 이미지 <ol><li> 1-5 배아 건강을 식별하고, 접시에서 제거 골조 팁 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 실체 현미경을 사용한다. </li><li> 부드럽게 1X Danieau 배아의 매체에 용해 1 % 저 융점 아가로 오스 ~ 1㎖를 함유 마이크로 원심 분리 튜브로 배아를 토출 (도 2a) (자재 목록 참조). 참고 : 아가로 오스 40, 42 ° C 사이의 온도를 가져야한다; 높은 온도는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 일부 아가와 함께 다시 피펫으로 배아를 그립니다. 조심스럽게 유리 바닥 접시 (그림 2B)의 커버 유리 위에 아가로 오스와 배아를 꺼냅니다. 커버 유리의 두께가 공 초점 현미경의 목표와 호환되는지 확인하십시오. <ol><li> 원하는 경우 유리 피펫을 다시 사용합니다. 피펫에서 잔류 아가로 오스를 청소하고 위아래로 빠르게 막힘, 피펫 배아 매체를 방지합니다.다음이 목적을위한 실체 현미경으로 배아 매체의 ~ 5 ml로 가득 15 ML 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 동물 극 (배반)는 커버 유리를 향하도록 위치를 배아 금속 프로브를 사용한다. 아가로 오스 20 ~ 30 초에서 응고하기 때문에 신속하게 작업 할 수 있습니다. 배아 &#39;의 위치를​​ 모니터링하고 아가로 오스 견고 때까지 필요한 재조정 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 배아의 원하는 번호가 장착 될 때까지 반복 2.1-2.4 단계를 반복합니다. 참고 : 일반적인 실험에서, 네 다섯 배아 각을 포함하는 4 개의 아가로 오스 방울은 커버 유리에 쉽게 맞습니다. 약 16 배아는 하나의 이상적인 실험 (그림 2C) 동안 이미지를 만들 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스가 응고되면, 1 배 Danieau의 배아 매체와 유리 바닥 접시를 채운다. </li></ol> 3. Photoconverting 및 Photoconverted 신호의 감소를 측정 25X 또는 40X 물 목표 내가크기와 제브라 피쉬 배아의 굴절률에 적합한이야. 물 여섯 시간 실험의 과정 동안 증발하기 때문에 그것은 수중보다는 실제 물과 같은 굴절률 액침 오일을 사용하는 것이 최선이다. 침지 기름이 물 (석유가 아닌) 목적으로 사용할 수 있도록 설계되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 목적과 커버 유리 사이의 오일 필름 이미징 동안 다른 배아 위치로 무대 이동으로 중단되지 않도록하기 위해 목표에 몰입 오일의 큰 하락을 놓습니다. 요리 할 때 단계 이동을 이동하지 않도록 확실하게 무대에 유리 바닥 접시를 놓습니다. 가능하면 28 ° C, 제브라 피쉬의 개발을위한 최적의 온도에서 가열 단계를 사용합니다. </li><li> 공 초점 현미경의 소프트웨어 패키지의 각 배아의 위치를​​ 정의합니다. 각각의 배아 용 Z-깊이를 조정하고, 각각의 배아 대략 동일 평면을 대상으로 시도한다. 참고 : 약 30 μm의 동물 극에서이 이동입니다배아의 포락 층을​​ 회피 할 수있는이 깊이에서 보낸 외경 깊이 이미징 영역이 극대화되고, 광 산란이 최소이다. ~ 3.3 ㎛의 두께로 슬라이스 한 광은 충분한 데이터를 제공한다; Z-스택 (섹션 5 참조)을 취득 할 필요가 없다. </li><li> 실험 기간 동안 두 개의 신호를 수집 : Alexa488 - 덱스 트란에서 &quot;녹색&quot;신호를 공액-있는이 photoconverted 후 세포 외 및 세포 내 형광 및 융합 단백질에서 &quot;빨간색&quot;신호를 분리하기 위해 데이터 분석시 사용됩니다. <ol><li> 488 nm의 레이저를 사용하여 Alexa488을 자극하고, ~ 500 및 540 nm의 사이에 방출되는 형광을 수집합니다. 참고 : 광 변환 후, 많은 녹색 - 투 - 붉은 photoconvertible 단백질 (예를 들어, Dendra2)는 543 nm의 레이저로 흥분하고 ~ 550 및 650 nm의 사이의 형광을 방출 할 수있다. 사용 photoconvertible 단백질에 따라 필요한 조정합니다. </li></ol></li><li> 취득 &quot;전 광&quot;이미지 및 이미지에 적절한 이미징 조건 (단계 3.2) 이전에 정의 된 각각의 위치를​​ 공 초점 현미경의 소프트웨어를 구성하는 다섯 시간 시간 코스마다 10 또는 20 분 (5 장을보고 토론). </li><li> 융합 단백질을 photoconvert하려면, 2 분 동안 100 %의 출력에서​​ ~ 300-400 nm의 여기 필터와 수은 아크 램프로부터 UV 광에 배아기를 10X 대물 렌즈로 전환 노출. . 균일 한 광을 (5 장 참조) 홍보 z 축에있는 z 포커스를 이동 침지 오일 광 동안 10 배 목표에 떨어지지 않도록하십시오. 주 : 광 중 포커스의 이동은 실험자 간의 변동을 방지하기 위해 자동화 될 수있다. </li><li> 바로 광 변환 한 후 다시 25 배 또는 40 배 목표로 전환합니다. 단계 3.2에서 이전에 정의 된 위치가 여전히 정확한지 확인하십시오. 요리 photoconv 동안 이동하는 경우ersion, 태아의 위치를​​ 다시-정의합니다. <ol><li> 3.4 단계에서 만든 프로그램을 시작하고 영상 5 시간 동안 계속 할 수 있습니다. 광 및 각각의 배아에 대한 영상의 시작 사이에 경과 된 시간을합니다. </li></ol></li><li> 때때로 실험에서 확인합니다. Danieau의 매체의 수준을 모니터링하고 필요하면 더 추가 할 수 있습니다. 이 멈춘 경우 소프트웨어를 다시 시작합니다. </li><li> 지수 감소 모델의 점근선을 추정 데이터 분석에서 사용되는 배경 형광 값을 결정하기 위해, 실험 Alexa488 덱스 트란 아니라 mRNA를 주입 한 배아 일부를 포함한다. 후속 데이터 분석에서 사용되는 기기 노이즈를 측정하기 위해, 샘플의 부재하에 화상을 취득. </li></ol> 4. PyFDAP를 사용하여 데이터를 분석 <ol><li> 시각 각 배아 시간 코스 데이터 세트를 검사한다. IMAG 중 사망 한 배아에서 데이터 세트를 폐기photoconverted 신호의 매우 낮은 수준, 또는 그 특이한 모양과 이동 (부상 또는 병 배아의 일반) 분할 중지 세포의 영역을 포함하는 상당히 이동 ING,,. 참고 : 때때로, 침지 오일에 기포 나 다른 유물 그렇지 않으면 사용할 수있는 데이터 세트에 하나 또는 두 개의 이미지에 표시됩니다. 아티팩트를 포함하는 모든 이미지를 참고; 나중에는 폐기 될 것이며, 이러한 데이터 세트로부터 남은 시점 ​​여전히 분석 될 수있다. </li><li> FDAP 데이터를 분석하는 파이썬 기반의 소프트웨어 패키지 PyFDAP을 사용합니다. PyFDAP 각 화상의 평균 세포 내 및 세포 외 적색 형광 강도를 결정하고, 지수 감소 함수 (56) (도 3)로 데이터를 끼워 맞춤으로써 반감기를 계산한다. <ol><li> PyFDAP 다운로드 (참조 재료 목록). </li><li> 사용 PyFDAP 세포 내와 세포 외 photoconverted 신호 (그림 3A를, B)로 구분합니다. 우리세포 내 마스크를 만들기 위해 엄격 세포이다 Alexa488 신호를, 예. 평균 세포 외 농도를 계산할 때 고려되는 세포 내 픽셀을 방지하기 위해 해당 빨강 채널 이미지에이 마스크를 적용합니다. 평균 세포 내 농도를 측정하기 위해, 마스크를 반전. </li><li> PyFDAP, 단계 4.2.2에서 생성 된 마스크 화상을 표시. 시각적으로 이러한 이미지를 검사하고 마스크 정확하게 세포 외 공간에서 세포 내 (이 드문되어야 구별하지 않은 데이터 세트를 폐기, 즉 세포막은 세포 외 공간 마스킹되어있는 이미지에 포함되어 참고하지만 이들은 임계 값을 변경함으로써 제거 될 수 알고리즘 또는 멤브레인 마스크를 도입하여 (예를 들어, 사용하는 막 - CFP)). 또한 단계 4.1에서 확인 된 유물 (예, 침지 기름에 거품)를 포함하는 단일 이미지를 버린다. </li><li> EAC 평균 세포 외 및 세포 내 형광 강도를 계산하는 PyFDAP를 사용하여시간 이미지. PyFDAP 합산은 픽셀들의 총 개수에 의해 마스크 및 분할 벗어나는 픽셀의 휘도를 합산하여 이들의 평균을 계산한다. </li><li> 다음과 같은 지수 함수와 형광 데이터 (그림 3C)를 장착 : <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> t 시간 후의 광, C (t) t의 주어진 값에서의 강도는이고, C 0 t = 0에서의 강도이고, k는 제거율 상수이며 Y 0 함수가 형광으로 접근 점근선 감소한다 (도 1D). Y는 0 3.8 19 단계에서 측정에 기초하여 제한 될 수있다. </li><li> 다음의 관계를 이용하여 제거율 상수 (K)에서 세포 외 및 세포 내 단백질 반감기 (τ)을 계산하기 위해 사용 PyFDAP : <img fo:contENT 폭 = &quot;1 인치&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot;폭 = &quot;153&quot;/&gt; </li></ol></li></ol> 5. 제어 실험 광표백, 부주의 광 및 광 균일 성을 평가하기 위해 <ol><li> 평가 광표백 주 : 광표백 관심 단백질의 간극 이외에 형광 단백질의 표백 특성을 반영 형광 강도에 인공적 저하 될 수있다. <ol><li> 가능한 광표백을 평가 이미징 및 영상 사이에 ​​20 분 간격 (그림 4)와 두 번째 세트 사이에 10 분 간격으로 FDAP 실험 한 세트를 수행합니다. 4 절에 설명 된 실험을 이용 PyFDAP 세트 모두로부터의 데이터를 분석한다. </li><li> 도 10 및 20 분 간격 실험에서 반감기 비교. 긴 반감기가 20 분 간격 실험에서 상당한 광표백을 나타냅니다. 두 실험에서 반감기가 동일한 경우, PHOTobleaching는 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 또한, 즉시 광 후 ~ 30 일련의 이미지를 획득하여 photobleaching에 평가합니다. 형광 강도의 유의 한 감소는 상당한 광표백을 나타냅니다. </li><li> 광표백가 검출되었을 경우, 낮은 파워의 레이저를 사용하여 촬상 시간을 단축하거나, 더욱 광 안정성 photoconvertible 단백질 (32)을 사용하는 것을 고려. </li></ol></li><li> 실수로 광을 평가. 참고 : Dendra2는 488 nm의 조명 (27)를 사용하여 photoconverted 수 있습니다. 488 nm의 레이저로 Alexa488이 흥미 관심 단백질의 겉보기 반감기의 단계 3.3.1, 부주의 광 따라서 인공적 증가하는 경우에 기재된 바와 같이 가능하다. 그러나, 우리와 다른 사람 (33)는 488 nm의 조명은 제브라 피쉬 배아의 광 변환의 비효율적 인 방법이다 것을 발견했다. <ol><li> 부주의 한 광을 검출하는 단계 5.1.1에서 설명 대조 실험을 사용하여. 도 10 및 20 분 간격 실험에서 반감기 비교. 20 분 간격 실험에서 짧은 반감기는 중요한 실수로 광을 나타냅니다. 두 실험에서 반감기가 동일한 경우, 부주의 한 광은 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 부주의 한 광이 검출되면, Dendra2 photoconverting 실수를 방지하기 위해 낮은 488 nm의 레이저 출력과 짧은 촬상 시간을 사용한다. </li></ol></li><li> 광 균일 성을 평가. 주 : 광이 동물의 배아 극 치우쳐있는 경우, 형광의 감소가 깊은 평면 (도 5a)로 단백질 또는 세포의 확산 이동에 의해 영향을 받는다. <ol><li> 광이 균​​일 여부를 확인하려면, (세포 융합 단백질과 실험) 분비 photoconvertible 단백질 또는 (세포 융합 단백질과 실험) 세포질 photoconvertible 단백질을 발현. 평소와 같이 Photoconvert, t암탉은 80 분마다 20 분 배반 엽의 대부분을 포괄 Z-스택을 획득. </li><li> 광은 동물 극 치우쳐 있으면 깊이 평면에서 형광 강도 때문에 확산 또는 세포 이동 (도 5b)에 시간에 따라 증가 할 것이다. 불균일 한 광이 검출되면, 광 동안 배아을 깊은 초점. </li></ol></li></ol>

저자는 공개 충돌이 전혀 없습니다.

FDAP 실험의 성공은 기능 photoconvertible 융합 단백질의 생성에 의존한다. 단백질에 태그를 자사의 생물학적 활성 및 / 또는 현지화, 용해도, 안정성 36-41을 포함한 생물 물리학 적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 활성 하나를 찾기 위해 여러 가지 융합 구조의 활동을 테스트 할 준비를하십시오. 발명자들은 관심 단백질 photoconvertible 단백질의 위치를 변경하거나 긴 링커를 사용하여 (예를 ?...

세포와 생물의 단백질의 수준은 생산 및 통관 자신의 속도에 의해 결정됩니다. 단백질의 반감기는 분에서 일 1-4까지를 범위로 할 수 있습니다. 많은 생물학적 시스템에서 키 단백질의 안정화 또는 통관 세포 활성에 중요한 영향을 미친다. 세포 내 단백질 안정성의 조절은 세포주기 진행 5,6- 발달 시그널링 7-9, 아폽토시스 (10), 정상 기능의 유지 뉴런 11,12 요구된다. 세포 외 단백질의 안정성은 조직 내 분포 및 morphogens 13, 14 등의 분비 단백질의 가용성에 영향을 미친다. 지난 몇 년 동안, 단백질의 안정성은 주로 방사성 펄스 라벨 또는 사이클로 헥 체이스 실험 (15)를 사용하여 세포 배양에서 평가되고있다. 이러한 펄스 추적 실험에서, 세포 중 방사능 일시적 아미노 &quot;펄스&quot;에 노출 될산 전구체 새롭게 합성 된 단백질에 통합하거나 단백질 합성을 저해 사이클로 헥시에 노출되어있다. 배양 된 세포를 상이한 시점에서 수집하고, 어느 (방사성 펄스 추적 실험에서) 오토 라디오이어서 면역 또는 (사이클로 헥 실험에서) 웨스턴 블로 팅은 시간이 지남에 따라 단백질의 클리어런스를 정량화하는데 사용된다. 기존의 단백질 안정성 분석은 몇 가지 단점을 가지고있다. 우선, 단백질의 분석 방법은 종종 그의 내인성 환경에서 발현되지 않고, 다른 종으로부터의 세포 조직 배양에서 때로는. 그 안정성 문맥 의존적 인 단백질이 방법은 문제가있다. 둘째, 시간이 지남에 따라 각각의 세포 또는 생물체 단백질 클리어런스를 수행하는 것이 불가능하고, 상기 분석으로부터의 데이터는 상이한 시점에서 상이한 세포의 집단의 평균을 반영한다. 각각의 세포는 시작 할 수 있기 때문에단백질의 다른 양, 서로 다른 시간에 방사성 라벨 또는 사이클로 헥를 촬영했거나 다른 통관 반응 속도 등의 데이터를 집계 오해의 소지가있을 수있을 수 있습니다. 마지막으로, 사이클로 헥 체이스 실험의 경우, 단백질 합성 억제제의 첨가는 인위적으로 단백질의 안정성을 바꿀 수 16-18 의도하지 않은 생리 학적 효과를 가질 수있다. 이러한 단점은, 광 (FDAP) 후 photoconvertible 단백질이 생물에게 19-25 생활에 동적으로 단백질의 간격을 측정하기 위해 활용하는 기술을 형광 붕괴를 사용하여 방지 할 수 있습니다 (FDAP 기술의 한계에 대한 토론 참조). Photoconvertible 단백질은 그 여기 및 방출 특성 빛 (26)의 특정 파장에 노출 된 후 변경 형광 단백질이다. 하나는 일반적으로 사용되는 변형 Dendra2, 처음에 전을 가진 &quot;녹색 - 투 - 빨간색&quot;photoconvertible 단백질이다표창장 및 배출 녹색 형광 단백질 유사한 특성,하지만 UV 라이트 - &quot;광&quot;에 노출 된 후 여기를 왔나은 / 방출 특성은 적색 형광 단백질 (23,27)와 유사하게된다. 중요한 것은, 광 변환 후 생성 된 새로운 단백질은 photoconverted 단백질 만 풀의 광에 따라 생산 및 통관의 디커플링과 관찰을 허용, photoconverted 단백질과 동일한 여기 / 방출 특성이 없습니다. photoconvertible 단백질과 관심의 단백질에 태그를 지정하는 것은 따라서 펄스 ​​레이블하는 그대로, 광학적으로 접근 생물체의 단백질을 수있는 편리한 방법을 제공합니다. FDAP 분석법 (도 1a)에있어서, 목적 단백질은 단백질 photoconvertible 태그로되어 생체 (도 1b)로 표현. 융합 단백질 photoconverted되며, 시간이 지남에 photoconverted 신호의 감소는 fluorescen에 의해 모니터링CE 현미경 (그림 1C). 데이터는 융합 단백질 (도 1D)의 반감기를 측정하기 위하여 적절한 모델이 장착된다. 여기에 설명 FDAP 분석은 19 초 동안 배아 제브라 피쉬 배아 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 반감기를 결정하도록 고안되었다. 그러나, 이러한 접근 방식은 라이브 영상을 견뎌, 어떤 taggable 세포 내 또는 세포 외 단백질의 간격을 모니터링하는 데 이용 될 수있는 투명한 모델 생물에 적용 할 수있다. 여기에 설명 된 기술의 변화는 배양 세포 20,23 초파리 (22)와 마우스 (21) 배아에서 수행되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

단백질 안정성은 생물학의 여러 측면에 영향을 미친다, 단백질의 클리어런스 동역학을 측정하는 중요한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. FDAP 실험에서 생체 내에서 단백질의 클리어런스를 측정 할 수있다. 관심있는 단백질은 형광 단백질 photoconvertible 태그로 생체 내에서 발현시키고 photoconverted하고 시간의 photoconverted 신호의 감소를 모니터한다. 데이터는 단백질의 반감기를 결정하는 적절한 클리어런스 모델 붙인다. 중요하게는, 다른 생물체의 구획 단백질 집단의 동력학 클리어런스는 구획되지 마스크를 적용함으로써 별도로 검사 할 수있다. 이 접근법은 제브라 개발 중에 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 및 세포 내 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 FDAP 실험을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 간극의 역학을 결정할 FDAP을 사용하는 것이 가능해야광학적으로 접근 유기체의 모든 taggable 단백질.

FDAP 지브라 피쉬 19 배아 세포 외 신호 전달 단백질의 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 이들 단백질 중 하나 퀸트가 배아 발생 동안 34 mesendodermal 유전자의 발현을 유도한다. 곁눈질-Dendra2가 QRT-PCR에 의해 현장 하이브리드 분석 (19)에서 입증 된 바와 같이, 태그가 곁눈질 비슷한 수준에서 mesendodermal 유전자의 발현을 활성화합니다. 배아 Alexa488 덱스 트란 및 mRNA...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K 조회수.  Harvard University.  세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다. 

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Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

연구

발생학

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...